第七章基因工程重組體克隆的篩選和鑒定ppt課件

1、第七章 重組體克隆的挑選和鑒定一、抗藥性標(biāo)志及其插入失活選擇法pBR322質(zhì)粒上有兩個抗菌素抗性基因: Tetr和Ampr。 Tetr上有插入位點(diǎn)BamH I和Sal I; Ampr上有插入位點(diǎn)Pst I。第一節(jié) 載體表型選擇法1. 原理：pBR3221四環(huán)素：2氨芐青霉素抗性基因：2. pBR322抗菌素標(biāo)志選擇產(chǎn)生-內(nèi)酰胺酶，使氨芐青霉素轉(zhuǎn)變?yōu)榍嗝雇幔沟?青霉素指示液I2-KI-Aampicillin藍(lán)灰色褪色。抑制細(xì)菌生長，但不殺死細(xì)菌。殺死生長的細(xì)菌，但不殺死停頓生長的細(xì)菌。3環(huán)絲氨酸：3. 選擇過程：假設(shè)在Tetr上插入外源DNA，導(dǎo)致四環(huán)素抗性基因失活，可用四環(huán)素加環(huán)絲氨酸平板

2、培育基選擇重組克隆。Tetr失活的菌生長被四環(huán)素抑制，不被環(huán)絲氨酸殺死，保管下來； Tetr不失活的菌抗四環(huán)素，能分裂生長，反而被環(huán)絲氨酸殺死。1四環(huán)素抗性插入失活無環(huán)絲氨酸培育基2氨芐青霉素抗性插入失活選擇過程假設(shè)Ampr上插入外源DNA，導(dǎo)致氨芐青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液選擇。也可以用含青霉素的培育基直接挑選。青霉素分子不耗費(fèi)碘，其降解產(chǎn)物青霉酮酸耗費(fèi)碘，因此可根據(jù)碘的顯色反響確定氨芐青霉素抗性基因能否失活。藍(lán)色 碘沒有耗費(fèi) 青霉素沒降解 陽性克隆抗藥性標(biāo)志選擇應(yīng)留意的問題抗藥性標(biāo)志選擇假設(shè)用藥物直接挑選，察看和確定轉(zhuǎn)化子菌落的培育時間不宜過長，以1216小時為宜，否那么會出

3、現(xiàn)假陽性轉(zhuǎn)化子菌落。由于轉(zhuǎn)化子菌落會降解選擇藥物，導(dǎo)致非陽性轉(zhuǎn)化子菌落周圍選擇藥物濃度降低。二、-半乳糖苷酶顯色反響選擇法-半乳糖苷酶 乳糖半乳糖葡萄糖Xgal半乳糖5-溴-4-氯靛藍(lán)+深藍(lán)色1. 原理：載體上有一段-半乳糖苷酶基因Lac Z的片段氨基端，其上有外源DNA的插入位點(diǎn)。 受體菌基因組中有突變的-半乳糖苷酶基因 片段缺失?？梢员籌PTG誘導(dǎo)表達(dá)。 載體和受體菌基因組可以互補(bǔ)構(gòu)成完好有功能的-半乳糖苷酶。2. 選擇過程-半乳糖苷酶使Xgal分解成蘭色產(chǎn)物。利用插入的外源基因的表達(dá)產(chǎn)物特性進(jìn)展直接選擇。只在特定條件下。轉(zhuǎn)化進(jìn)來的外源基因產(chǎn)物可以彌補(bǔ)受體菌株的突變型缺陷。一、原理：第二節(jié)

4、 根據(jù)插入基因的表型選擇1.彌補(bǔ)缺陷his-his+受體菌：外源基因：在不含組氨酸的培育基中生長小鼠的二輕葉酸復(fù)原酶DHFR對三甲氧芐二氨嘧啶有抗性。DHFR載體銜接轉(zhuǎn)化受體菌三甲氧芐二氨嘧啶培育基平板含DHFR的克隆才干生長例：使被轉(zhuǎn)化的受體菌表現(xiàn)出外源基因的表型。2. 添加新性狀利用有插入片段的重組載體的分子量比野生型載體分子量大。一、直接電泳檢測法從轉(zhuǎn)化后的菌體克隆中分別質(zhì)粒，電泳、比較其分子量。第三節(jié) DNA電泳檢測法 分子量 Marker載體重組克隆二、酶切電泳挑選法1. 原理：根據(jù)知的外源DNA序列的限制性酶切圖譜，選擇一兩種內(nèi)切酶切割質(zhì)粒，電泳后比較電泳結(jié)果DNA帶數(shù)和長度。或用

5、適宜的內(nèi)切酶切下插入片段，再用其它酶切這個片段，電泳后比較結(jié)果能否符合估計(jì)的結(jié)果。ABA或B不同克隆的酶切結(jié)果插入片段三、PCR擴(kuò)增檢測法1. 原理PCR能在模板序列上擴(kuò)增出預(yù)期DNA片段。2. 過程1從重組克隆中提取質(zhì)?；駾NA。2用外源DNA插入片段引物作PCR。3電泳PCR產(chǎn)物。4檢查能否有PCR產(chǎn)物。5PCR產(chǎn)物的長度能否與外源基因一致。1. 核酸雜交第四節(jié) 核酸雜交檢測法 一、原理：重組克隆與探針雜交。3. 識別標(biāo)志32P 或 125I 。1放射性同位素2. 檢測用的探針與外源DNA插入片段互補(bǔ)的序列。2非放射性標(biāo)志熒光素二、核酸雜交檢測方法用DNA或RNA探針檢測DNA樣品。1.

6、Southern blotting從宿主細(xì)胞中提取DNA或質(zhì)粒載體，再用探針雜交。只需帶有插入片段的重組載體才干與探針雜交，在底片上曝光顯示。酶切前酶切后插入片段載體含插入片段插入片段探針雜交結(jié)果Southern blot 挑選結(jié)果1原位雜交挑選特點(diǎn)：對應(yīng)的菌斑或噬菌斑位置不變，可以直接找出陽性菌落。2R-環(huán)檢測法DNA-RNA雜交。2原理：3選擇過程在70%甲酰胺中，把DNA雙鏈變性，復(fù)性的時候，DNA-RNA雜交分子比DNA-DNA雙鏈更穩(wěn)定。電鏡下可見R-環(huán)形構(gòu)造。用外源基因的mRNA與重組載體雜交。1R-環(huán)：R-環(huán)：是指RNA經(jīng)過取代與其序列一致的DNA鏈而與雙鏈DNA雜交，被取代的D

7、NA單鏈與RNA-DNA雜交雙鏈所構(gòu)成的環(huán)狀構(gòu)造。 缺陷：需求電鏡！2. Northern blotting用DNA或RNA探針檢測RNA樣品。主要檢測插入片段能否被轉(zhuǎn)錄。從宿主細(xì)胞中提取RNA，再用探針雜交。利用抗體作為“探針來檢測轉(zhuǎn)入受體菌并且表達(dá)出相應(yīng)的蛋白質(zhì)的外源基因。根據(jù)第一抗體一抗和第二抗體二抗的性質(zhì)可分為幾種作用方式：一、放射性抗體檢測法第五節(jié) 免疫化學(xué)檢測法 1. 抗體與產(chǎn)物的結(jié)合方式對表達(dá)產(chǎn)物的檢測。蛋白蛋白“雜交 待測基因 產(chǎn)物蛋白一抗二抗125I 標(biāo)志的二 抗結(jié)合蛋白固相支持濾膜待測基因 產(chǎn)物蛋白一抗125I標(biāo)志的二抗固相支持濾膜待測基因 產(chǎn)物蛋白一抗固相支持濾膜固相支持

8、濾膜待測基因 產(chǎn)物蛋白一抗二抗125I 標(biāo)志的二抗 結(jié)合蛋白125I標(biāo)志的二抗2. 放射性抗體檢測法過程3. Broome-Gilbert雙位點(diǎn)檢測法質(zhì)?；駻插入基因B表達(dá)質(zhì)粒蛋白A外源蛋白B交融蛋白檢測交融蛋白。既檢測外源基因產(chǎn)物又檢測載體基因產(chǎn)物。固相支 持濾膜抗A抗體125I標(biāo)志的 抗B抗體質(zhì)粒蛋白A外源蛋白B質(zhì)粒蛋白A外源蛋白B固相支 持濾膜抗A抗體發(fā)光，底片曝光二、免疫沉淀檢測法把非放射性抗體加到平板培育基中，當(dāng)插入基因的表達(dá)產(chǎn)物被細(xì)菌分泌到菌落周圍時，就會與抗體反響構(gòu)成“沉淀圈。1. 原理抗原抗體 凝集反響。檢測分泌型產(chǎn)物。2. 方法對于不能被分泌到菌體外的蛋白質(zhì)可先進(jìn)展原位溶菌

9、處置溶菌酶、原噬菌體誘發(fā)。三、酶聯(lián)免疫吸附測定ELISAEnzyme-linked immunosorbant(免疫吸收劑)assay1. 原理：一抗primary antibody: 與目的分子的特異結(jié)合。 二抗secondary antibody： 與一抗的特異性結(jié)合。 酶連enzyme-linke： 二抗上攜帶一種酶能催化一種反響將無色的底物轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩奈镔|(zhì)或發(fā)光，再經(jīng)過比色測定有色物質(zhì)的含量或光強(qiáng)度，從而推測目的分子的含量。待測基因 產(chǎn)物蛋白一抗二抗酶 待測基因 產(chǎn)物蛋白一抗二抗無色的底物有色的產(chǎn)物比色察看酶 2. ELISA檢測的普通步驟1固定樣品將待測樣品參與96孔微量滴定板mic

10、rotiter plate的孔中，枯燥后就被固定在孔底?？椎讌⑴c一抗，反響后沖洗掉未結(jié)合的抗體。2一抗結(jié)合一抗參與二抗，與一抗結(jié)合后再將未結(jié)合的二抗沖洗掉。二抗只識別一抗。二抗上聯(lián)著一種酶堿性磷酸酶、過氧化物酶、脲酶等。3二抗結(jié)合二抗參與無色的底物，被二抗上所帶的酶催化反響轉(zhuǎn)變成有色物質(zhì)或發(fā)光。4顯色反響在特殊的分光光度儀酶標(biāo)儀上比色，打印出結(jié)果。5比色3.ELISA的局限性有效，但準(zhǔn)確性稍差主要取決于一抗的特異性。 必需與其他方法一同綜合思索。最好用單克隆抗體monoclonal antibody:由單一B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的高度均一、僅針對某一特定抗原表位的抗體。臨床檢驗(yàn)常用的單抗四、免疫印跡w

11、estern blotting法1.原理：在蛋白質(zhì)凝膠電泳以后，用轉(zhuǎn)膜和免疫的方法檢測膠上的蛋白質(zhì)泳帶。1SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 是蛋白質(zhì)的變性劑，使煮沸變性的蛋白質(zhì)維持線性形狀，并與蛋白質(zhì)結(jié)合，使蛋白質(zhì)帶上負(fù)電荷。 SDS:SDS： 聚丙烯酰胺凝膠電泳PAGE：Polyacrylamide gel electrophoresis在電場的作用下線性蛋白質(zhì)鏈在聚丙烯酰胺凝膠介質(zhì)中向正極挪動，挪動的速率主要取決于其分子量大小鏈的長短，從而把不同分子量的肽鏈分開。電泳buffer電泳buffer點(diǎn)樣電泳方向蛋白質(zhì)電泳的分子量規(guī)范知分子量的蛋白質(zhì)混合液，與待測樣品一同電泳，為樣品蛋白質(zhì)提供分子量估計(jì)

12、。商品化供應(yīng)Da道爾頓(質(zhì)量單位, 等于一氧原子質(zhì)量的十六分之一。 一克約為61023道爾頓Dalton凝膠中的蛋白質(zhì)染色：考馬斯亮藍(lán)： 靈敏度低、只能檢出0.3-1g/帶，但可褪色回收。 硝酸銀： 靈敏度高、可檢出2-5ng/帶。2轉(zhuǎn)到膜上進(jìn)展染色。1直接染色直接染色電泳結(jié)果2Western blotting電泳膠里的蛋白質(zhì)帶可以用電轉(zhuǎn)的方法，轉(zhuǎn)到膜上硝酸纖維素膜、PVDF膜、中性尼龍膜等。 Western轉(zhuǎn)膜膠里的蛋白質(zhì)帶在電場的作用下橫向轉(zhuǎn)移到正極一側(cè)的膜上。膜膠蛋白Western安裝 Blotting原理與ELISA一樣。待測蛋白硝酸纖 維素膜一抗二抗辣根過氧 化物酶底物產(chǎn)物， 并發(fā)出

13、光PAGE膠待測蛋白底片曝光辣根過氧化物酶：HRPO1先用一抗待測蛋白的單克隆抗體與 膜上的蛋白結(jié)合。2洗去未結(jié)合的一抗。3用二抗與一抗結(jié)合二抗上帶有HRPO。4清洗掉未結(jié)合的二抗。5用HRPO的底物浸泡膜。6暗室里曝光，沖洗膠片。 Blotting過程結(jié)果單抗blotting結(jié)果一、無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)第六節(jié) 轉(zhuǎn)譯挑選法 能把外源的mRNA翻譯成蛋白質(zhì)的細(xì)胞提取物。 如：麥胚提取物系統(tǒng)、網(wǎng)織紅細(xì)胞提取物系統(tǒng)。借助無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)，經(jīng)過表達(dá)或抑制所選擇的克隆載體上的外源基因的轉(zhuǎn)錄，來挑選其產(chǎn)物能否符合預(yù)期。適用于mRNA轉(zhuǎn)錄豐度高的外源基因。二、轉(zhuǎn)譯挑選mRNA無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)35S標(biāo)志的 甲硫氨酸翻譯

14、35S標(biāo)志的肽鏈PAGE電泳放射自顯影比較放射性 帶紋的位置載體+外源DNA轉(zhuǎn)錄與預(yù)期的產(chǎn)物分子量相符？三、雜交抑制轉(zhuǎn)譯法mRNA一旦與DNA雜交成RNA-DNA雙鏈后就不能被核糖體翻譯出蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)譯被抑制。單鏈mRNA核糖體 小亞基核糖體 大亞基能翻譯mRNADNA核糖體 小亞基核糖體 大亞基不能翻譯1. 原理2. 過程四、雜交釋放轉(zhuǎn)譯法1. 原理：在高甲酰胺溶液中載體上克隆的cDNA與它的mRNA雜交吸附，然后洗脫，釋放出與它對應(yīng)的mRNA，進(jìn)展體外轉(zhuǎn)錄。 研討其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的性質(zhì)能否是預(yù)期的基因產(chǎn)物如分子量、免疫源性等。2. 過程硝酸纖 維素濾膜載體和插 入的cDNA總mRNAcDNA基因的

15、mRNA雜交洗脫cDNA基因的 mRNA體外翻譯cDNA編碼的蛋白電泳凝膠放射自顯影cDNA編 碼的蛋白硝酸纖 維素濾膜載體和插 入的cDNA硝酸纖 維素濾膜載體和插 入的cDNA搜集35S標(biāo)志的氨基酸專門設(shè)計(jì)檢測能同DNA特異結(jié)合的蛋白質(zhì)因子。待測蛋白質(zhì)硝 酸 纖 維 素 濾 膜能與蛋白質(zhì)結(jié) 合的DNA序列放射性標(biāo)志待測蛋白質(zhì)硝 酸 纖 維 素 濾 膜能與蛋白質(zhì)結(jié) 合的DNA序列放射性標(biāo)志五、DNA-蛋白質(zhì)相互作用挑選法普通克隆與挑選戰(zhàn)略第七節(jié) 幾種常用的真核生物重組基因選擇方法真核細(xì)胞核苷酸的合成需求四氫葉酸提供甲基。二氫葉酸四氫葉酸二氫葉酸復(fù)原酶dihydrofolate reducta

16、se，DHFR一、哺乳動物基因轉(zhuǎn)移的選擇標(biāo)志1. 胸苷激酶thymidine kinase, tk1TK選擇原理四氫葉酸的必要性DHFR氨甲喋啉Methotrexate的抑制造用氨甲喋啉或氨基喋啉是葉酸的類似物。 能抑制二氫葉酸復(fù)原酶，從而阻斷dATP、dCTP和dTTP的合成：dUMP dATP TTP dCTP 氨甲喋啉 抑制 抑制 胸苷酸激酶的補(bǔ)救作用TK+細(xì)胞能產(chǎn)生胸苷酸激酶，所以可以利用培育基中的胸苷T合成dTTP，存活。Ttk次黃嘌呤的補(bǔ)救作用細(xì)胞可以利用次黃嘌呤合成dATP和dCTP。dUMP dATP dTTP dCTP 次黃嘌呤 補(bǔ)救 氨甲喋啉 抑制 抑制 HAT培育基：Tk

17、- 細(xì)胞株。TK基因。 宿主細(xì)胞 載體標(biāo)志2TK選擇過程含次黃嘌呤、氨基喋啉和胸苷的培育基。(hypoxanthine，aminopterin，thiymidine只需轉(zhuǎn)入TK基因的細(xì)胞才干生存。真核細(xì)胞核苷酸的合成需求四氫葉酸提供甲基。2. 二氫葉酸復(fù)原酶基因DHFR1 選擇原理二氫葉酸復(fù)原酶的必要性dUMPdATPTTPdCTP四氫葉酸四氫葉酸DHFR+細(xì)胞二氫葉酸四氫葉酸二氫葉酸復(fù)原酶二氫葉酸復(fù)原酶合成四氫葉酸DHFR+細(xì)胞能產(chǎn)生二氫葉酸復(fù)原酶，所以能合成四氫葉酸。能在無胸腺嘧啶和次黃嘌呤的培育基中生存不需求補(bǔ)救！DHFR- 細(xì)胞DHFR- 細(xì)胞不能產(chǎn)生二氫葉酸復(fù)原酶，所以不能合成四氫葉

18、酸。需求補(bǔ)救！不能在無胸腺嘧啶和次黃嘌呤的培育基中生存。 胸腺嘧啶和次黃嘌呤補(bǔ)救dUMPdATPTTPdATP次黃嘌呤補(bǔ)救胸苷補(bǔ)救無四氫葉酸提供甲基，dNTP合成受阻時，胸腺嘧啶和次黃嘌呤分別補(bǔ)救:DHFR-細(xì)胞株不能在無核苷酸的培育基中生長。 宿主細(xì)胞2選擇過程透析除去血清中的內(nèi)源性核苷酸，以免補(bǔ)救。 無核苷酸的培育基需求胸腺嘧啶和次黃嘌呤補(bǔ)救！ 氨甲喋呤“加壓 添加少量氨甲喋啉抑制內(nèi)源性DHFR的補(bǔ)救作用，可提高選擇。DHFR+基因。 載體標(biāo)志只需轉(zhuǎn)入DHFR+基因的細(xì)胞才干生存。DHFR-DHFR-DHFR+DHFR+livedie無核苷酸的培育基是細(xì)菌抗生素，干擾細(xì)菌的核糖體，使細(xì)菌的

19、蛋白質(zhì)合成不能正常進(jìn)展，但不影響真核生物。3. 新霉素抗性基因neor1選擇原理 新霉素neomycin新霉素的類似物，是一種 氨基糖苷，對真核細(xì)胞和原核細(xì)胞都有毒性。 G418geneticin 新霉素抗性基因-neor細(xì)菌的新霉素抗性基因neor編碼一種磷酸轉(zhuǎn)移酶APH，能使G418失活。G418真核細(xì)胞死亡G418存活neor真核細(xì)胞含致死劑量G418的完全培育基。 G418培育基真核細(xì)胞株均可。neor基因。宿主細(xì)胞載體標(biāo)志2選擇過程G418：100-800g/mLCAT是由大腸桿菌轉(zhuǎn)座子Tn9編碼的，催化氯霉素發(fā)生乙?；Щ?。氯霉素cat含氯霉素的完全培育基。真核細(xì)胞株均可。cat基因。乙酰氯霉素4. 氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶CAT1選擇原理2 選擇條件3 宿主細(xì)胞4載體標(biāo)志chloramphenicol acetyl transferase在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞提取物中測定能否有乙酰氯霉素。5 CAT分析方法 免疫學(xué)檢查：用抗CAT的血清進(jìn)展Western blot或ELISA，檢查CAT的表達(dá)。Anti-CAT Anti