《生物制藥工藝學》課件第三章 基因工程制藥-1

1、第三章基因工程制藥工藝3.1 基因工程制藥微生物表達系統(tǒng)3.2 基因工程大腸桿菌的構建技術3.3 基因工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)與控制3.4 重組人干擾素生產(chǎn)工藝基因工程菌：微生物為操作對象，通過基因工程技術獲得的表達外源基因或過量或抑制表達自身基因的工程生物體。種類：細菌和酵母是重要的表達重組藥物的制藥生物。3.1 基因工程制藥微生物表達系統(tǒng)3.1.1 大腸桿菌表達系統(tǒng)3.1.1 酵母表達系統(tǒng)3.1.1 大腸桿菌表達系統(tǒng)大腸桿菌（Eschericliacoli）形態(tài)特征細胞：G-，單細胞，桿狀。鞭毛，無芽孢，一般無莢膜。裂殖。菌落:白色至黃白色，光滑，直徑2-3mm。2、生化與遺傳特性能在僅有碳水化合

2、物和氮、磷及微量元素的無機鹽的極限培養(yǎng)基上生長，發(fā)酵糖，產(chǎn)氣產(chǎn)酸?；蚬こ讨惺褂镁辏篕-12株的衍生菌株?；蚪M：4.6 Mb，3000多種蛋白質(zhì)。染色體DNA為環(huán)狀雙鏈，核外遺傳物質(zhì)為質(zhì)粒。3 、質(zhì)粒載體自主復制不相容性轉(zhuǎn)移性選擇性標記多克隆位點質(zhì)粒類型嚴緊型質(zhì)粒：在每個宿主細胞只能復制少數(shù)幾個拷貝的質(zhì)粒，pSC101；松弛型質(zhì)粒：在每個細胞中能復制幾十至幾百個拷貝數(shù)的質(zhì)粒，pMB1和colE1?？寺≠|(zhì)粒：用于克隆和擴增外源基因。測序質(zhì)粒：用于基因測序。整合質(zhì)粒：用于外源基因與宿主染色體整合。穿梭質(zhì)粒：能在兩種宿主細胞存在。表達質(zhì)粒：能表達基因產(chǎn)物4、產(chǎn)物表達形式不溶性蛋白質(zhì)：細胞質(zhì)內(nèi)形成

3、包涵體包涵體是外源基因在原核細胞中表達時，尤其在大腸桿菌中高效表達時，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白質(zhì)顆粒，在顯微鏡下觀察時為高折射區(qū)，與胞質(zhì)中其他成分有明顯區(qū)別?？扇苄缘鞍踪|(zhì)：存在于細胞質(zhì)周質(zhì)表達：外源蛋白被運輸分泌到周質(zhì)，可溶性。有利于分離和減少蛋白酶降解，避免N端附加蛋氨酸。胞外分泌表達：胞內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)分泌到胞外的培養(yǎng)液中。5、優(yōu)點和不足發(fā)展最早、應用最廣泛的經(jīng)典的表達系統(tǒng)。具有遺傳背景清楚、目標基因表達水平高（高達70），培養(yǎng)周期短，抗污染能力強。不能用于加工修飾化（糖基化、酰胺化）蛋白表達。細胞死亡后，細胞壁脂多糖游離出來，形成內(nèi)毒素，具有抗原性，產(chǎn)生熱源。N端增加的蛋氨酸也容

4、易引起免疫反應。6、應用大量外源基因能超量的表達，18種藥物上市。多肽類2種（甲狀旁腺激素(1-34)、利尿鈉肽）激素：胰島素及2種突變體、8種生長素(1種PEG化)細胞因子類：5種干擾素（1種PEG化）、干擾素和，2種G-CSF(1種PEG化)，白介素-2、白介素-11、白介素-1拮抗劑溶栓酶類：rPA白喉毒素-IL 2融合蛋白、OspA脂蛋白（疫苗）等。3.1.2 酵母表達系統(tǒng)1、形態(tài)特征細胞：單細胞真核生物，球形、橢圓形、卵形。繁殖：芽殖、裂殖。在特定條件下才產(chǎn)生子囊孢子。菌落：乳白色，有光澤，邊沿整齊。2、生長與遺傳特征孢子萌發(fā)產(chǎn)生單倍體細胞，兩個性別不同的單倍體細胞結合形成二倍體接合

5、子或營養(yǎng)細胞，進行芽殖。能發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、半乳糖等。生長繁殖迅速，倍增期約2小時。釀酒酵母有17條染色體，1996年完成其全基因組測序，遺傳背景已相當清楚?；蚪M：12.068Mb，5887個ORF，編碼約6000個基因。3、優(yōu)點與不足五種類型的載體，安全、無毒。營養(yǎng)缺陷選擇外來質(zhì)粒。培養(yǎng)條件簡單、大規(guī)模培養(yǎng)技術成熟。亞細胞器分化，進行蛋白質(zhì)的翻譯后正確修飾和加工，并具有良好的蛋白質(zhì)分泌能力。缺點：釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)生乙醇，制約了高密度發(fā)酵。修飾的蛋白質(zhì)糖基化側(cè)鏈過長，會引起副作用。酵母表達載體Yip（Yeast intergration plasmid)酵母整合載 含有選擇性標記和多克

6、隆位點，有整合序列，通過同源重組整合到酵母染色體中，隨同源染色體一起復制和遺傳。YEp（Yeast episomal plasmid)酵母附加載體 能自主復制，高拷貝數(shù)，無需選擇壓力，用于基因表達YCp（Yeast centomere plasmid)酵母著絲粒載體 能自主復制，拷貝數(shù)低，用于文庫構建和基因克隆YRp（Yeast replicating plasmid)酵母復制載體 能自主復制，高拷貝數(shù)，無需選擇壓力時容易丟失，用于實驗研究 4、應用1981年Hitzman等：酵母表達人干擾素激素類：6種人胰島素及1種突變體，尿酸水解酶和水蛭素，細胞因子：GM-CSF和血小板衍生生長因子多肽類

7、：高血糖素2種乙肝疫苗等。8種產(chǎn)品小結表達系統(tǒng)：宿主菌+表達質(zhì)粒生物學，生產(chǎn)特征大腸桿菌系統(tǒng)酵母系統(tǒng)思考題（1）分析比較基因工程大腸桿菌和酵母表達系統(tǒng)制藥的優(yōu) 缺點，如何選擇應用？（2）這兩個系統(tǒng)生產(chǎn)了哪些重組蛋白質(zhì)藥物？第三章基因工程制藥工藝3.1 基因工程制藥微生物表達系統(tǒng)3.2 基因工程大腸桿菌的構建技術3.3 基因工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)與控制3.4 重組人干擾素生產(chǎn)工藝3.2 基因工程大腸桿菌的構建技術3.2.1 構建流程3.2.2 表達載體構建3.2.3 工程菌構建3.2.1 工程菌構建流程PCR，文庫篩選、化學合成通用載體（1）目標基因（2）表達載體特定載體候選宿主軍工程菌獲得與保存、新

8、性狀、新功能3.2.2 表達載體構建表達載體設計目標基因的定位克隆酶切反應連接反應轉(zhuǎn)化篩選與鑒定1、表達載體的設計表達載體概念：expression vector在質(zhì)粒載體的基礎上，在多克隆位點處插入外源基因表達盒所構成。外源基因表達盒(操縱子模型)：2、目標基因PCR定位克隆PCR技術 (Polymerase chain reaction, PCR)：聚合酶鏈式反應：由DNA聚合酶催化下，對特定的DNA 序列進行的復制反應。本質(zhì)：生物體的DNA復制原理在體外合成基因。發(fā)明者：Mullis，生物技術革命性象征。（2）PCR單反應原理與過程（3）PCR循環(huán)（4）PCR擴增的反應體系組成模板DNA

9、：目標序列,100-10 000bp,pg引物：兩條寡核苷酸，21-27 bp。脫氧核苷酸：4種dNTP,即dATP,dCTP,dGTP,dTTPDNA聚合酶: Taq聚合酶，耐高溫緩沖溶液：50 mM KCl、10 mM Tris-HCl,1.5 mM MgCl2（5）PCR擴增產(chǎn)物程序：溫度，時間，循環(huán)數(shù)電泳：目標基因片段大小，特異性。2、酶切反應概念：在特異位點上催化雙鏈DNA分子的斷裂，產(chǎn)生相應的限制性片段。酶切體系組成：DNA，緩沖液，限制性內(nèi)切酶。反應條件：適宜溫度(37)，1小時以上。終止反應：加熱；加入EDTA，螯合鎂離子。電泳檢查：酶切完全性。3、連接反應概念：DNA 雙鏈上

10、相鄰的3羥基和5磷酸基因共價結合形成3-5磷酸二酯鍵，使原來斷開的DNA缺口重新連接起來。連接體系：載體片段與基因片段，緩沖液，連接酶。連接反應：16-26，數(shù)小時,或過夜。終止反應：在70加熱10分鐘。4、轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化：某一基因型細胞從周圍介質(zhì)中吸收另一基因型細胞的DNA，使其基因型和表型發(fā)生相應變化的現(xiàn)象轉(zhuǎn)染：除去蛋白質(zhì)外殼的病毒核酸感染細胞或原生質(zhì)體的過程.大腸桿菌轉(zhuǎn)化CaCl2法感受態(tài)細胞融化：置冰上，緩慢。加入連接反應產(chǎn)物：混勻，置冰上30分鐘。熱擊：42，90秒。置冰上，1-2分鐘。擴增培養(yǎng)：加入LB培養(yǎng)基，37，45分鐘。涂平板：含有抗生素的LB固體培養(yǎng)基上。篩選培養(yǎng)：倒置平板，37

11、，出現(xiàn)菌落。5、篩選與鑒定轉(zhuǎn)化后的細胞類型非轉(zhuǎn)化子：沒有導入外源DNA的非轉(zhuǎn)化宿主細胞轉(zhuǎn)化子：導入外源DNA的轉(zhuǎn)化細胞非重組子：僅含有空載體分子的轉(zhuǎn)化子重組子：含有重組DNA分子的轉(zhuǎn)化子目標重組子：含有連接正確的重組分子（目的）非目標重組子：不含目的基因重組子（1）篩選方法抗生素篩選法：抗生素的抗性基因，氨芐青霉素。籃白斑篩選法：lacZ基因，重組子白色，非重組子藍色。噬菌斑篩選法：轉(zhuǎn)化子被裂解形成噬菌斑，非轉(zhuǎn)化子正常生長。（2）鑒定方法菌落PCR：含有目標基因載體大?。弘娪緳z測酶切鑒定：目標基因插入及插入方向測序確證：目標基因的序列準確無誤，閱讀框架通讀3.2.3 基因工程菌的建立過程：適宜

12、宿主菌的轉(zhuǎn)化篩選鑒定，遺傳穩(wěn)定性等。目標：獲得質(zhì)粒能穩(wěn)定遺傳、基因能高效和定向表達的載體，確保藥物的生物活性。表達篩選與產(chǎn)物鑒定不同菌種的表達篩選誘導表達時間和誘導強度的篩選產(chǎn)物存在形式和存在場所的鑒定表達部位胞外，周質(zhì)，胞內(nèi)；包涵體，可溶性蛋白表達產(chǎn)物結構與活性鑒定電泳，SDSPAGE，等電點電泳免疫雜交，末端測序，質(zhì)譜分析分析與目標產(chǎn)物的同一性小結表達載體構建：基因克隆，酶切，連接轉(zhuǎn)化工程菌構建：表達篩選，功能確認思考題（1）工程菌構建的基本過程是什么，所涉及生物技術的原理是什么？（2）在大腸桿菌中高效表達蛋白藥物要著重設計哪幾個方面？第三章基因工程制藥工藝3.1 基因工程制藥微生物表達系

13、統(tǒng)3.2 基因工程大腸桿菌的構建技術3.3 基因工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)與控制3.4 重組人干擾素生產(chǎn)工藝3.3 基因工程菌發(fā)酵培養(yǎng)與控制3.3.1 培養(yǎng)基組成與控制3.3.2 培養(yǎng)工藝與控制3.3.3 終點控制3.3.1 培養(yǎng)基組成與控制碳源氮源無機鹽選擇劑誘導物1、碳源大腸桿菌：蛋白胨等蛋白質(zhì)的降解物作為碳源酵母：利用葡萄糖、半乳糖等單糖類物質(zhì)。添加低濃度的單糖和雙糖及其它有機物如甘油等對菌體生長具有一定的促進作用。濃度稍高后就表現(xiàn)出底物抑制作用。葡萄糖優(yōu)先利用會造成培養(yǎng)基的酸化。2、氮源直接很好地吸收利用銨鹽等，一般不能利用硝態(tài)氮。幾乎都能利用有機氮源。不同工程菌對氮源利用能力差異很大，具有很高

14、的選擇性。大腸桿菌：利用大分子有機氮源，酵母粉等。酵母：利用氨基酸為氮源3、無機鹽磷、硫、鉀、鈣、鎂、鈉等大量元素和鐵、銅、鋅、錳、鉬等微量元素的鹽離子形態(tài)基因工程菌生長提供必需的礦物質(zhì)。4、選擇劑 selective agent維持工程菌的純正性和質(zhì)粒的穩(wěn)定性的化合物。發(fā)酵培養(yǎng)過程中質(zhì)粒容易丟失，使之成為宿主菌為了保證質(zhì)粒的穩(wěn)定性，不丟失。根據(jù)質(zhì)粒上的營養(yǎng)缺陷或選擇性標記基因，添加或缺陷選擇劑。選擇劑種類營養(yǎng)缺陷互補和抗生素抗性。工程大腸桿菌：卡那霉素、氨芐青霉素、氯霉素、博來霉素等抗生素作為選擇劑工程酵母菌：氨基酸營養(yǎng)缺陷型，缺陷亮氨酸、組氨酸、賴氨酸、色氨酸等，有時也是使用G418等抗性

15、。5、誘導物誘導表達型工程菌：在細胞生長到一定階段，必需添加誘導物，以解除目標基因的抑制狀態(tài)，活化基因，進行轉(zhuǎn)錄和翻譯，生成產(chǎn)物。誘導物成為產(chǎn)物表達必不可少的。Lac啟動子表達系統(tǒng)：IPTG誘導。甲基營養(yǎng)型酵母：加入甲醇進行誘導。6、培養(yǎng)基組成對質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響營養(yǎng)較豐富的培養(yǎng)基，質(zhì)粒穩(wěn)定性高于合成培養(yǎng)基限制性基質(zhì)對基因工程菌的比生長速率有不同影響。大腸桿菌對葡萄糖和磷酸鹽限制易發(fā)生質(zhì)粒不穩(wěn)定，有一些質(zhì)粒對氮源、鉀、硫等表現(xiàn)不穩(wěn)定。對于酵母，極限培養(yǎng)基比豐富培養(yǎng)基更有利于維持質(zhì)粒穩(wěn)定性。培養(yǎng)基中添加酵母提取物和谷氨酸等有利于提高質(zhì)粒穩(wěn)定性。3.3.2 培養(yǎng)工藝與控制溫度溶解氧pH溫度對工程菌發(fā)

16、酵的影響大腸桿菌和釀酒酵母生長最低溫度為10大腸桿菌生長最適溫度為37，最高溫度為45。釀酒酵母生長最適溫度為30，最高溫度為40。溫度對工程菌發(fā)酵的影響生長與生產(chǎn)溫度不一致。較高溫度表達包涵體，較低溫度下有利于表達可溶性蛋白質(zhì)。對于熱敏感的蛋白質(zhì)，生產(chǎn)期可采用先高溫，然后低溫，變溫表達，避免蛋白質(zhì)降解。溫度控制兩段變溫發(fā)酵培養(yǎng)：前期：較高溫度發(fā)酵，獲得足夠高的菌體密度；后期：較低溫培養(yǎng)發(fā)酵，對菌體合成目標產(chǎn)物的抑制不明顯，但可有效抑制目標產(chǎn)物的降解和包涵體形成，總體提高工程菌的生產(chǎn)能力。溫度誘導型大腸桿菌表達系統(tǒng)：生長期維持37，生產(chǎn)期提高溫度42。pH值對發(fā)酵的影響細菌喜歡偏堿性：大腸桿菌

17、適宜pH為6.57.5，真菌喜歡微酸性：酵母適宜pH為5.06.0。影響產(chǎn)物穩(wěn)定性，最適生長和最適生產(chǎn)pH不同。干擾素是在酸性條件下穩(wěn)定，而在堿性條件下容易降解。酸性環(huán)境有利于發(fā)揮菌株生產(chǎn)能力。乙酸的產(chǎn)生使菌體生長速率下降，也抑制基因表達。pH值控制了解發(fā)酵過程中各個階段的適宜pH以后，需要進一步設法控制pH在合適的范圍內(nèi)。分階段控制pH：根據(jù)試驗結果來確定生長最適pH和產(chǎn)物最適pH，以達到最佳生產(chǎn)。3.溶解氧控制工程菌是好氧微生物，生長過程需要大量氧。從供應量和需要量（菌體生長、質(zhì)粒穩(wěn)定性、產(chǎn)物積累）二個方面考慮，使之需氧不超過設備的供氧能力考慮溶氧對質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響：調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量3

18、.3.3 終點控制根據(jù)目標基因產(chǎn)物的表達模式而定。適宜的誘導時間：非常重要誘導物的濃度及其發(fā)酵溫度：影響表達量，產(chǎn)物存在形式在生產(chǎn)中應嚴格控制。1、化學誘導表達化學誘導型啟動子：lac、tac、T7等誘導時間：對數(shù)生長期細菌：IPTG(異丙基-b-d-硫代半乳糖苷),誘導甲基營養(yǎng)型酵母：甲醇誘導。2、溫度誘導表達溫度誘導型啟動子：PL、PR啟動子兩段培養(yǎng)發(fā)酵：誘導時間：菌體生長的對數(shù)期或稍后一些，升高溫度，合成產(chǎn)物。思考題（1）工程菌與宿主菌對培養(yǎng)基要求有何不同，為什么？（2）影響工程菌培養(yǎng)工藝的主要參數(shù)是什么？如何優(yōu)化控制？（3）工程菌發(fā)酵中，如何確定終點？第三章基因工程制藥工藝3.1 基因

19、工程制藥微生物表達系統(tǒng)3.2 基因工程菌的構建技術3.3 基因工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)與工藝控制3.4 重組人干擾素生產(chǎn)工藝3.4 重組人干擾素生產(chǎn)工藝3.4.1 干擾素概述3.4.2 基因工程假單胞桿菌的構建與保藏3.4.3 干擾素的發(fā)酵工藝過程3.4.4 干擾素的分離純化工藝過程3.4.1 干擾素概述干擾素的種類干擾素的臨床應用干擾素的生產(chǎn)工藝路線1、干擾素的種類概念：（interferon，IFN）機體受到病毒感染時，免疫細胞產(chǎn)生的一組結構類似、功能接近的細胞因子功能：干擾病毒在細胞內(nèi)的繁殖分類：型：有IFN-和IFN-，其中IFN-有二十余個亞型，IFN-僅有一個亞型。型干擾素具有抑制病毒復制

20、、抗寄生蟲、抑制多種細胞增殖、刺激免疫細胞的殺傷活性、參與免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等作用。型：只有IFN-，且只有一種亞型，除具有抗病毒、抗增殖活性外，其主要生物學活性為免疫調(diào)節(jié)作用。型：即IFN-1（IL-29）、IFN-2（IL-28a）和IFN-（IL-28b）。干擾素的理化性質(zhì)143-166aa；MW：17-23 ku；pH：5.7-8.5；乙醚、氯仿敏感容易吸附介質(zhì)。2、重組干擾素的臨床應用廣譜抗病毒活性（rhuIFN）慢性乙型、丙型、丁型肝炎；皰疹、病毒性角膜炎。直接抗腫瘤活性（rhuIFN）毛細胞和慢性髓樣白血病、Kaposi肉瘤、非霍奇金淋巴瘤。免疫調(diào)節(jié)活性治療慢性肉芽腫瘤（rhuIF

21、N）多發(fā)性硬化癥rhuIFN3、干擾素生產(chǎn)工藝路線（1）體外誘生干擾素制備工藝：Sendai病毒誘導人白細胞1989年：IFN-n3/Alferon，批準上市產(chǎn)量低：1g IFN，需要3億ml人血白細胞來源困難，工藝復雜，收率低，價格昂貴潛在的血源性病毒污染的可能性血漿人白細胞分離純化病毒誘導人白干擾素3、干擾素生產(chǎn)工藝路線（2）人源轉(zhuǎn)化細胞系培養(yǎng)生產(chǎn)工藝：1999年：IFN -n1/Wellferon, 批準用于臨床。優(yōu)點：首次實現(xiàn)大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)。缺點：活性低，退出臨床應用。Namalva培養(yǎng)合成干擾素分離純化病毒誘導多亞型混合干擾素3、干擾素生產(chǎn)工藝路線（3）基因工程大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝

22、：上市產(chǎn)品：重組人干擾素rhuIFN1986，rhuIFN-2a，rhuIFN-2b；1990，rhuIFN-1b；1993，rhuIFN-1b；20012002：PEG化IFN，PEG-Intron, Pegasys表達產(chǎn)物：無糖基化，N-met，無活性包涵體工藝特點：發(fā)酵過程，隨后變性、復性過程。工程菌構建細胞培養(yǎng)包涵體復性重組人干擾素3、干擾素生產(chǎn)工藝路線（4 ）動物無限細胞系培養(yǎng)生產(chǎn)工藝：上市產(chǎn)品：rhuIFN-1a1996，Avonex(Biogen)；2002，Rebif(Serono)表達產(chǎn)物：166 aa糖基化蛋白，22.5 ku工藝特點：分泌表達，產(chǎn)量低，成本高,過程嚴格工程

23、菌CHO細胞系構建細胞培養(yǎng)收集培養(yǎng)液分離純化重組人干擾素3、干擾素生產(chǎn)工藝路線（5）宿主：腐生型假單胞桿菌（Pseudomonas putida）上市產(chǎn)品：IFN -2b/安福隆表達產(chǎn)物：無糖基化可溶性蛋白質(zhì)，具有天然分子結構和生物活性工藝特點：發(fā)酵周期短：幾個小時無需變性、復性過程，獲得有活性產(chǎn)品純化過程：淘汰抗體親和層析3.4.2 基因工程假單胞桿菌的構建與保藏基因工程假單胞桿菌菌種建立基因工程假單胞桿菌菌種特性菌種庫的建立與保藏1、基因工程假單胞桿菌菌種建立第一步：干擾素-2b基因的克隆第二步：表達載體的構建第三步：工程菌的構建1、基因工程假單胞桿菌菌種建立第一步：干擾素基因的克隆(RT

24、-PCR)制備白細胞，病毒誘導，分離mRNA,反錄酶合成cDNA，PCR，基因連接質(zhì)粒, 轉(zhuǎn)化E.coli,篩選鑒定克隆。測序：編碼人IFN-2b基因序列,501bp，165aa。ATGTGTGATCTGCCTCAGACCCACAGCCTGGGTAGCAGGAGGACCTTGATGCTCCTGGCACAGATGAGGAGAATCTCTCTTTTCTCCTGCTTGAAGGACAGACATGACTTTGGATTTCCCCAGGAGGGTTTGCCAACCAGTTCCAAAAGGCTGAAACCATCCCTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAGATCTTCAATCTCTTCAGCACAA

25、AGGACTCATCTGCTGCTTGGGATGAGACCCTCCTAGACAAATTCACACTGAACTCTACCAGCAGCTGAATGACCTCGAAGCCTGTGTGATACAGGGGGTGGGGGTGACAGAGACTCCCCTGATGAAGGAGGACTCCATTCTGGCTGTCAGGAAATACTTCCAAAGAATCACCTCTATCTGAAAGAGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGAGCAGAAATCATGAGATCTTTTTCTTTGTCAACAAACTTGCAAGAAAGTTTAAGAAGTAAGGAATGA1、基因工程假單胞桿菌菌

26、種建立第二步：表達載體構建IFN基因與表達載體連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌篩選陽性克隆獲得序列正確表達載體1、基因工程假單胞桿菌菌種建立第三步：工程菌構建轉(zhuǎn)化假單胞桿篩選高表達、穩(wěn)定遺傳的工程菌獲得原始菌種2、基因工程菌的特性具有宿主菌的特征：細菌：革蘭氏陰性菌，有莢膜，無芽孢，桿狀。菌落：直徑2.5-3.0 mm，灰綠色半透明狀,粘稠。生化特性:Ser-，L-Val、D/L-Arg和L-Thr為碳源。工程菌的特征：SmR、TcR、ApR具有生產(chǎn)干擾素能力：放射性免疫學效價不低于2.0109 IU/L。3、菌種庫的建立與保藏QC：菌種特性、生產(chǎn)能力、質(zhì)粒穩(wěn)定性菌種檢查合格后，方可投產(chǎn)。傳代擴增，凍干保藏原

27、始菌種庫主菌種庫工作菌種庫傳代擴增，凍干保藏3.4.3 干擾素的發(fā)酵工藝過程工作菌種庫搖瓶培養(yǎng)種子罐培養(yǎng)發(fā)酵罐培養(yǎng)菌體收集1搖瓶培養(yǎng)取保存工作種子批菌種，室溫融化搖瓶培養(yǎng)：30，pH7.0，250 r/min，182h檢測：OD值和發(fā)酵液雜菌檢查。2種子罐培養(yǎng)接種：接入50L種子罐，接種量10%。培養(yǎng)：30，pH7.0。控制：級聯(lián)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速 DO為30%，34h，OD4.0。檢測：顯微鏡和LB培養(yǎng)基劃線檢查，控制雜菌3發(fā)酵罐培養(yǎng)接種：通入300L培養(yǎng)基的發(fā)酵罐，接種量10%?？刂疲杭壜?lián)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速。前4h：30，pH7.0，DO為30%。4h后：20，pH6.0，DO為60%

28、，56.5h。終點控制：OD值達9.01.0，5冷卻水快速降溫至15以下。檢測：發(fā)酵液雜菌檢查4菌體收集連續(xù)流離心機：冷卻的發(fā)酵液，16000 r/min離心收集。菌體保存：-20冰柜，不超過12個月。檢測：干擾素含量、菌體蛋白含量、菌體干燥失重、質(zhì)粒結構一致性、質(zhì)粒穩(wěn)定性。思考題（1）1、干擾素生產(chǎn)工藝路線有哪幾條，有何特點？2、干擾素發(fā)酵工段的關鍵控制點是什么，如何實現(xiàn)最優(yōu)化過程控制？3、根據(jù)現(xiàn)有工藝路線，提出研發(fā)仿制重組干擾素生產(chǎn)新工藝。3.4.4 干擾素的分離純化工藝過程1、干擾素分離工藝過程2、干擾素的純化工藝過程1、干擾素分離工藝過程菌體裂解預處理初級分離(1)菌體裂解裂解緩沖液：純化水，210（pH7.5）使用保護劑：EDTA（乙二胺四乙酸 ），PMSF（苯甲基磺酰氟 ）。破碎20菌體：2厘米攪拌：加裂解緩沖液，210，2hr凍融: 細胞完全破裂，釋放干擾素。(2)預處理加絮凝劑聚乙烯亞胺:210，攪拌，對菌體碎片進行絮凝。加凝聚劑醋酸鈣溶液:210,攪拌，對菌體碎片、DNA等進行沉淀。沉淀作用離心連續(xù)流離心機：210，16000 r/min收