遺傳重組-轉(zhuǎn)座-敲除(2)ppt課件

1、第九章 DNA的重組與轉(zhuǎn)座重組的定義遺傳重組的類型同源重組的分子機(jī)制重組和酶位點特異性重組轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座的機(jī)制遺傳重組的運用6.0 重組DNA分子的斷裂和重新銜接導(dǎo)致遺傳信息的重新組合，稱為重組recombination。重組的產(chǎn)物稱為重組DNArecombinant DNA，一切的DNA都是重組DNA。由于重組，一個DNA分子的遺傳信息可以和另一個DNA分子的遺傳信息結(jié)合在一同，也可以改動一條DNA分子上遺傳信息的陳列方式。DNA重組廣泛存在于各類生物中，闡明重組對物種生存具有重要意義。經(jīng)過重組實現(xiàn)基因的重新組合使物種可以更快地順應(yīng)環(huán)境，加快進(jìn)化的過程。此外，DNA重組還參與許多重要的生物學(xué)過程，

2、比如重組在DNA損傷修復(fù)和突變中發(fā)揚重要作用。6.1 遺傳重組的類型 根據(jù)對DNA序列和所需蛋白因子的要求，可有三種類型的重組。其共同點是這些過程都涉及雙鏈DNA之間的物質(zhì)交換，但其發(fā)生的情況有所不同。遺傳重組的三種類型1同源重組 它的發(fā)生是依賴大范圍的DNA同源序列的聯(lián)會。在重組過程中，兩個染色體或DNA分子交換對等的部分。需求重組的蛋白質(zhì)參與，eg.大腸桿菌中的RecA蛋白、RecBCD蛋白；蛋白質(zhì)因子對DNA堿基序列的特異性要求不高；存在重組熱點和序列長度的影響真核生物染色質(zhì)的形狀影響重組的頻率。特點：同源重組能夠發(fā)生在兩條同源的DNA的恣意位點(3)異常重組 完全不依賴于序列間的同源性

3、而使一段DNA序列插入另一段中，但在構(gòu)成重組分子時往往是依賴于DNA復(fù)制而完成重組過程。eg.轉(zhuǎn)座作用，需求轉(zhuǎn)座酶和對轉(zhuǎn)座區(qū)域DNA的復(fù)制。(2)位點專注性重組 重組依賴于小范圍同源序列的聯(lián)會，發(fā)生準(zhǔn)確的斷裂、銜接，DNA分子并不對等交換 eg. -phage DNA對E.coli 的整合(attPattB)，需求有15 bp的同源序列和專注性的蛋白質(zhì)因子參與。 位點專注重組發(fā)生在兩條特定的序列，兩條重組DNA的其他序列那么是不同的。位點專注重組能使二聚體環(huán)狀DNA分子產(chǎn)生兩個單體環(huán)狀DNA分子6.2 同源重組的分子機(jī)制同源重組homologous recombination發(fā)生在兩個同源DN

4、A分子之間。真核細(xì)胞減數(shù)分裂過程中，同源染色體彼此配對，同源染色體DNA片段發(fā)生交叉與互換。Darlington D. C.于1936年提出：減數(shù)分裂同源染色體聯(lián)會時，非姊妹染色單體由于纏繞而產(chǎn)生張力，兩個染色單體在同一位置斷裂、重接，以消除張力，從而產(chǎn)生重組。6.2.1 斷裂與重接模型First Meiotic Interphase (cells contain 4N DNA content) Bivalent sister chromatidsalign with each other, thisact is termed synapsis.Synapsed sister chromati

5、dsare termed a synaptonemal complex) Figure 5-55, page 185兩條同源DNA分子彼此并排對齊，相互配對DNA中兩個方向一樣的單鏈在DNA內(nèi)切酶的作用下,在一樣位置上同時切開。在切口處發(fā)生鏈的交換，構(gòu)成所謂的銜接分子joint molecule，也稱Holliday構(gòu)造Holliday structure。分支點可以發(fā)生挪動，稱為分支遷移branch migration，分支遷移的結(jié)果是在兩個DNA分子中構(gòu)成異源雙鏈區(qū)heteroduplex。1. Holliday modelSynapsedchromatidsRecombinationjo

6、intHeteroduplex DNA 鏈交換所構(gòu)成的銜接分子必需進(jìn)展拆分，才干構(gòu)成兩個獨立的雙鏈分子。這需求再產(chǎn)生兩個切口。反響結(jié)果要看切開的是哪一對鏈，假設(shè)切口發(fā)生在當(dāng)初未切的兩條鏈上，那么原來的4個鏈就全被切開，就會釋放出剪接重組DNA(splice recombinant DNA)分子。ABBAABABABBAHolliday intermediatesABBAA BA BA BA BEndonucleasesaka. resolvases(e.g. RuvC)Products beforeDNA repairHolliday Intermediate(see Photo inLehn

7、inger pg 962) 假設(shè)切口發(fā)生在當(dāng)初被切的兩條鏈上，銜接分子拆分后將構(gòu)成補(bǔ)丁重組體patch recombinant。分開的兩個DNA分子除保管了一段異源雙鏈DNA 外，均完好無缺。因此，銜接DNA分子無論如何拆分，所構(gòu)成的兩個獨立的DNA分子總有一段異源雙鏈區(qū)，但是異源雙鏈區(qū)兩側(cè)的重組未必同時發(fā)生。Termed “patch recombinants兩條雙鏈體DNA分子間的重組關(guān)鍵是單鏈的交換。當(dāng)雙鏈體DNA的單鏈與相對應(yīng)的另一雙鏈體中的單鏈發(fā)生置換時，會產(chǎn)生一個分叉構(gòu)造。交換產(chǎn)生異源雙鏈體DNA片斷，兩條單鏈分別來自父本和母本。結(jié)合分子可以經(jīng)過切開相接的鏈從而構(gòu)成兩條分開的雙鏈體

8、分子。DNA雙鏈體配對同源鏈被切出缺口在雙鏈體之間，斷裂鏈交換靠分叉遷移，使交叉點挪動在雙鏈體間第二鏈交叉，切口被封鎖兩條配對雙鏈體DNA的重組包括相互的單鏈交換、分叉交換和缺口的切出。Holliday模型Holliday R.于1964年提出旋轉(zhuǎn)顯示Holliday接頭構(gòu)造 切口控制結(jié)果根據(jù)鏈被切出缺口的位置, Holliday構(gòu)造的結(jié)果可產(chǎn)生親本雙鏈體或重組雙鏈體.兩種類型的產(chǎn)物都有一段異源雙鏈體DNA. Holliday模型可以較好解釋同源重組景象，但也存在問題。該模型以為進(jìn)展重組的兩個DNA分子在開場時需求在對應(yīng)鏈一樣位置上發(fā)生斷裂。DNA分子單鏈斷裂是經(jīng)常發(fā)生的事，但很難想象兩個分子

9、何以能在同一位置發(fā)生斷裂。6.2.3 Meselson-Radding模型 Holliday模型中為對稱的雜合雙鏈，而實踐情況有不均等分別景象。1975年，Matthew Meselson 和 Charles Radding對Holliday 模型進(jìn)展了修正。 Holliday模型要求在兩個并排對齊的同源DNA分子的對應(yīng)位點構(gòu)成單鏈切口，從而產(chǎn)生游離的單鏈末端。然而，在Meselson-Radding遺傳重組模型中，僅在一個雙螺旋上產(chǎn)生單鏈切口。利用切口處3-OH合成的新鏈把原有的鏈逐漸置換出來，使之成為以5P為末端的單鏈區(qū)。隨后游離的DNA單鏈侵入另一條DNA雙螺旋中，取代它的同源單鏈并與其

10、互補(bǔ)鏈配對構(gòu)成異源雙鏈區(qū)，被置換的單鏈構(gòu)成D環(huán)D-loop。D環(huán)單鏈區(qū)隨后被切除,兩個DNA分子在DNA銜接酶的作用下構(gòu)成Holliday交叉。與Holliday不同，此時只在一條DNA分子上出現(xiàn)異源雙鏈區(qū)。假設(shè)發(fā)生分支遷移，在兩條雙螺旋上均出現(xiàn)異源雙鏈區(qū)。隨后發(fā)生的銜接分子的拆解與Holliday模型一樣。但是更多的現(xiàn)實闡明，重組是由雙鏈斷裂所啟動。如今以為，同源重組是減數(shù)分裂的緣由，而不是減數(shù)分裂的結(jié)果。DNA分子雙鏈斷裂才干與同源分子發(fā)生鏈的交換，藉以將同源染色體分配到子代細(xì)胞中去。因此，雙鏈斷裂啟動重組，也啟動了減數(shù)分裂。6.2.4 雙鏈斷裂重組模型model of double-st

11、rand breaks recombination 一條染色體的兩條鏈都發(fā)生了斷裂，斷裂是由內(nèi)切酶水解磷酸二酯鍵的結(jié)果。DNA斷裂之后由核酸外切酶擴(kuò)展缺口, 接著是斷裂鏈的游離3端插入到具有完好雙鏈的同源染色體中，構(gòu)成D-環(huán)構(gòu)造。在DNA聚合酶的作用下，斷裂兩條鏈分別以完好鏈為模板開場所成, 最后再經(jīng)過斷裂重接過程完成重組。在受體中構(gòu)成雙鏈斷裂斷裂擴(kuò)展為含有3端的間隙3端轉(zhuǎn)到其他的雙鏈體上3端的合成交換了間隙的一條鏈置換的鏈遷移到其他雙鏈體上DNA的合成發(fā)生于其他3端間隙被供體序列替代相互挪動產(chǎn)生了雙交換6.3 重組和酶在原核生物同源重組中存在8個堿基組成的Chi位點重組熱點 5 GCTGGT

12、GG 3 3 CGACCACC 5 在E.coli中每隔約510 kb有一個拷貝Rec和Ruv蛋白參與重組。RecA蛋白RecA具有單鏈DNA和雙鏈DNA的結(jié)合活性，能啟動DNA單鏈和與之互補(bǔ)的雙鏈分子進(jìn)展堿基配對催化單鏈取代。 RecA能促進(jìn)SOS反響中的蛋白酶活性。 單鏈取代 (single-strand uptake)其中一個DNA 分子要有單鏈區(qū)；其中一個DNA 分子要有游離的3末端；單鏈區(qū)和3末端可和另一DNA分子互補(bǔ)。 RecA具有的處置DNA活性使一條單鏈能與一條雙鏈體中的同源部分發(fā)生置換，這個反響稱為單鏈同化。這個置換反響可發(fā)生在幾種不同構(gòu)型的DNA分子之間，但要具備3個條件：

13、在雙鏈體與單鏈分子之間RecA催化鏈交換只需其中的一條反響鏈有游離端, RecA就能促進(jìn)入侵的單鏈同化于雙鏈體DNA中RecA蛋白介導(dǎo)的DNA鏈交換模型RecBCD復(fù)合體具有核酸酶，解旋酶和ATPase活性。在Chi位點產(chǎn)生單鏈3游離未端.Chi位點可以改動RecBCD的酶活性。一旦RecBCD識別出Chi序列，RecBCD核酸酶活性便發(fā)生變化，其35外切酶活性遭到抑制，53外切酶活性被激活，由原來優(yōu)先降解3末端鏈，改動為只降解5末端鏈。但是它的解旋酶活性未遭到影響。 RecBCD酶活性變化的結(jié)果是產(chǎn)生3末端帶有Chi位點的ssDNA。RecBCD蛋白RecBCD核酸酶從一邊開場向chi位點前

14、進(jìn), 當(dāng)它前進(jìn)時,它降解DNA, 在chi位點,它進(jìn)展核酸內(nèi)切, 而后失去RecD,并保管解旋酶活性.RuvA可識別 Holliday的銜接點構(gòu)造RuvB是ATPase，可發(fā)動遷移反響RuvC是一種內(nèi)切酶， 可特異識別Holliday分枝， 它在體外可切這個銜接體，解離重組中間體。 Ruv 蛋白RuvAB是個不對稱的復(fù)合體，它推進(jìn)Holliday結(jié)合點的分叉遷移損傷DNA的復(fù)制產(chǎn)生間隙RecA介導(dǎo)鏈交換第二鏈交換間隙由DNA合成來填補(bǔ)RuvAB介導(dǎo)分叉遷移RuvC切除Holliday銜接點6. 4 位點特異性重組位點特異性重組是發(fā)生在DNA上特定序列之間的重組，不依賴于DNA順序的同源性，由能

15、識別特異DNA序列的蛋白質(zhì)介導(dǎo)，并不需求RecA蛋白和單鏈DNA。6. 4 位點特異性重組噬菌體DNA侵入大腸桿菌細(xì)胞后，面臨著裂解生長和溶原生長的選擇。要進(jìn)入溶原形狀，游離的噬菌體DNA要插入到宿主的染色體DNA中去，這個過程稱為整合integration。由溶原生出息入裂解生長，DNA又必需從宿主染色體上切除下來，這個過程稱為外切excision。整合和外切 均需求經(jīng)過細(xì)菌DNA和DNA特定位點之間的重組來實現(xiàn)，這些位點稱為att位點attachment site。 噬菌體的int編碼整和酶來催化整和反響。位點專注性重組的核苷酸序列1. POP: O為15bp(中心)富含A-T的非對稱序列

16、； P為-160 0的160bp序列 P為0 80的80bp序列2. BOB: B為-11 0序列 B為0 11序列噬菌體的整合和切除共240bp共23bp經(jīng)過在attB和attP之間的相互重組，噬菌體環(huán)狀DNA轉(zhuǎn)變成線性的前噬菌體；而經(jīng)過在attL和attR之間的相互重組，前噬菌體能被外切出來。-DNA對E.coli的整合： POP + BOB BOPPOB需求整合酶(Int拓?fù)洚悩?gòu)酶活性)和整合宿主因子(IHF)參與-DNA從E.coli的切離： BOPPOB POP + BOB需求整合酶(Int)、整合宿主因子(IHF)和切除酶(Xis)參與。一切這些蛋白質(zhì)都結(jié)合到attL和attR的P

17、和P臂上，而attL和attR中央的中心序列并排對齊陳列促進(jìn)原噬菌體的切除。噬菌體的整合和切除整合的過程:具有對特異性DNA劇烈親和力的Int與attP和attB位點結(jié)合； Int的拓?fù)洚悩?gòu)酶活性，使兩條雙鏈各自斷開一條單鏈，瞬間旋轉(zhuǎn)然后交換銜接，構(gòu)成Holliday中間體，在另兩條單鏈之間發(fā)生同樣的斷裂重接，從而完成雙鏈間的重組。Int和IHF結(jié)合到attP的不同位點，在中心區(qū)域的Int識別位點包括被切割位點attB和attP的共同中心序列的交叉切割允許成十字架狀的銜接，使相互之間能產(chǎn)生重組銜接點。轉(zhuǎn) 座 在生物的基因組中存在一類特殊的DNA序列，它們可以作為獨立的單位從基因組的一個位置挪動

18、到另一個位置，這種可以改動本身位置的DNA序列被稱為轉(zhuǎn)座子transposons。 一切的轉(zhuǎn)座子都有兩個根本特征。首先，轉(zhuǎn)座子的兩端為反向反復(fù)序列inverted repeat。第二，轉(zhuǎn)座子至少含有一個編碼轉(zhuǎn)座酶transposase的基因。很多轉(zhuǎn)座子還攜帶有與轉(zhuǎn)座不相關(guān)的基因，例如抗生素抗性基因、毒性基因等。這些基因位于轉(zhuǎn)座子內(nèi)，隨轉(zhuǎn)座子一同從一個DNA分子挪動到另一個DNA分子，對基因組的進(jìn)化產(chǎn)生了非常重要的影響。DNA轉(zhuǎn)座子 一細(xì)菌的DNA轉(zhuǎn)座子1. 插入序列 (insertion sequences, IS )插入序列是最簡單的轉(zhuǎn)座子。典型的插入序列長7501500 bp，具有1040

19、 bp長的末端反向反復(fù)序列。IS元件的兩個末端并非是非常準(zhǔn)確的反向反復(fù)序列。一切的IS元件都含有一個編碼區(qū)，它編碼的轉(zhuǎn)座酶能識別IS元件的末端反復(fù)序列，為一種介導(dǎo)轉(zhuǎn)座過程關(guān)鍵蛋白質(zhì)組分。轉(zhuǎn)座酶對IS元件兩個邊境的識別保證了IS元件作為一個整體在基因組中挪動。IS元件位于細(xì)菌的染色體上，也存在于噬菌體和質(zhì)粒的DNA分子中。在大腸桿菌的染色體中發(fā)現(xiàn)了幾個拷貝的IS1、IS2和IS3。F因子中沒有IS1，但有一個拷貝的IS2和兩個拷貝的IS3。當(dāng)質(zhì)粒和染色體上具有一樣的IS元件時，質(zhì)?？梢越?jīng)過同源重組整合到宿主細(xì)胞的染色體上。復(fù)合轉(zhuǎn)座子 (composite transposon ) 中心區(qū)攜帶有抗

20、藥性標(biāo)志(Drug marker)，兩側(cè)有被稱為模塊module的IS元件或類IS元件。 每個IS元件都有以倒轉(zhuǎn)反復(fù)序列為末端的普通構(gòu)造，所以復(fù)合轉(zhuǎn)座子也是以同樣的倒轉(zhuǎn)反復(fù)序列為末端的。有些復(fù)合轉(zhuǎn)座子兩側(cè)IS序列是一樣的 ,另一些例子中，模塊高度同源但不一樣。與IS序列一樣，復(fù)合轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座也會在靶基因組中產(chǎn)生短的正向反復(fù)。Tn3 轉(zhuǎn)座子 Tn3代表另一類更為復(fù)雜的轉(zhuǎn)座子。這類轉(zhuǎn)座子的兩個側(cè)翼序列不是IS或類IS序列，而是短的倒轉(zhuǎn)反復(fù)序列；Tn3的反向反復(fù)序列的長度是38bp。在兩個倒轉(zhuǎn)反復(fù)序列之間有3個基因。 A map of transposon Tn3.轉(zhuǎn)座的分子機(jī)制 轉(zhuǎn)座子可以經(jīng)過兩種

21、機(jī)制進(jìn)展轉(zhuǎn)座。一種是保守型轉(zhuǎn)座conservative transpositin，一種是復(fù)制型轉(zhuǎn)座replicative transposition。在保守型轉(zhuǎn)座中，轉(zhuǎn)座元件從供體位點上切除，然后插到靶位點上，因此這個機(jī)制又叫做剪切粘貼轉(zhuǎn)座cut-and-paste transposition。在復(fù)制型轉(zhuǎn)座中，轉(zhuǎn)座子被復(fù)制，轉(zhuǎn)座的DNA序列是原座因子的一個拷貝，而不是它本身。因此，復(fù)制型轉(zhuǎn)座伴隨著轉(zhuǎn)座子拷貝數(shù)的添加。 1.保守轉(zhuǎn)座 某些細(xì)菌轉(zhuǎn)座子，包括很多IS元件和復(fù)合轉(zhuǎn)座子，都是經(jīng)過一種稱為剪切粘貼機(jī)制進(jìn)展轉(zhuǎn)座的。這種相對簡單的機(jī)制是一個保守的過程，即只需靶序列被復(fù)制，而原始的轉(zhuǎn)座子那么不發(fā)

22、生復(fù)制。2. 復(fù)制型轉(zhuǎn)座 進(jìn)展復(fù)制型轉(zhuǎn)座的轉(zhuǎn)座子除了具有編碼轉(zhuǎn)座酶的基因外，還具有編碼解離酶resolvase的基因以及解離酶的作用位點，即內(nèi)部解離位點internal resolution site, IRS。 69(四)真核生物DNA轉(zhuǎn)座子 1.玉米胚乳顏色的控制因子花斑色是由于突變呵斥的，而且這種突變不是常規(guī)突變，是與一種“控制因子controlling element)的存在引起的。2解釋假設(shè)有C基因，胚乳合成色素，呈紫色；假設(shè)C突變c，胚乳無色素，呈白色。在c胚乳的發(fā)育過程中，部分細(xì)胞發(fā)生恢復(fù)突變C，構(gòu)成色斑。突變發(fā)生的越早，色斑就越大。1雜交結(jié)論 McClintock以為原來的c突

23、變是由一個“可挪動的控制因子如今稱轉(zhuǎn)座子引起的，稱為Ds，即解離因子dissociator。它可以插入到C基因中。另一個可挪動的控制因子是Ac，稱激活因子activator，它的存在可以激活Ds轉(zhuǎn)座進(jìn)入C基因或其它基因，也能使Ds從基因中轉(zhuǎn)出，使得突變基因回復(fù)突變成野生型基因，這就是著名的Ac-Ds系統(tǒng)。3對突變的解釋：Ac-Ds系統(tǒng)為什么總是恢復(fù)突變、而且高頻率？McClintock以為C突變?yōu)閏是由于一個“可挪動的控制因子transposable controlling element的插入引起的，她稱之為Dsdissociator。 解離因子Ds另外還有一個控制因子Acactivator，它能激活： 激活因子AcDs插入C基因引起突變，或從C基因中轉(zhuǎn)出恢復(fù)突變。W: whiteC基因在插入位點上呵斥8bp的正向反復(fù)D