重癥肌無力CD45RA、CD45RO胸腺細胞亞群及相關(guān)細胞因子表達分析

1、重癥肌無力CD45RA、 CD45RO胸腺細胞亞群及相關(guān)細胞因子表達分析 作者：李倩如, 杜英, 趙航, 高峰, 張清勇, 張欽憲【摘要】 目的: 探討胸腺細胞異常分化與重癥肌無力發(fā)生的關(guān)系。方法: 采用基因芯片對多種白細胞介素、 干擾素及其受體mRNA表達進行分析, 采用流式細胞術(shù)測定胸腺細胞CD45RA、 CD45RO的表達率, 采用免疫組化對胸腺組織切片CD45RA、 CD45RO表達及分布進行檢測。結(jié)果: MG患者IL1R、 IL4R、 IFNR1、 IFNR2、 IL6、 IL8表達水平顯著低于對照組; IL10RB表達水平顯著高于對照組; IL1、 IL2、 IL4、 IL10、

2、IL7、 IFN、 IFN、 IFN表達水平在MG和對照組均很低, 無顯著差異; MG患者CD56+胸腺細胞百分率（0.560.33）顯著低于對照組（1.780.69）, MG患者CD45RO+、 CD1a+細胞顯著高于對照組。免疫組化和RTPCR也有相同結(jié)果。結(jié)論: MG患者胸腺細胞發(fā)育過程中CD45RO+細胞向CD45RA+T細胞轉(zhuǎn)變存在異常。 【關(guān)鍵詞】 白細胞介素; CD45RA; CD45RO; 重癥肌無力; 胸腺 重癥肌無力（myasthynia gravis, MG）是有顯著胸腺異常和T細胞功能異常的自身免疫性疾病。胸腺是T細胞發(fā)育成熟的場所, 胸腺細胞的發(fā)育受胸腺微環(huán)境中胸腺基

3、質(zhì)細胞、 胸腺激素和細胞因子的影響, 經(jīng)歷TCR基因重排、 CD4和CD8分子雙陰性、 雙陽性、 到單陽性細胞階段, 使T細胞由不成熟到成熟, 并獲得MHC限制性和自身耐受性。以往已有研究表明MG患者胸腺組織雙陽性細胞（CD4+CD8+）、 單陽性細胞（CD4+CD8-, CD4-CD8+）及細胞凋亡分子（CD95）表達均存在異常, MG胸腺組織可見生發(fā)中心, 可檢測到自身抗體（AchRab）1-3。但MG患者胸腺結(jié)構(gòu)和功能異常的機制至今尚不清楚。但對CD45RA、 CD45RO、 CD56、 CD1a分子表達的報道較少。為深入探討不同胸腺細胞亞群在MG發(fā)生中的作用, 我們對MG患者胸腺細胞多

4、種表面標志、 細胞因子及其受體進行了分析。 1 材料和方法 1.1 材料 研究對象為臨床確診并行手術(shù)切除胸腺的MG患者, 選擇胸腺增生型MG患者37例為實驗組, 男20例, 女17例; 年齡653 (26. 66 16. 29)歲。對照組為非自身免疫先天性心臟病患者, 共16例, 年齡445 (25. 37 12.32)歲。TRzol試劑為Invitrogen產(chǎn)品, FACScan 流式細胞儀為美國BD公司產(chǎn)品。FITC標記小鼠抗人CD56、 CD45RA、 CD45RO 單克隆抗體（mAb）, PE標記小鼠抗人CD1a、 HLADR mAb 及FITC、 PE標記同型免疫球蛋白IgG1FIT

5、C、 IgG2PE, 均購自美國Farmingen 公司。小鼠抗人CD3、 CD56、 HLADR mAb購自北京中杉公司。小鼠抗人CD25、 CD161、 CD45RO、 CD45RA mAb購自美國eBioscience公司。 1.2 方法 1.2.1 胸腺組織RNA提取 100 mg左右新鮮胸腺組織立即置于液氮, 加入1 mL TRIzol試劑, 用勻漿器進行勻漿, 依次加入0.2 mL的氯仿, 4 12 000 g離心15 min, 吸取上層水相, 加入0.5 mL的異丙醇, 混勻, 室溫孵育10 min, 4 12 000 g離心10 mn, 獲得RNA。電泳鑒定RNA質(zhì)量。-70保

6、存。 1.2.2 基因芯片分析白細胞介素、 干擾素及其受體mRNA表達 將胸腺組織勻漿分別采用TrueLabelingAMPTM線性RNA擴增試劑盒、 SuperArray ArrayGrade cRNA 純化試劑盒進行cDNA合成、 cRNA合成和cRNA純化, 采用Oligo GEArray芯片依次進行預(yù)雜交、 雜交、 洗膜, 采用化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(SuperArray Bioscience, Catalog Number D01)進行化學(xué)發(fā)光檢測, 采用GEArray Expression Analysis Suite進行芯片數(shù)據(jù)分析。 1.2.3 流式細胞術(shù)分析胸腺細胞表面標志 無菌

7、取1 g左右胸腺組織, 去筋膜、 血污后, 剪碎, 在100目不銹鋼網(wǎng)上輕柔研磨, 過200目無菌不銹鋼網(wǎng), 制成單細胞懸液, 經(jīng)淋巴細胞分離液2 000 r/min, 15 min離心分離出胸腺細胞。用PBS洗細胞2次, 調(diào)整細胞密度至109個細胞/L, 臺盼藍計數(shù)活細胞95%。取100 L細胞懸液分別用CD4FITC、 CD8PE、 CD56FITC、 CD95PE、 CD1aPE、 HLADRPE、 CD45RAFITC、 CD45ROPE進行雙標記或單標記, 另以未加抗體作陰性對照、 熒光標記的同型抗體作同型對照, 避光、 4、 孵育30 min, PBS漂洗2次, 懸浮細胞至200

8、L上機檢測。 1.2.4 胸腺組織的免疫組化分析 取1 g左右胸腺組織放入40 g/L多聚甲醛溶液固定, 將胸腺組織經(jīng)石蠟包埋、 切片。按免疫組化染色試劑盒(SP法北京中杉公司提供)說明書操作。進行CD3、 CD45RO、 CD45RA、 CD56和HLADR抗原檢測。DAB顯色劑顯色。 1.2.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件對計數(shù)資料行2檢驗, 計量資料行t檢驗。 2 結(jié)果 2.1 MG患者胸腺組織ILs、 IFN及其受體mRNA的表達 分別對MG患者和對照組胸腺組織進行多種ILs、 IFNs及其受體進行檢測, 如圖1。結(jié)果顯示, MG患者IL1R、 IL4R、 IFNR1、

9、IFNR2、 IL6、 IL8表達水平顯著低于對照組; MG患者胸腺IL10RB表達水平顯著高于對照組; IL1、 IL2、 IL4、 IL7、 IL10、 IL17、 IFN、 IFN及其受體、 IFN表達水平在MG和對照組均很低, 無統(tǒng)計學(xué)意義。 2.2 MG患者及對照組胸腺細胞CD45RA、 CD45RO、 CD56、 CD1a分子表達 結(jié)果顯示, MG患者胸腺細胞CD45RA+、 CD56+細胞明顯減少（P0.01）; CD45RO+、 CD1a+細胞顯著高于對照組（P0.01, 表1）。表1 MG患者及對照組胸腺細胞CD45RA、 CD45RO分子及CD56、 CD1a分子表達 2.

10、3 MG患者與對照組胸腺免疫組化結(jié)果比較 在MG患者和對照組胸腺組織CD45RA、 CD56分子均呈弱陽性表達( 圖2A); MG患者和對照組的顯著區(qū)別在CD45RO分子的表達, 前者呈強陽性表達, 且表現(xiàn)為灶狀分布（圖2B）。 3 討論 CD45RA和CD45RO是CD45分子的兩種異型, 屬I型跨膜蛋白, 是區(qū)分初始T細胞和記憶T細胞的標志。在外周血中, CD4+CD45RA+ T細胞為初始T細胞, 接觸抗原活化后可轉(zhuǎn)變?yōu)镃D4+CD45RO+ T細胞。CD4+CD45RO+ T細胞為記憶T細胞, 再次接觸抗原可迅速增殖, 具有較強輔助B 細胞合成IgG的能力。有研究報道, T細胞在胸腺發(fā)

11、育過程中也存在CD45RA/CD45RO轉(zhuǎn)換, 由CD45RO+轉(zhuǎn)換為CD45RA+可能標志著陰性選擇的完成4, 胸腺細胞的陰性選擇是排除自身反應(yīng)性T細胞、 防止自身免疫性疾病發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié), 亦即CD45RO+向CD45RA+的轉(zhuǎn)換可能與自身反應(yīng)性T細胞的排除有關(guān)。本研究顯示, MG患者胸腺細胞CD45RA表達明顯減少, CD45RO分子表達明顯增高, 在免疫組化染色中可見MG患者CD45RO分子表達呈灶狀分布, 提示MG患者T細胞在胸腺發(fā)育過程中存在CD45RO到CD45RA的轉(zhuǎn)變障礙, 并因此不能完成陰性選擇過程, 從而與自身免疫性MG的發(fā)生有關(guān)。 我們對多種細胞因子及其受體mRNA進行

12、檢測, 僅發(fā)現(xiàn)MG患者胸腺組織IL6和IL8 mRNA表達明顯低于非自身免疫病對照組, 其他Th1、 Th2、 Th17型細胞因子在MG患者和對照組均表達低下。細胞因子的檢測結(jié)果說明MG患者胸腺組織不存在Th細胞的異?；罨? 因此CD45RO+T細胞數(shù)量增多可能不是由于T細胞活化后分化為記憶細胞的結(jié)果, 而是由于胸腺細胞發(fā)育過程中CD45RO+向CD45RA+的轉(zhuǎn)變障礙。 我們在研究中還發(fā)現(xiàn), IL1R1、 IL1R2、 IL1RN、 IL4R、 IFNR2 mRNA表達明顯低于對照組, 說明MG患者胸腺細胞對IL1、 IFN反應(yīng)性低下; 而IL6、 IL8 mRNA明顯低于對照組, 說明MG

13、患者胸腺細胞和胸腺基質(zhì)細胞分泌IL6、 IL8能力降低, 導(dǎo)致MG患者對正常T細胞的促增殖能力和對T細胞的趨化能力降低; 研究中顯示MG患者胸腺IL10RB表達水平明顯高于對照組, 說明MG患者胸腺細胞對IL10的抑制作用敏感性增強。這些因素可能也與CD45RO+細胞向CD45RA+T細胞轉(zhuǎn)變障礙有關(guān)?！緟⒖嘉墨I】 1 Utsugisawa K, Nagane Y, Suzuki S, et al. Antigenspecific Tcell activation in hyperplastic thymus in myasthenia gravisJ. Muscle Nerve, 2007,

14、 36(1): 100-103.2 Aruna BV, Sela M, Mozes E. Downregulation of T cell responses to AchR and reversal of EAMG manifestations in mice by a dual altered peptide ligand via induction of CD4+CD25+ regulatory cellsJ. Neuroimmunol, 2006, 177(1-2): 63-75.3 Tackenberg B, Kruth J, Bartholomaeus JE, et al. Clonal expansions of CD4+ B helper T cells in autoimmune myasthenia gravisJ. Eur J Immunol