大白菜—結球甘藍單體異附加系AC4及其后代小孢子植株的合成與鑒定(共8頁)

1、大白菜結球甘藍(gnln)單體異附加系AC4及其后代(hudi)小孢子植株(zhzh)的合成與鑒定 董 輝，顧愛俠，王彥華，羅雙霞，秦艷梅，朱東旭，申書興，趙建軍基金項目：國家863計劃項目（2012AA100202）；國家自然科學基金項目（31101552，31171964，31171976）；國家教育部高校博士點基金項目（20101302120006；20101302110001；20121302110006）；河北省自然科學基金項目（C2014204093，C2013204118）；河北省高等學?？茖W技術研究項目（Z2010149）* 通信作者Author for corresponde

2、nce（E-mail : jjz1971） （河北農業(yè)大學園藝學院，河北保定 071000）摘 要：以大白菜結球甘藍異源三倍體（AAC，2n=29）與二倍體大白菜85-1（AA，2n=20）回交一代為材料，經過染色體核型分析，從中篩選出大白菜結球甘藍單體異附加系AC4；以AC4的親本大白菜85-1和結球甘藍11-1為試材，對位于結球甘藍C基因組9個連鎖群的902個InDel標記進行篩選，得到了結球甘藍相對于大白菜具有多態(tài)性的引物674個；利用多態(tài)性引物進一步對AC4及其后代小孢子植株進行鑒定，結果表明AC4外源甘藍遺傳物質主要來自甘藍連鎖群C05、以及小部分C08、C02、C03和C04；15

3、7份小孢子植株添加結球甘藍的片段數(shù)量分別為1-12個，其中含有單甘藍片段的植株數(shù)目為9個，占總體的5.73%。本研究結果為精確鑒定添加甘藍染色體片段的大白菜易位系及研究外源甘藍基因在大白菜遺傳背景中的表達奠定了基礎。關鍵詞：大白菜；結球甘藍；單體異附加系；InDel標記；小孢子植株Creation and Identification of Chinese cabbage-cabbage Monosomic Alien Addition Line AC4 and its progeny plants derived from microspore cultureDONG Hui，GU Ai-x

4、ia， WANG Yan-hua，LUO Shuang-xia, QIN Yan-mei，ZHU Dong-xu， SHEN Shu-xing，and ZHAO Jian-jun*（College of Horticulture，Agricultural University of Hebei，Baoding，Hebei 071000，China）Abstract: A monosomic addition line AC4 (Chinese cabbage with chromosome No. 4 from cabbage) derived from the 1st backcrossin

5、g generation between Chinese cabbage-cabbage allotriploid (AAC, 2n=29) and diploid Chinese cabbage (AA，2n=20) was obtained by cytology identification. DNAs from AC4 and its parents Chinese cabbage 85-1 and cabbage 11-1 were used for PCR screening, 674 polymorphic primers between 85-1 and 11-1 were i

6、dentified from 902 Indel markers. The AC4 progeny plants derived from microspors were further identified by polymorphic primers. The results showed that exogenous genetic component mainly contained a large part of chromosome C05 and a small part of chromosome C08、C02、C03 and C04. 1-12 Cabbage genomi

7、c segments were found from 157 plants derived from microspores, in which 9 plants had only one Cabbage genomic segment with percentage of 5.73%. This research would be useful for identifying precisely Chinese cabbage translocation lines introduced cabbage chromosome fragments, and for studying expre

8、ssion patterns of the exogenous Cabbage genes under Chinese cabbage genetic background. Key words: Chinese cabbage; Cabbage; InDel markers; Monosomic addition line; Microspore 異附加系（alien addition lines）是指通過人工(rngng)遠緣雜交，然后自交或回交，使作物的染色體組附加了異種或異屬的1條或幾條染色體而形成的植物新系統(tǒng)。根據(jù)附加到宿主基因組的染色體不同可分為單體異附加系、雙體異附加系、多重異附

9、加系或端體附加系。目前已經創(chuàng)建了多種作物（如小麥、燕麥、水稻、蔥、馬鈴薯、黃瓜、甜菜等）的異附加系（Barthes & Ricroch，2001；Gao et al.，2001；Ji & Chetelat，2003；Chen et al.，2004；Dong et al.，2005）。但是由于單體異附加系在遺傳上不平衡和配對重組，再加之不良連鎖(lin su)基因的導入，限制了它們自身作用的發(fā)揮。易位系是指一個物種的染色體與另一物種的染色體發(fā)生單向或相互易位的細胞或個體。與添加一條或一對外源染色體的異附加系或整條染色體替換的異代換系相比，由于易位系只導入了外源染色體的一個片段，能夠(nnggu

10、)穩(wěn)定遺傳，且?guī)нM不良性狀的機會也相對減少，所以在獲得異附加系的基礎上進一步培育異源易位系至關重要。本研究以大白菜結球甘藍的異源三倍體（AAC，2n =29）與大白菜親本85-1的回交一代為材料，通過細胞學分析獲得了添加結球甘藍4號染色體的大白菜結球甘藍單體異附加系AC4，并通過InDel分子標記對AC4及其后代小孢子植株進行了鑒定，為大白菜結球甘藍易位系的獲得提供材料，為蕓薹屬植物遺傳改良提供重要的參考。1 材料與方法1.1 材料大白菜親本85-1（AA，2n =20）、結球甘藍親本11-1（CC，2n = 18）、大白菜結球甘藍的異源三倍體（AAC，2n =29）與大白菜親本85-1的回交

11、一代，均由河北省蔬菜種質創(chuàng)新與利用實驗室提供。1.2 方法1.2.1 無性系建立與根尖細胞染色體數(shù)目鑒定將異源三倍體與大白菜回交獲得的種子經滅菌后接于1/2MS 培養(yǎng)基上生根培養(yǎng)，根長至1.01.5 cm 左右時，切取根尖放2 mmol/L 的8-羥基喹啉中預處理2 h，轉至卡諾氏液于4固定24 h，再轉至70%乙醇中4 保存?zhèn)溆谩８庥?0下1 mol/L 鹽酸解離810 min，采用丙酸-鐵-水合三氯乙醛-蘇木精法染色，常規(guī)壓片鏡檢選取分散好的分裂相，染色體計數(shù)，統(tǒng)計至少10個以上細胞作為該植株的染色體數(shù)并拍照。將經鑒定染色體數(shù)目為21 條的植株接種到MS 培養(yǎng)基上繼代擴繁，建立無性系。1

12、.2.2核型分析對2n=21的回交后代植株進行核型分析，參照李懋學等的核型分析方法（李懋學和張贊平，1996），選取分散良好、染色體形態(tài)和著絲點清晰的中期染色體分裂相，用SPOTTM Advanced軟件進行臂長測量，用Photoshop軟件進行同源染色體配對排列，除隨體染色體外， 按染色體相對長度由大到小排序，結合鏡檢時染色體形態(tài)觀察結果，參照申書興等（2006）核型分析的方法，鑒定染色體類別。1.2.3小孢子(boz)植株的獲得大白菜結球甘藍(gnln)單體異附加系AC4組培苗于2012 年1月移栽到溫室，3月定植到田間，常規(guī)管理。在異附加系開花初期，挑選適宜大小的花蕾進行小孢子培養(yǎng)(pi

13、yng)（申書興 等，1999），2025 d調查胚狀體誘導率（出胚數(shù)/花蕾數(shù)），待胚發(fā)育成子葉型，光照培養(yǎng)4872 h，并轉接至固體培養(yǎng)基內進行植株再生培養(yǎng)，統(tǒng)計植株再生率（成苗數(shù)/出胚數(shù)）。將獲得的小孢子植株移接到1/2MS生根培養(yǎng)基上，于2013年1月將小孢子植株定植于溫室。1.2.4 InDel（insertion-deletion）分析DNA提取采用改良的CTAB法，并用0.8%的瓊脂糖對提取的DNA進行檢測。根據(jù)白菜和甘藍基因組序列信息，開發(fā)甘藍相對于白菜特異的InDel（insertion-deletion）標記，序列由中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所提供，選取均勻的分布于甘藍9個連

14、鎖群的902個InDel標記，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。PCR反應總體系10 L，體系中各組分含量為：10PCR Buffer (含Mg2+)1 L，2.5 mmol L-1 dNTPs 0.8 L，2.5 U L-1Taq酶0.2 L，50 ng L-1正向引物0.5 L， 反向引物0.5 L，30 ng L-1模板DNA 1.5 L，其它用滅菌雙蒸水補齊。PCR擴增程序：94 預變性3 min，94 變性45 s，60 退火30 s，72 延伸45 s，此后每個循環(huán)退火溫度降低0.5 ，共計10個循環(huán)，94 變性45 s，55 退火30 s，72 延伸45 s，25個循環(huán)

15、，72 延伸5 min，4 保存。擴增產物采用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，采用銀染法檢測，并拍照。2 結果與分析2.1 單體異附加系AC4的獲得及核型鑒定采用根尖細胞染色體中期計數(shù)法，對回交一代75個植株染色體數(shù)目進行了鑒定，染色體數(shù)目為21 條的有4個株系。本研究對染色體數(shù)目為21條的A-2株系進行了核型分析和附加染色體的鑒定。株系A-2的核型（表1，圖1ab）由6個中部著絲點染色體(1、2、4、5、7 和11號)、4 個近中部著絲點染色體(3、6、8 和9 號)和1個近端部著絲點隨體染色體（10號）組成，其中11號染色體與其它任何染色體的形態(tài)特征和臂比值都不同。根據(jù)核型分析，判斷11號

16、染色體為甘藍的染色體，其臂比值（1.21） 與結球甘藍2 號（1.20）、4號染色體臂比（1.29）和7號染色體臂比（1.26）相近。該染色體長度小于大白菜2 號染色體，長于大白菜3 號染色體，結合對異源三倍體根尖體細胞中期染色體觀察可知，在同一細胞內結球甘藍的2 號染色體在長度上長于大白菜2號染色體，因此排除外源染色體為結球甘藍2 號染色體的可能，而結球甘藍7 號染色體又短于大白菜3號染色體，因此確定株系A-2 為附加結球甘藍4 號染色體的大白菜結球甘藍單體異附加系，記作AC4。表1株系A-2根尖細胞中期染色體的核型參數(shù)Table 1 Major characters of karyotyp

17、e of A-2root tip chromosomes at metaphase染色體序號No. of Chromosome染色體平均相對長度（LS）Average Relative Length（%）臂比值（L/S）Average Arm Ratio著絲點類型Centromere Type18.93+6.43=15.361.39m27.07+5.03=12.101.41m37.16+3.98=11.141.80sm45.72+4.73=10.451.21m55.77+3.90=9.661.48m65.68+2.92=8.601.94sm75.17+3.06=8.231.69m84.61+2

18、.31=6.921.99sm94.13+2.12=6.251.95sm108.50+2.81=11.313.03st(SAT)11*6.18+5.11=11.291.21sm注：“SAT“為隨體染色體，其相對長度和臂比為不帶隨體計入(j r)數(shù)據(jù)， *異附加(fji)染色體。NOTE：“SAT“ represents the satellite chromosome， and the values of Relative length and Arm ratio dont include the length of satellites. *the alienaddition chromoso

19、me.ab圖1.株系A-2根尖細胞核型分析(fnx)Fig.1 Karyotype of line A-2 at mitosis metaphase2.2 單體異附加系AC4后代小孢子植株的獲得對大白菜結球甘藍單體異附加系AC4適宜大小的花蕾進行了游離小孢子培養(yǎng)，其胚狀體誘導率和植株再生率分別為7.2個蕾-1和48.8%（圖2AB），共157個胚狀體發(fā)育成植株（圖2C）。BCA圖2 異附加系AC4小孢子植株(zhzh)再生過程A：胚狀體；B：成熟的胚狀體轉接(zhun ji)生長；C：再生(zishng)植株。Fig. 2 Plant regeneration with microspore

20、culture in AC4monosomic alien addition linesA：Microspore-derived embryos；B：Regenerated shoots；C：Regenerated plant.2.3 單體異附加系AC4的InDel標記鑒定選用均勻分布于結球甘藍的9個連鎖群的902個InDel標記，對大白菜結球甘藍單體異附加系AC4的親本二倍體大白菜85-1、結球甘藍11-1進行PCR擴增，篩選出674個結球甘藍相對于大白菜的特異InDel標記：涉及甘藍的 9個連鎖群，其中位于C01連鎖群54個，C02連鎖群81個，C03連鎖群93個，C04連鎖群44個，C0

21、5連鎖群117個，C06連鎖群51個，C07連鎖群 39個，C08連鎖群140個，C09連鎖群55個。利用674個多態(tài)性標記對單體異附加系AC4的鑒定結果表明，AC4中擴增出外源甘藍片段的InDel標記共計88個，涉及甘藍的4個連鎖群（圖3）：大部分標記（69個）位于C05連鎖群，其次為C08連鎖群14個，C02連鎖群3個，C03連鎖群1個，C04連鎖群1個。88個InDel標記的擴增條帶結果可分為兩類（圖3）：（1）單體異附加系AC4只與甘藍含有單一相同的擴增產物（圖3A），標記數(shù)為47個；（2）單體異附加系AC4同時含有白菜與甘藍的擴增產物（圖3B），標記數(shù)為41個。A1 2 3B1 2

22、3圖3單體異附加系AC4的兩類鑒定結果1：大白菜85-1； 2：結球甘藍11-1；3：單體異附加系AC4 Fig.3 The two types of amplification results of monosomic alien addition line AC41： Chinese cabbage 85-1；2：Cabbage11-1；3：Monosomic alien addition line AC42.4 單體異附加系AC4后代小孢子植株的InDel標記鑒定根據(jù)篩選出的88個多態(tài)性標記的染色體物理位置，選取29個對單體異附加系AC4的157份后代小孢子植株進行鑒定，初步確定后代小孢

23、子植株中導入的外源甘藍片段（圖4）。通過29個標記（圖3橫向）對157份小孢子植株（圖3縱向）的擴增結果分析，后代小孢子植株的大部分遺傳物質來自受體大白菜（藍色A），每個單株中均含有外源甘藍遺傳物質（黃色C）；外源甘藍片段的大小和位置各有不同，主要集中在C05連鎖群；各單株攜有結球甘藍染色體片段數(shù)量為1-12個，其中含有1個片段的植株為9個，占總體的5.73%。含有2個片段的植株數(shù)目為20個，占總體的12.74%。含有3個片段的植株數(shù)目最多，為28棵，占總體的17.83%。此外，在部分小孢子植株中還存在著一些特殊位點（白色M），該位點既沒有甘藍擴增產物也沒有白菜擴增產物。 A C M圖4多態(tài)性

24、InDel標記(bioj)對小孢子植株的鑒定橫向(hn xin)：為位于甘藍不同連鎖群的29個特異(ty)標記；縱向：157份AC4小孢子植株；藍色(A)：該標記位點僅有白菜擴增產物；黃色(C)：該標記位點有甘藍擴增產物；白色(M)：無擴增產物Fig.4 The identification of polymorphic InDel markers in the microspore derived plantsHorizontal direction represents 29 specific markers located at different linkage groups of c

25、abbage ; Vertical direction represents 157 AC4 progeny plants derived from microspores; Blue bar (A) represents this marker-site only has Chinese cabbage amplification production; Yellow bar(C) represents this marker-site has cabbage amplification production; White bar(M) represents this marker-site

26、 has no amplification production討論自20世紀50年代以來，育種學家和遺傳學家一直致力于小麥異源易位系創(chuàng)制方法的研究，在遠緣雜交、回交后代群體中可檢測到由自發(fā)產生的易位，稱為自發(fā)易位，除了自發(fā)易位以外還可以利用電離輻射、部分同源配對控制體系、組織培養(yǎng)、殺配子染色體等方法誘導易位系的產生（Chen et al.，2013；Klindworth et al.，2012；Xie et al.，2012；Li et al.，2013）。傳統(tǒng)的易位系創(chuàng)制方法周期較長、效率不高，李瑞芬等（2006）采用單體異附加系花藥培養(yǎng)方法創(chuàng)制了小麥中間偃麥草純合易位系。與花藥培養(yǎng)相比，

27、游離小孢子培養(yǎng)具有不受母體組織影響，一次培養(yǎng)產胚量大等優(yōu)點，能夠顯著提高純合易位系的獲得率，本研究以大白菜結球甘藍單體異附加系AC4為材料，對其進行游離小孢子培養(yǎng)，共得到了157個后代株系，為純合穩(wěn)定的易位系的獲得提供材料。隨著蕓薹屬植物基因組學的發(fā)展，各種新型的分子標記被開發(fā)應用，如InDel標記，具有開發(fā)簡單(jindn)、擴增產物穩(wěn)定和易于檢測等優(yōu)點，能夠(nnggu)滿足精細定位的需要。本研究利用674個結球甘藍與白菜(bici)具有多態(tài)性的InDel標記，對大白菜結球甘藍單體異附加系AC4進行鑒定，并從中挑選出29個標記對異附加系AC4后代小孢子植株進行鑒定，對后代中的外源甘藍片段分

28、布進行了初步的分析，對今后易位系的精確鑒定和外源甘藍遺傳物質對大白菜遺傳背景的影響等研究奠定了基礎。ReferencesBarthes L，Ricroch A. 2001. Interspecific chomosomal arrangements in monosomic addition lines of Allium. Genome，44：929935.Chen J F，Luo X D，Qian C T，Molly M J，Staub J E，Zhuang F Y，Lou Q F，Ren G. 2004. Cucumis monosomic alien addition lines：mo

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