胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白相關(guān)蛋白1在活化肝星狀細(xì)胞中的表達(dá)及意義

1、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白相關(guān)蛋白1在活化肝星狀細(xì)胞中的表達(dá)及意義 作者：劉立新 張騫騫 郭曉紅 趙嘉慧 韓德五 【摘要】 目的 研究胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白相關(guān)蛋白1(insulinlike growth factor binding proteinrelated protein1，IGFBPrP1)在轉(zhuǎn)化生長因子1(tronstorming growth factor 1,TGF1)誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞中表達(dá)的變化及抗IGFBPrP1抗體對TGF1誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞產(chǎn)生型膠原的影響。方法 大鼠肝星狀細(xì)胞株(HSCT6)體外培養(yǎng)，分別設(shè)空白對照組(加入等量PBS)、不同濃度的TGF1處理組、不同濃度

2、的抗IGFBPrP1抗體處理組，處理因素作用24 h，采用免疫組織化學(xué)染色、Western blot檢測IGFBPrP1在HSCT6中的表達(dá)，ELISA檢測型膠原的含量并進(jìn)行IGFBPrP1與型膠原的相關(guān)性分析。結(jié)果 TGF1各處理組IGFBPrP1的表達(dá)均較空白對照組顯著增強(qiáng)?？笽GFBPrP1抗體可以拮抗TGF1誘導(dǎo)的HSCT6產(chǎn)生的過多型膠原。IGFBPrP1與型膠原呈正相關(guān)(r=0.833，P0.01)。結(jié)論 IGFBPrP1參與了肝纖維化的形成，且可能在肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展中占有重要地位。 【關(guān)鍵詞】 胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白相關(guān)蛋白1； 肝星狀細(xì)胞； 轉(zhuǎn)化生長因子1； 型膠原 【A

3、bstract】 Objective To study the expression of insulinlike growth factor binding proteinrelated protein1 (IGFBPrP1) in TGF1 induced hepatic stellate cell and the effects of antiIGFBPrP1 antibody on the collagen production of TGF1 induced hepatic stellate cell. Methods Rat hepatic stellate cell line (

4、HSCT6) was cultured in vitro, and then was incubated with phosphate buffered solution (blank control group), TGF1 at 2 g/L or 4 g/L (TGF1 group), antiIGFBPrP1 antibody at 0.1 g/L, 1 g/L or 2 g/L (antiIGFBPrP1 antibody group) or both (TGF1+antiIGFBPrP1 antibody group). Twentyfour hours later, the exp

5、ression of IGFBPrP1 in HSCT6 was detected by immunohistochemical staining and western blotting; the content of collagen in culture supernatant of HSCT6 was measured by ELISA; the relationship between IGFBPrP1 and collagen was analyzed. Results The expression of IGFBPrP1 in TGF1 group was significant

6、ly higher than that in blank control group. The result of ELISA showed that antiIGFBPrP1 antibody antagonized the overproduction of collagen by TGF1 induced HSCT6. There was a positive correlation between IGFBPrP1 and collagen (r=0.833, P0.01). Conclusions IGFBPrP1 may play an important role in the

7、formation and development of liver fibrosis. 【Key words】 IGFBPrP1; Hepatic stellate cell; TGF1; Collagen 近年來對肝硬化的治療仍未有突破性的進(jìn)展，因此， 推斷肝硬化的發(fā)病機(jī)制中可能還有其他未知因素的參與1。胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白相關(guān)蛋白1(insulinlike growth factor binding proteinrelated protein1，IGFBPrP1)即IGFBP7(又名mac25)是一種具有生物活性的蛋白2。本實(shí)驗(yàn)旨在進(jìn)一步明確IGFBPrP1在肝硬化、肝纖維化發(fā)生及

8、發(fā)展中的作用，為臨床尋找肝硬化、肝纖維化新的治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。 1 材料與方法 1.1 細(xì)胞與主要試劑 大鼠肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HSC)株(HSCT6)由美國Professor Friedman S.L.惠贈；轉(zhuǎn)化生長因子1(tronstorming growth factor 1,TGF1)為英國Peprotech公司產(chǎn)品；免疫組織化學(xué)染色及Western blot檢測所用一抗IGFBPrP1山羊抗人多克隆抗體，Western blot檢測所用驢抗山羊二抗，內(nèi)參照肌動蛋白均為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品；免疫組織化學(xué)染色所用抗山羊二抗為免疫組化試劑

9、盒(SP法)提供，與二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒均購自福建邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司；牛血清白蛋白(BSA)為美國Roche公司產(chǎn)品；分子量標(biāo)記(Protein Marker)為立陶宛MBI公司產(chǎn)品；PVDF膜為美國SABC公司產(chǎn)品；胞質(zhì)胞核蛋白抽提試劑盒購自北京普利萊技術(shù)有限公司； 型膠原的ELISA定量檢測試劑盒為北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。 1.2 處理因素的分組及添加 吸棄舊HSCT6培養(yǎng)液后換含0.3%胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，同時(shí)加入處理因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組。分為空白對照組(加入等量PBS)、TGF1 2、4、8、16 g/L組，處理細(xì)胞24 h(預(yù)實(shí)驗(yàn)中曾處理過6、12、24、

10、36及48 h，其中以24 h時(shí)IGFBPrP1表達(dá)變化最為顯著)后收集細(xì)胞爬片；重復(fù)處理1次，提取細(xì)胞質(zhì)蛋白，分別進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色及Western blot分析； 空白對照組、 TGF1 2、 4 g/L組、抗IGFBPrP1抗體0.1、 1、 2 g/L組及TGF1 2 g/L+抗IGFBPrP1抗體0.1 g/L、 TGF1 2 g/L+抗IGFBPrP1抗體1 g/L、TGF1 2 g/L+抗IGFBPrP1抗體2 g/L、TGF1 4 g/L+抗IGFBPrP1抗體0.1 g/L、TGF1 4 g/L+抗IGFBPrP1抗體1 g/L組，處理HSCT6 24 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)液上

11、清進(jìn)行ELISA檢測。 1.3 免疫組織化學(xué)染色檢測HSCT6中IGFBPrP1的表達(dá) 細(xì)胞爬片用1%多聚甲醛固定5 min，內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑孵育以滅活內(nèi)源性過氧化物酶，PBS洗滌后，以正常非免疫動物血清封閉，之后以IGFBPrP1抗體(1200)孵育過夜，經(jīng)PBS洗滌，生物素標(biāo)記的抗山羊IgG抗體孵育，經(jīng)PBS洗滌，過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素抗生物素孵育，經(jīng)PBS洗滌，DAB顯色。以PBS代替IGFBPrP1抗體(一抗)作空白對照染色。圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像半定量分析，采用每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野(200)，測定細(xì)胞中棕黃色和棕褐色陽性表達(dá)顆粒的累積光密度(interrated optica

12、l density,IOD)值。各組實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。1.4 Western blot分析IGFBPrP1表達(dá) 將培養(yǎng)上清液去掉，PBS洗1遍，用0.25%胰蛋白酶消化HSCT6，收集所有細(xì)胞后離心，向經(jīng)離心后得到的100 l細(xì)胞沉淀中加入500 l細(xì)胞質(zhì)裂解液裂解蛋白質(zhì)。取30 l總蛋白含量的裂解液進(jìn)行15%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺(SDSPAGE)凝膠電泳。經(jīng)PVDF膜轉(zhuǎn)移。5%牛血清白蛋白TBST液(TBS0.1% Tween 20)封閉3 h，以IGFBPrP1抗體(1500)孵育過夜，洗滌，再以辣根過氧化物酶偶聯(lián)的第二抗體作用3 h，洗滌后DAB顯色。以同一張蛋白印跡膜洗滌后，再以肌動蛋

13、白孵育雜交，作為內(nèi)參照。計(jì)算機(jī)圖像掃描分析，測定灰度值(A)，經(jīng)內(nèi)參照肌動蛋白校正后得到蛋白的相對表達(dá)量。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3批不同樣本以上。 1.5 ELISA法檢測HSCT6培養(yǎng)液上清中型膠原的含量 收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清為待測樣本，檢測步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。各組實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。 1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均以s表示，采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行ANOVA單因素方差分析，組間差異用SNKq檢驗(yàn)，相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2 結(jié)果 2.1 IGFBPrP1在HSCT6中的表達(dá) 各組細(xì)胞均可見胞質(zhì)內(nèi)棕黃色或棕褐色顆粒沉積，IGFBPrP1呈陽性表達(dá)，但程度

14、有所不同?？瞻讓φ战M著色細(xì)胞數(shù)量少且顏色淺，而TGF1各處理組內(nèi)大部分細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)呈棕黃甚或棕褐色著色，以TGF1 4 g/L組陽性細(xì)胞數(shù)量最多且著色最深，見圖1。Western blot分析見圖2。 IGFBPrP1 IOD值和A值在空白對照組呈低表達(dá)，實(shí)驗(yàn)各組較空白對照組增加，在TGF1 2、4 g/L組中呈劑量依賴關(guān)系，但TGF1超過4 g/L IGFBPrP1反而下降(表1)。 2.2 HSCT6中IGFBPrP1與 型膠原的相關(guān)性分析 直線相關(guān)回歸分析表明，IGFBPrP1與型膠原呈正相關(guān)(r0.833，P4 g/L)組IGFBPrP1的表達(dá)反而降低，推測可能是因?yàn)殡S著HSCT6的不斷

15、活化，HSC自分泌TGF1逐漸增加，外源性TGF1刺激細(xì)胞表達(dá)IGFBPrP1的增幅下降，完全活化的HSCT6內(nèi)源性TGF1較高，對外源性TGF1反應(yīng)性下降所致。這也說明了肝纖維化過程中HSC與TGF1存在著相互制約、相互促進(jìn)的關(guān)系。 HSC是細(xì)胞外基質(zhì)的重要來源細(xì)胞8。TGF1刺激活化的HSC最明顯的靶效應(yīng)是誘導(dǎo)HSC大量合成型膠原等，阻斷TGF1在HSC內(nèi)的信號傳導(dǎo)途徑可抑制這種靶效應(yīng)。我們選擇以HSCT6培養(yǎng)上清液中型膠原的檢出量代表膠原的分泌量，觀察到即使正常培養(yǎng)的HSCT6(已有活化)，型膠原分泌量的背景值已較高，但TGF1仍可促進(jìn)HSCT6分泌型膠原，比未用TGF1 處理的HSCT

16、6分泌型膠原明顯增多。同時(shí)，我們對經(jīng)TGF1作用后IGFBPrP1表達(dá)的增加與型膠原分泌量的增多進(jìn)行了相關(guān)性分析，顯示IGFBPrP1的高表達(dá)與型膠原分泌量的增多呈正相關(guān)?？笽GFBPrP1抗體對TGF1刺激的HSCT6分泌型膠原有顯著抑制作用， 其中以抗IGFBPrP1抗體1 g/L作用于TGF1 4 g/L最為顯著。這表明抗IGFBPrP1抗體可拮抗由TGF1誘導(dǎo)HSC過表達(dá)的型膠原，該抗體可以拮抗TGF1促肝纖維化的效應(yīng)；也從另一方面說明IGFBPrP1在肝纖維化形成過程中可能起著非常重要的作用?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 Wynn TA. Common and unique mechanisms

17、 regulate fibrosis in various fibroproliferative diseases. J Clin Invest,2007,117(3):524-529.2 Ruan W, Xu E, Xu F, et al. IGFBP7 plays a potential tumor suppressor role in colorectal carcinogenesis. Cancer Biol Ther,2007,6(3):354-359.3 Parsons CJ, Takashima M, Rippe RA. Molecular mechanisms of hepat

18、ic fibrogenesis. J Gastroenterol Hepatol,2007,22 Suppl 1:S79-84.4 Kisseleva T, Brenner DA. Hapetic stellate cells and the reversal of fibrosis. J Gastroenterol Hepatol,2006,21 Suppl 3:S84-87.5 Wolf E, Schneider MR, Zhou R, et al. Functional consequences of IGFBP excesslessons from transgenic mice. Pediatr Nephrol,2005,20(3):269-278.6 Boers W, Aarrass S, Linthorst C, et al. Transcriptional prof