多重 PCR 檢測耐萬古霉素腸球菌的基因型研究

1、多重 PCR 檢測耐萬古霉素腸球菌的基因型研究【摘要】目的：研究7株耐萬古霉素腸球菌VRE耐藥表型和基因型，引導臨床公正利用抗生素。要領：接納瓊脂挑選法挑選VRE，并別離用Etest、多重PR和限定性長度多態(tài)性闡發(fā)要領檢測萬古霉素耐藥或中介腸球菌株的表型和基因型。效果：7株對萬古霉素耐藥或中介的腸球菌株，2株為vanA型，3株為van1型，1株為van2/3型，1株基因型未明，基因型和表型同等。結論：7株VRE中有2株vanA型，提示實行室正確檢測VRE對臨床上公正利用抗生素和防范VRE的盛行黑白常緊張的?！娟P鍵詞】萬古霉素；耐藥性；腸球菌；表型；基因型KeyrdsVanyin;Resista

2、ne;Enterus;Phentypes;Gentypes比年來萬古霉素耐藥腸球菌Vanyin-resistantenteri,VRE熏染不竭上升，美國2022年對670家病院的耐藥監(jiān)測表現(xiàn)VRE位于病院耐藥菌第2位1。其耐藥機制為細菌細胞壁布局改變，萬古霉素與之親協(xié)力落落，基因分型至少有vanA、vanB、van、vanD和vanE等型別。腸球菌可引起菌血癥、心內(nèi)膜炎以及泌尿系、腹腔和傷口熏染。本實行接納多重PR技能對腸球菌耐萬古霉素基因舉行了檢測，以滿意臨床快速、特異的檢測耐萬古霉素基因漫衍及盛行病學研究。1質料和要領1.1菌株泉源尺度菌株：AT29212糞腸球菌；參考菌株：vanA、va

3、nB、van1和van2等4株VRE菌株均由上海第二醫(yī)科大學隸屬瑞金病院惠贈。1.2抗生素紙片萬古霉素、替考拉寧藥敏紙片和Etest試紙條別離購自xid和ABBidisk公司。1.3重要試劑GPI斷定卡購自生物梅里埃公司；-H瓊脂、腦心浸液造就基購自xid公司；Taq酶及dNTPs等購自上海英俊公司；引物：vanA，vanB，van1和van23由上英俊公司合成。引物序列vanA：P1:5，-ATGAATATGGTAAAAT-3，P2:5，-ATGAATATGGTAAAAT-3，885bp；vanB：P1:5，-ATGATGTGTGGTAAAAT-3，P2:5，-AGGGAGRGTATTGA-

4、3，885bp；van1：P1:5，-GATGGAGTATAAGGA-3，P2：5，-GTGATGTGGGTG-3，467bp；van2/3：P1:5，-GATGGAGTATAAGGA-3，P2:5，-ATGAAAAAGGTTA-3，429bp2。1.4重要實行儀器VITEK-32AS微生物斷定體系，生物梅里埃公司；DNA擴增儀，J公司；GeneGENIUS全主動凝膠圖像闡發(fā)體系，SYNGENE公司。1.5菌株斷定用VITEK-32AS微生物斷定體系和GPI斷定卡斷定腸球菌。1.6藥敏試驗紙片擴散法和Etest按美國臨床實行室尺度化委員會2022年版操縱和斷定效果。1.7細菌DNA提取將細菌接

5、種在平凡營養(yǎng)瓊脂LB液體造就基中，35留宿。取1.5L菌液倒入eppendrf管中，12000r/in離心5in，去上清，用80LDNA提取液將細菌重懸，混勻，100水浴20in后，取出并敏捷置于冰上，安排10in，10000rp/in離心1in，上清即為模板。1.8多重聚合酶鏈反響PR反響體積50L，含引物混淆液8L取vanA-FR10pl/L，vanB-FR10pl/L，van1-REV10pl/L，van23-REV10pl/L各20L；vanAB-REV10pl/L，van123-FR10pl/L各40L于1.5L離心管中充實混淆，dNTPs2L，模板3L，Taq酶1.25U。PR反響

6、條件：94預變性5in，9445s，5045s，722in共30個循環(huán)，末了1個循環(huán)后72延伸7in，擴增產(chǎn)物參加1%的瓊脂糖凝膠，電泳后在全主動凝膠圖像闡發(fā)體系下照相不雅察。1.9限定性內(nèi)切酶酶切對陽性片斷用spI酶切斷定分型，酶切體系20L，此中2L內(nèi)切酶緩沖液、2LBSA、1LspI、5L無菌水和10LPR產(chǎn)物，將樣本置于37水浴中酶切1h。產(chǎn)物參加3%的瓊脂糖凝膠，電泳后在全主動凝膠圖像闡發(fā)體系下照相不雅察。2效果2.1腸球菌耐萬古霉素瓊脂挑選效果7株VRE均在含6L/L萬古霉素的BHI挑選平板上生長，此中1株為糞腸球菌，2株為屎腸球菌，3株為鶉雞腸球菌，1株為鉛黃腸球菌。2.2Ete

7、st效果對3株挑選出的腸球菌和4株自然耐藥腸球菌3株鶉雞腸球菌和1株鉛黃腸球菌，用Etest測定其對萬古霉素和替考拉寧的最小抑菌濃度I，見表1。2.3基因檢測效果7株VRE用多重PR和限定性內(nèi)切酶酶切要領舉行耐藥基因檢測，效果2株為vanA型，3株為van1型，1株為van2/3型，1株基因型未明。3討論自1986年美國陳訴耐萬古霉素腸球菌以來，天下各國相繼陳訴VRE產(chǎn)生與盛行環(huán)境，到2001年美國VRE產(chǎn)生率達15%擺布，為環(huán)球之冠，其他國度VRE在5%擺布3。腸球菌耐糖肽類藥物機制重要在于細菌細胞壁肽聚糖前體5肽側鏈末了D-丙氨酸-D-丙氨酸產(chǎn)生改變，藥物與之親和力低落，細胞壁合成不再被按

8、捺而耐藥，迄今創(chuàng)造的耐藥基因型重要有vanA、vanB、van、vanD和vanE，如今研究最多的重要是vanA、vanB、van基因型，此中vanA對萬古霉素和替考拉寧均呈高程度耐藥，vanB對萬古霉素呈差異程度耐藥，對替考拉寧敏感，該兩型為得到性耐藥，而van為自然耐藥，但其耐藥程度低，且大多產(chǎn)生于非致病腸球菌如鶉雞腸球菌、鉛黃腸球菌，臨床代價有限4。本次實行挑選出7株耐萬古霉素腸球菌，此中1株糞腸球菌基因型不明，2株屎腸球菌，表型及基因型均證明為vanA型，3株自然耐藥型鶉雞腸球菌和1株鉛黃腸球菌，基因型為別為van1和van2/3，與表型同等。可見針對VRE應保持高度鑒戒，范例臨床抗生

9、素公正利用，開展耐藥監(jiān)測與耐藥機制研究，有利于制止VRE盛行和播散。如今耐萬古霉素腸球菌實行室檢測重要有藥敏紙片法、瓊脂挑選法、主動儀器法和分子生物學等要領。差異要領檢測效果偶然存在較大差異。據(jù)文獻報道，藥敏紙片法在檢測van型腸球菌時輕易漏檢，而瓊脂挑選法和分子生物學要領檢測VRE菌株敏感率較高5。本實行表現(xiàn)1株鶉雞腸球菌，多重PR檢測效果是van1型，但藥敏紙片法為陰性。多重PR檢測創(chuàng)造1株基因型不明菌株，有待進一步研究?！緟⒖嘉墨I】1DiekeaDJ,BtsillerBJ,VaughnTE,etal.AntiirbialresistanetrendsandutbreakfrequenyinUnitedStateshspitalsJ.linInfetDis,2022,38(1):78-852PatelR,UhlJR,KhnerP,etal.ultiplexPRdetetinfvanA,vanB,van-1,andvan-2/3genesinenteriJ.Jlinirbil,1997,35(3):703-7073PtlalJ,NeuJ,rightGD.GlypeptideantibitiresistaneJ.AnnRevPharalTxil,2002,42(4):381-4084Arthur,QuintilianiRJR.RegulatinfvanA-andvanB