生物制藥第八章多肽與蛋白質(zhì)類藥物2

1、生物制藥第八章多肽與蛋白質(zhì)類藥物2三、干擾素 干擾素(Interferon，IFN)最早是由英國(guó)科學(xué)家Isaacs和Lindemann于1957年在研究病毒干擾現(xiàn)象時(shí)發(fā)現(xiàn)的。1965年發(fā)現(xiàn)了白細(xì)胞干擾素，1969年發(fā)現(xiàn)了致敏細(xì)胞干擾素。 3.1 干擾素的定義 1980年，國(guó)際干擾素命名委員會(huì)對(duì)干擾素下的定義為：干擾素是一種在同種細(xì)胞上具有廣譜抗病毒活性的蛋白質(zhì)?，F(xiàn)在，一般指脊椎動(dòng)物細(xì)胞受干擾素誘生劑作用后合成的一類具有細(xì)胞功能調(diào)節(jié)作用的蛋白。 3.2 分類干擾素在整體上不是均一的分子，可根據(jù)其來(lái)源細(xì)胞不同，分為白細(xì)胞干擾素(IFN-)、類淋巴細(xì)胞干擾素(IFN-與IFN-的混合物)、成纖維細(xì)胞

2、干擾素(IFN-)、T 細(xì)胞干擾素(IFN-)等幾類。IFN型干擾素又以其結(jié)構(gòu)不同再分為IFNb、IFN和IFNb等亞型。3.3 干擾素的作用抑制病毒等細(xì)胞內(nèi)微生物的增殖；抗細(xì)胞增殖，通過(guò)作用于巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、H淋巴細(xì)胞而進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)；改變細(xì)胞表面的狀態(tài)，使負(fù)電荷增加，組織相容性抗原表達(dá)增加；增加細(xì)胞對(duì)雙鏈DNA的敏感性。3.4 傳統(tǒng)方法生產(chǎn)干擾素傳統(tǒng)方法生產(chǎn)工藝流程：利用血庫(kù)血大量制備人血細(xì)胞干擾素。 工藝過(guò)程及控制要點(diǎn) 分離灰黃層 取新鮮血液(一般每份400ml)，加入ACD抗凝劑，離心后分離出血漿，小心吸取灰黃層。每份血可吸取1315ml，放置4冰箱中過(guò)夜。 氯化銨處理每

3、份灰黃層加入30ml緩沖鹽水，再加入9倍體積量的冷的氯化銨溶液)，混勻，4放置10min，然后在4離心(8000 r/min) 20min。小心棄去上清液，再用9倍量的氯化銨液重復(fù)處理1次，溶解殘存的紅細(xì)胞。取沉淀的白細(xì)胞并懸于培養(yǎng)液中，置于冰浴，取樣作活細(xì)胞計(jì)數(shù)，用預(yù)溫的培養(yǎng)液稀釋成每毫升含107個(gè)活細(xì)胞。 啟動(dòng)誘生 取稀釋的細(xì)胞懸液加入白細(xì)胞干擾素，使其最后濃度為100g/ml置37水浴攪拌培養(yǎng)2h。 正式誘生 啟動(dòng)后的白細(xì)胞加入仙臺(tái)病毒(在10天齡雞胚中培養(yǎng)4872h，收獲尿囊液)使其最后濃度為每毫升100150血凝單位，在37攪拌培養(yǎng)過(guò)夜。 收獲 將培養(yǎng)物離心(2500 r/min)

4、30min，吸取上清液即得粗制干擾素。 純化 將粗制人白細(xì)胞干擾素加入硫氰化鉀，用2mol/L鹽酸調(diào)節(jié)，離心棄去上清液，得沉淀1。沉淀1加入原體積1/5量的冷乙醇(94)，離心棄沉淀得上清液1。上清液1用鹽酸調(diào)節(jié)，離心棄去沉淀，再調(diào)至，離心，得上清液2和沉淀2。沉淀2加入原體積1/50量的甘氨酸-鹽酸緩沖液(pH=2)溶解，檢測(cè)，得IFN1。上清液2調(diào)節(jié)pH值至，離心棄去清液，得沉淀3。沉淀3加入原體積1/50量的，硫氰化鉀(pH=8)溶解，pH值降至，離心得上清液3和沉淀4。 沉淀4加原體積l/25000量的溶解，調(diào)至，對(duì)PBS(pH=7.3)透析，過(guò)夜，離心，收集上清液，檢測(cè)，得IFN-B

5、。上清液3中加鹽酸使pH值降至，離心，得沉淀5。沉淀5加入原體積1/5000量的pH=8、溶解，加NaOH調(diào)節(jié)，對(duì)PBS(pH=7.3)透析過(guò)夜，離心收集上清液，檢測(cè)，得IFN-A。每份灰黃層約能制備100萬(wàn)單價(jià)的純化干擾素。 此法特點(diǎn)是一次純化量大，回收率高于60；經(jīng)濟(jì)，簡(jiǎn)便，易于普及。效價(jià)可達(dá)1.2108 U/ml，比活2.2106 U/mg(蛋白)。IFN-A中干擾素含量占回收干擾素的82，比活也比較高。IFN1的比活較低5104 U/mg (蛋白)，一般可作外用滴鼻劑或點(diǎn)眼劑等。 3.5 基因工程干擾素的生產(chǎn) 1973年Cohen將兩種不同的DNA分子進(jìn)行體外重組，并用大腸桿菌表達(dá)，使

6、大量、廉價(jià)制備單組分干擾素成為可能。1980年和1982年利用基因工程成功地獲得了IFN-、IFN-和IFN-的cDNA，標(biāo)志著第二代干擾素的誕生。1987年，3種干擾素的生產(chǎn)開(kāi)始工業(yè)化，并大量進(jìn)入市場(chǎng)?？寺〖盎蛭膸?kù)的構(gòu)建干擾素的基因文庫(kù)構(gòu)建一般是用誘導(dǎo)劑對(duì)可以產(chǎn)生干擾素的腫瘤細(xì)胞株進(jìn)行誘導(dǎo)，從中取出mRNA，通過(guò)相應(yīng)的引物對(duì)干擾素的mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄-PCR擴(kuò)增，將其與一定的質(zhì)粒相連接后用合適的宿主菌進(jìn)行培養(yǎng)、擴(kuò)增即可。以從Namalva細(xì)胞中克隆IFN-、為例。 將Namalva細(xì)胞用Senda病毒誘導(dǎo)后從上清中用酚提取mRNA，通過(guò)oligo(dT)纖維素柱純化及520(W/V)蔗糖密

7、度梯度離心25000r/min 20 h后取618S的組分。用逆轉(zhuǎn)錄酶合成第一條互補(bǔ)鏈后用DNA聚合酶合成第二條鏈，用核酸酶S1切成平頭末端后520(W/V)蔗糖密度梯度離心進(jìn)行純化，取大于600 bp的組分。 將g平頭末端cDNA用末端轉(zhuǎn)移酶加15個(gè)dC，并將2g質(zhì)粒pBB322在Pst位點(diǎn)線性化，用末端轉(zhuǎn)移酶加15個(gè)dG，再將兩者連接，利用這種方法可產(chǎn)生新的Pst位點(diǎn)，利于從載體上再次切下cDNA。將產(chǎn)生的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101后，用微量板培養(yǎng)。合成引物5-CCTTCTGGAACTG- 3，該序列是IFN-、最長(zhǎng)的不間斷保守序列，用其作引物可同時(shí)調(diào)出IFN-、。 在T4激酶的作用下，用

8、-32P-ATP對(duì)其進(jìn)行標(biāo)記，并用Sephadex G-25進(jìn)行純化。用cDNA作為引物對(duì)其進(jìn)行延長(zhǎng)，并再用Sephadex G-50進(jìn)行純化，使可得到標(biāo)記后的cDNA。 將微量板上的菌落轉(zhuǎn)移到纖維素膜上，當(dāng)菌落直徑長(zhǎng)到2mm后與事先分離的末端標(biāo)記的cDNA 37雜交2d。然后用50甲酰胺、0.2SSC(1SSC為，檸檬酸鈉) 室溫洗膜3h。在上述雜交液中加入50 g/ml poly(U)、10g/ml poly(I)poly(C)進(jìn)行雜交，用50甲酰胺、1SSC洗脫后在室溫干燥，并于-70曝光，檢測(cè)細(xì)胞中質(zhì)粒與cDNA雜交的情況。 為進(jìn)一步檢測(cè)轉(zhuǎn)入的質(zhì)粒的準(zhǔn)確性，還要用菌落與原始誘導(dǎo)細(xì)胞中的

9、DNA進(jìn)行雜交。經(jīng)過(guò)以上兩次雜交篩選的菌落，還要對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行定性。如產(chǎn)物為干擾素，則說(shuō)明所建立的文庫(kù)可供以后基因的調(diào)取使用?；蛭膸?kù)的調(diào)用從構(gòu)建好的噬菌體文庫(kù)中調(diào)用IFN基因，可以用32P標(biāo)記的DNA探針與噬菌體文庫(kù)進(jìn)行Southern印跡，探針可以是根據(jù)IFN的編碼序列人工合成的一段DNA短鏈或其他種屬的IFN外顯子編碼序列。由于IFN的種屬特異性，因此印跡的條件不能太嚴(yán)格，這種方法可以用人IFN-的全部外顯子從噬菌體文庫(kù)中調(diào)出鼠IFN-的基因。 表達(dá)方法鼠干擾素的抗病毒活性主要位于氨基酸序列上的1040位、78107位、123166位的A、B、C區(qū)，尤其是位于78和79位的氨基酸對(duì)抗病毒活

10、性十分重要。人IFN-1的121136位對(duì)抗病毒活性作用較大，人IFN-的N端10個(gè)氨基酸也是保持其活性所必需的。嵌合表達(dá)的干擾素往往優(yōu)于單一干擾素。IFN-的表達(dá) 用家蠶核型多角病毒BmNPV體外感染的家蠶傳代細(xì)胞株BM-N通過(guò)噬菌斑法純化得到BmNPV的T3亞型。利用從感染脂肪體mRNA制得的cDNA為探針，對(duì)其多角蛋白序列進(jìn)行檢驗(yàn)，其中的EcoR片段及的Hind片段可與探針雜交，將的EcoR片段克隆到pBR322中，產(chǎn)生質(zhì)粒pBmE36。對(duì)其用Hind 酶切，得到片段，其中含有多角蛋白全部序列，將該片段插入pUC9的Hind位點(diǎn)，產(chǎn)生質(zhì)粒p9H18。將p9H18用EcoR切后于50U B

11、AL 31外切核酸酶緩沖液中23水浴10min，更換緩沖液，并加入倍體積的終止反應(yīng)。將截短的p9H18片段用Hind 酶切，并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離的Hind 平頭末端片段，將其插入pUC9即p9B310的Hind-Sma位點(diǎn)。另外，將pBmE36的的Hind 片段連接到pUC8上，得到質(zhì)粒p8H225，用EcoR及Aat切，得含有多角蛋白基因下游基因的片段，將其連接列p9H18的的EcoR-Aat片斷上，產(chǎn)生雜交質(zhì)粒p89B310，它在啟動(dòng)子上游含有多聚接頭(EcoR、BamH、Sma、Sal、Pst位點(diǎn))。將從基因文庫(kù)中用183bp探針調(diào)出的在ATG后含有Sma位點(diǎn)(即有序列CCCGGGA

12、TG)的IFN-J基因片段連接到p89B310上，使構(gòu)建成質(zhì)粒pIFN2B310。 將pIFN2B310與病毒基因組DNA便可共轉(zhuǎn)染BM-N細(xì)胞系或家蠶幼體，即可得到重組病毒BmIFN2B310、用兩個(gè)噬菌斑單位的病毒感染3106個(gè)BM-N細(xì)胞或用50l 3105個(gè)噬菌斑單位的病毒溶液注入家蠶幼體，培養(yǎng)24h后收集培養(yǎng)液使可得到干擾素。 3.6 基因工程干擾素的生產(chǎn)工藝制備基因工程-干擾素的工藝流程如下：下面以基因工程人干擾素b為例說(shuō)明其生產(chǎn)過(guò)程。 發(fā)酵a生產(chǎn)種子 人干擾素b基因工程菌SW-IFN-bEcoli-DH5。質(zhì)粒用PL啟動(dòng)子，含氨芐西林抗性基因。b種子培養(yǎng)基 1蛋白胨、酵母提取物、

13、NaCl。c種子搖瓶培養(yǎng) 在4個(gè)1000mL三角瓶中，分別裝入250mL種子培養(yǎng)基，分別接種人干擾素b基因工程菌，30搖床培養(yǎng)10h，作為發(fā)酵罐種子使用。d發(fā)酵培養(yǎng)基 1蛋白胨、酵母提取物、NH4Cl、NaCl，Na2HPO4、CaCl2、KH2PO4、MgSO4、葡萄糖、50mg/ml氨芐西林、少量消泡劑。e發(fā)酵 用15L發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵培養(yǎng)基的裝量為10L，pH，攪拌轉(zhuǎn)速500 r/min，通風(fēng)比為11m3(m3min)，溶氧為50。30發(fā)酵8h，然后在42誘導(dǎo)23h即可完成發(fā)酵。同時(shí)每隔不同時(shí)間取2ml發(fā)酵液，在10000 r/min離心除去上清液，稱菌體濕重。 產(chǎn)物的提取與純化a提

14、取 離心,去上清液，得濕菌體。濕菌體重新懸浮于磷酸緩沖液(pH7.0)中，于冰浴條件下進(jìn)行超聲破碎，離心30min，取沉淀。室溫?cái)嚢璩樘?h，離心，取上清液。用磷酸緩沖液(pH7.0)稀釋，加二硫基蘇糖醇至，4攪拌15h，15000 r/min離心30min，除去不溶物。上清液經(jīng)截流量為104相對(duì)分子質(zhì)量的中空纖維超濾器濃縮，將濃縮的人干擾素b液經(jīng)過(guò)Sephadex G-50分離，層析柱(2cm100 cm)先用20mmol/L磷酸緩沖液(pH7.0)平衡，上柱后用同一緩沖液洗脫分離，收集人干擾素b部分，經(jīng)SDS檢查。 b純化 將Sephadex G-50柱分離的人干擾素b組分，再經(jīng)DE-52

15、柱(2cmcm)純化，人干擾素b組分上柱后用含，的20mmol/L磷酸緩沖液(pH7.0)分別洗滌，收集含人干擾素b的洗脫液。全過(guò)程蛋白質(zhì)回收率為2025，產(chǎn)品不含雜蛋白、DNA及熱原質(zhì)。干擾素b含量符合要求。 4、白細(xì)胞介素4.1 白細(xì)胞介素（interleukin，IL）又稱白細(xì)胞間素，簡(jiǎn)稱白介素。白細(xì)胞介素是指由活化的單核-巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞等所產(chǎn)生的一類細(xì)胞因子，它作用于淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或其他細(xì)胞，負(fù)責(zé)信號(hào)傳遞，聯(lián)絡(luò)白細(xì)胞群的相互作用。在細(xì)胞的活化、增殖和分化中起調(diào)節(jié)作用。白細(xì)胞介素與相應(yīng)細(xì)胞的結(jié)合，這種連續(xù)的細(xì)胞因子與細(xì)胞間相互作用，可以擴(kuò)大和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。 白細(xì)胞介素2(IL-2

16、) 于1983年克隆成功。 IL-2是一種糖蛋白，含133個(gè)氨基酸；分子量為1535kD，無(wú)抗原特異性，可在經(jīng)激活后的T細(xì)胞培養(yǎng)上清液中收集。IL-2在pH29范圍內(nèi)穩(wěn)定，56加熱1h仍具有活性，但6530min即喪失活性。在4mol/L尿素溶液中穩(wěn)定，對(duì)2-巰基乙醇還原作用不敏感。對(duì)各種蛋白酶均敏感，對(duì)DNA酶和RNA酶不敏感。 在人IL-2的第58位、105位、125位是半胱氨酸(Cys)殘基，其中第58位和105位的兩個(gè)半胱氨酸間形成分子內(nèi)二硫鍵，這對(duì)IL-2保持其生物活性是必不可少的。第125位的Cys呈游離態(tài)，很不穩(wěn)定，在某些情況下可與58位或105位的巰基形成錯(cuò)配的二硫鍵，從而使I

17、L-2失去活性。圖5-7 人IL-2基因結(jié)構(gòu)、IL-2mRNA和IL-2分子4.2 白細(xì)胞介素的制備IL-2的傳統(tǒng)制備工藝 (1) 工藝流程 (2) 工藝過(guò)程及控制要點(diǎn) 誘生 用雞瘟病毒和PHA聯(lián)合刺激人外周血白細(xì)胞，37培養(yǎng)。 病毒滅活和固液分離 用6mol/L HCl調(diào)節(jié)pH，再用6mol/L NaOH調(diào)回到pH，離心除去變性雜蛋白。 硫酸銨分級(jí)沉淀 取上述離心后的培養(yǎng)上清液，加飽和硫酸銨至35飽和度，4靜置4h，離心棄去沉淀。上清液補(bǔ)加固體硫酸銨至85飽和度，4靜置24h，離心，收集沉淀。 除鹽 將沉淀溶于10mmol/L PBS中(內(nèi)含2正丁醇和0.15mol/L NaCl)，pH。對(duì)

18、10mmol/L PBS(pH6.5)透析24h(更換5次透析外液)。 藍(lán)色瓊脂糖層析 將上述透析內(nèi)液通過(guò)Sepharose 4B層析柱，用200ml起始PBS洗去不吸附的蛋白，再用含的PBS洗滌親和柱，最后用含的PBS解吸IL-2活性組分。 凝膠層析 將解吸的IL-2活性組分經(jīng)PEG(MW6000) 濃縮，再上ACA44 Ultrogel層析柱。用含PEG、2正丁醇和pH的甘氨酸的洗脫，得IL-2。 2基因工程IL-2的制備(1) IL-2 cDNA克隆的制備從ConA激活的Jurkat-細(xì)胞(人白血病T細(xì)胞株)取高活性IL-2 mRNA作為模板，逆轉(zhuǎn)錄單鏈cDNA，經(jīng)末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶催化，在cDNA末端連接若干dCMP殘基，再以寡聚(dG)1218為引物，利用DNA聚合酶雙鏈cDNA，經(jīng)蔗糖密度梯度離心法分離出此cDNA片段。通過(guò)G-C加尾法將此cDNA片段插入到pBR322質(zhì)粒的Pst位點(diǎn)，用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌K12株X1776，得到IL-2 cDNA文庫(kù)。利用mRNA雜交試驗(yàn)篩選IL-2 cDNA文庫(kù)得到含IL-2 DNA質(zhì)粒的菌株。(2) IL-2的表達(dá)和純化IL-2基因工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)，收集裂解菌體，離心沉淀收集包涵體。包涵體主要含內(nèi)IL-2單體分子聚合而成的多聚體，