病毒學(xué) 病毒檢驗

1、病毒學(xué) 病毒檢驗常用的病毒檢驗方法包括：一、病毒的分離鑒定二、病毒感染性的檢測三、病毒顆粒檢測四、病毒的血清學(xué)檢查五、病毒的分子(蛋白和核酸)檢測一、病毒的分離鑒定病毒的分離與鑒定可為病毒感染提供最為直接的病原學(xué)證據(jù)，同時可為進一步的病毒學(xué)研究提供材料。病毒的分離和鑒定（含義）：指從病人、帶毒者、外界環(huán)境中采集標本經(jīng)過適當?shù)奶幚?采用一系列物理、化學(xué)、生物學(xué)等手段,將病毒從標本中分離出來,并通過有關(guān)特異性方法鑒定屬于何種病毒,這一方法稱為病毒的分離與鑒定。病毒的分離與鑒定包括：1、病毒材料的采集與準備 2、病毒的分離與培養(yǎng)3、病毒的形態(tài)學(xué)觀察4、病毒的理化特性測定5、病毒的血清學(xué)鑒定及病毒的分

2、子生物學(xué)鑒定等基本過程。（一）標本的采取與送檢病料采集適當與否,直接影響病毒的檢測結(jié)果。一般可采集發(fā)病或死亡動物的組織病料、分泌物或糞便等,主要因動物及病毒的種類而異,例如檢測犬細小病毒或輪狀病毒,一般應(yīng)采腹瀉幼犬或犢牛的糞便;懷疑為口蹄疫的豬或牛,則應(yīng)采其水皰液及水皰皮送檢。應(yīng)注意下列原則：1.對本身帶有雜菌 (如咽喉拭子、糞便) 或易受污染的標本，要進行病毒分離培養(yǎng)時，應(yīng)使用抗生素。 2.因病毒在室溫中易失去活性，標本應(yīng)低溫保存并盡快送檢。 3.血清學(xué)診斷標本的采取應(yīng)在發(fā)病初期和病后23w內(nèi)各取1份血清，以便對比雙份血清抗體效價的動態(tài)變化。標本處理：采集樣本在接種細胞、雞胚或動物之前,都需

3、要做適當?shù)奶幚?以保證病毒分離的成功幾率。采集的器官或組織樣本：如肺臟、腦、肝、脾、淋巴結(jié)等,可取一小塊進行充分研磨,加入含青、鏈霉素的Hanks液,離心取上清液作為接種物;鼻液、膿汁、乳汁等分泌物或滲出液、糞便,應(yīng)加入高濃度的抗生素,充分混勻后,置4冰箱內(nèi)處理24h或過夜,離心后取上清做接種用;咽喉拭子在取樣后應(yīng)迅速將其浸泡入含有2%小牛血清和一定濃度的青、鏈霉素的Hanks液中,充分刷洗棉拭子,反復(fù)凍融35次,離心后取上清液作為接種材料。（二）病毒的分離與培養(yǎng)細胞培養(yǎng)、雞胚和實驗動物可用于病毒的分離與培養(yǎng),其中細胞培養(yǎng)是用于病毒分離與培養(yǎng)最常用的方法。用于病毒分離與培養(yǎng)的細胞有原代細胞、二

4、倍體細胞株和傳代細胞系,一般說來,本動物的原代細胞最為敏感,但不如傳代細胞方便易得.例如豬傳染性胃腸炎病毒初次分離最好用豬甲狀腺原代或二倍體細胞,但該細胞生長緩慢,通常用PD5(豬甲狀腺細胞系)取代。培養(yǎng)方法常用的有靜置培養(yǎng)和旋轉(zhuǎn)培養(yǎng),有的病毒如輪狀病毒,初次分離時旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)的成功率較靜置培養(yǎng)高。1、病毒的分離不同的病毒分離時采用不同的分離方法,這主要取決于目的病毒的生物學(xué)特性。主要有細胞培養(yǎng)法、雞胚接種法、動物接種法等,而對細胞、雞胚不敏感,又沒有合適動物模型的病毒,可采用基因克隆的方法。（1）動物接種法 是最原始的病毒培養(yǎng)方法，根據(jù)病毒種類不同，選擇敏感動物及適宜接種部位，如嗜神經(jīng)性病毒（狂

5、犬病毒）可接種于小鼠腦內(nèi)，痘病毒可接種于家兔角膜或皮內(nèi)。 動物的接種途徑要根據(jù)病毒種類、實驗動物種類、接種材料等選擇合適的接種途徑。動物接種途徑的選擇正確與否對提高病毒分離成功率也起到重要作用。常見病毒常用實驗動物及接種途徑P37在動物實驗的期間或結(jié)束時采集動物血液檢測病毒或特異性抗體。實驗動物采血分為致死性采血和非致死性采血兩種。致死性采血是指盡量采集動物血,直至動物死亡。非致死性采血是指采集一定量的動物血而不致動物死亡。對采血動物,應(yīng)在禁食24h后采血。采血應(yīng)無菌操作。不同動物采用不同的采血方法。常用的有心臟采血法、眼眶采血法、頸靜脈采血法、頸動脈采血法、耳靜脈采血法等。根據(jù)實驗動物和實驗

6、條件靈活選用。實驗動物采血雞胚對多種病毒敏感。不同病毒在雞胚的不同部位的生長特性差異很大,因此選擇適當?shù)慕臃N途徑是病毒分離成功的關(guān)鍵。一般采用孵化914天的雞胚，根據(jù)病毒種類不同，將病毒標本 接種于雞胚的不同部位，最常用的雞胚接種部位有：尿囊腔、絨毛尿囊膜、卵黃囊和羊膜腔等。（2）雞胚培養(yǎng)法是將離體活組織塊或分散的組織細胞加以培養(yǎng)的技術(shù)總稱，為病毒分離鑒定中的最常用的基本方法。（3）細胞培養(yǎng) (cell culture)法或組織培養(yǎng)法 (tissue culture) 一般選擇生長旺盛的敏感細胞用于病毒分離。少數(shù)病毒例外,例如犬、豬等的細小病毒,病毒的復(fù)制有賴于分裂旺盛的細胞,因此需將病毒接種

7、與細胞培養(yǎng)同步進行。細胞培養(yǎng)技術(shù)在病毒發(fā)現(xiàn)、病毒研究、疫苗研制、抗病毒藥物篩選等病毒學(xué)發(fā)展的歷程中發(fā)揮著重要作用。常見人類病毒的敏感細胞P36P36（4）分子生物學(xué)技術(shù)對體外培養(yǎng)的細胞、雞胚、動物不敏感的病毒,可采用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù),如基因克隆技術(shù),對病毒的全基因進行克隆,構(gòu)建表達載體,并能表達出病毒樣顆粒。（三）病毒的鑒定步驟：1、初步鑒定2、接種動物的觀察3、最終鑒定1、初步鑒定(1)根據(jù)臨床表現(xiàn)、流行病學(xué)特征與標本來源。初步判定屬于哪一類病毒腦炎患者腦脊液 乙型腦炎病毒秋季腹瀉病人糞便輪狀病毒發(fā)燒小孩（下肢麻痹）糞便脊髓灰質(zhì)炎病毒(2)病毒的生物學(xué)特性病毒或接種分離標本后，細胞出現(xiàn)的病

8、理性變化。不同的病毒具有不同的敏感細胞，而又能引起不同的細胞病變效應(yīng)。例如：上呼吸道標本接種到細胞培養(yǎng)上,出現(xiàn)細胞融合,產(chǎn)生多核巨細胞現(xiàn)象，就要考慮副黏病毒、皰疹病毒、腎綜合征出血熱病毒、冠狀病毒、流感病毒等；接種到WI-38或人胚肺細胞培養(yǎng)上出現(xiàn)散在的、局部堆積的巨大細胞，則要考慮巨細胞病毒的可能性；腸道病毒能使細胞圓縮、變小、分散，往往全部細胞受到破壞；腺病毒能使細胞腫大，顆粒增多，細胞聚集成葡萄狀。細胞病變效應(yīng)哪三種現(xiàn)象？血吸附和血凝作用有些病毒感染細胞后,細胞膜上可鑲嵌著病毒基因編碼產(chǎn)生的糖蛋白,其中有些能吸附特定種類的紅細胞,或?qū)⒓毎囵B(yǎng)單層刮下后,經(jīng)過適當處理,可以凝集特定種類的紅

9、細胞,此類糖蛋白在細胞表面形成刺突,稱為血凝素。如流感病毒、副黏病毒、風(fēng)疹病毒等感染細胞后可產(chǎn)生血吸附現(xiàn)象,或通過血凝實驗來證實病毒的存在。新城疫病毒能吸附和凝集豚鼠紅細胞風(fēng)疹病毒能吸附和凝集鴿子、綿羊等紅細胞病毒的血凝作用往往需要一定的pH和溫度,利用血吸附和血凝集現(xiàn)象可以為初步判定屬于何種病毒提供重要思路。例子干擾現(xiàn)象一種病毒感染細胞后,可以干擾另一種病毒在該細胞內(nèi)的增殖,這種現(xiàn)象稱為干擾現(xiàn)象。利用干擾現(xiàn)象可以檢查出一些不引起細胞病變、血凝、血吸附的病毒。如：鼻病毒就可以利用干擾現(xiàn)象進行初步鑒定。實驗組：感染人胚腎細胞管或培養(yǎng)板細胞用人或豚鼠紅細胞做血吸附實驗,如果陰性,用Hanks液洗滌

10、3次,然后接種仙臺病毒,33 培養(yǎng)48h,做血吸附實驗。對照組：正常細胞只接種仙臺病毒。實驗現(xiàn)象：如果對照組血吸附陽性,而實驗組陰性,說明先前接種的標本中存在能干擾仙臺病毒增殖的病毒,此結(jié)果即為干擾試驗陽性。（3）病毒的理化特性測定包括病毒核酸類型鑒定、耐酸性試驗、脂溶劑敏感性試驗、耐熱性試驗、胰蛋白酶敏感性試驗等通常以細胞培養(yǎng)或雞胚培養(yǎng)為觀察體系,應(yīng)設(shè)立已知病毒為對照。病毒的理化特性是病毒鑒定的重要依據(jù)代謝抑制法鑒定病毒核酸類型病毒核酸類型鑒定是病毒理化特性測定的最主要指標。添加氟脫氧尿核苷(FUDR)或類似物于病毒培養(yǎng)物中,病毒復(fù)制被抑制者,即為DNA病毒,否則為RNA病毒,也可用DNA酶

11、或RNA酶分別作用,以判定核酸的性質(zhì)。綠豆芽酶可降解單股核酸,用它可進一步鑒定核酸是單股或雙股。可直接用純化的病毒核酸通過電鏡觀察，對其進行鑒定。但技術(shù)要求較高。近年來,PCR核酸測序技術(shù)的應(yīng)用使得病毒核酸型鑒定的可行性大為增加。 （觀看PCR視頻）脂溶性試驗用乙醚或氯仿處理待檢病毒液,而后與未處理者比較其TCID50的變化,以判斷是否敏感。乙醚、氯仿、脫氧膽酸鈉等脂溶劑能破壞病毒的脂質(zhì)包膜。有包膜的病毒對脂溶劑敏感,受脂溶劑的處理能使病毒失去感染性;無包膜的病毒往往對脂溶劑有抵抗力。因此,用乙醚等可以鑒定所分離的病毒是否有包膜。病毒粒的結(jié)構(gòu)模式圖殼粒衣殼核心（核樣物）核衣殼包膜包膜病毒包膜子

12、粒處理方法:將病毒懸液20003000r/min離心20min,取上清液,分成兩組：一組為試驗組：按與乙醚4:1的比例振蕩混合均勻,管口密封好,4過夜后,20003000r/min離心20min。此時液體分為兩層,上層為乙醚,下層為病毒液。吸取下層部分,避免混有乙醚。另一組為對照組：不加乙醚,處理方法同試驗組。將兩組的病毒液同時測定病毒滴度,如果試驗組病毒滴度明顯降低,與對照組有明顯差異,說明病毒對乙醚敏感,屬于有膜病毒。如果兩組的病毒滴度沒有顯著差異,說明病毒對乙醚有抵抗力,屬于無膜病毒。耐酸性試驗?zāi)退嵝栽囼灪椭軇┟舾行栽囼炇亲畛Ｗ龅膬身椑砘笜恕Ｄ退嵝栽囼炘O(shè)置緩沖液pH為3和7的病毒做比

13、較。通過腸道傳播的病毒對酸有抵抗力,借此可鑒別某些病毒。如腸道病毒與鼻病毒同為RNA病毒,腸道病毒對酸有抵抗力,而鼻病毒則沒有。處理方法:試驗組：病毒懸液用的HCl調(diào)pH至3.0,37放置2h后,用5.6%的NaHCO3調(diào)pH至對照組：除了不加酸外,其他步驟和試驗組相同。將兩組同時測定病毒滴度,如果試驗組病毒滴度明顯降低,與對照組有顯著差異,說明病毒對酸敏感,不屬于腸道病毒。如果兩組的病毒滴度沒有顯著差異,說明病毒對酸有抵抗力,屬腸道病毒。2、接種動物的觀察根據(jù)動物的感染范圍,可初步推斷屬于何種病毒。接種動物的觀察是非常重要的,通過觀察試驗動物的反應(yīng)有時也可初步鑒定何種病毒。每天都需要觀察,有

14、時1d需要觀察數(shù)次。觀察指標:動物發(fā)病的潛伏期,病毒感染都有一定的潛伏期。因此,潛伏期在病毒的初步鑒定方面也是非常重要的。如乙腦小鼠腦內(nèi)接種潛伏期一般為4d,狂犬病腦內(nèi)接種潛伏期一般為68d。接種動物的飲食情況是否有變化,活動與飲食能力是否發(fā)生改變,糞便是否有變化。每天在同一時間測量動物的體重和體溫,比較接種前后變化情況。觀察局部或全身性反應(yīng),如出現(xiàn)毛松、軟弱無力、震顫、不安、抽搐,甚至死亡等全身癥狀,可考慮神經(jīng)系統(tǒng)感染的可能性。對照組不接種病毒,用生理鹽水代替,其他步驟和觀察指標與試驗組完全相同。3、最終鑒定病毒的最終鑒定需要免疫學(xué)方法、分子生物學(xué)方法、電子顯微鏡與免疫電子顯微技術(shù)等特異性方

15、法加以鑒定。（1）病毒的血清學(xué)鑒定（2）病毒的分子生物學(xué)鑒定（3）電子顯微鏡技術(shù)（1）病毒的血清學(xué)鑒定病毒分離后,可用已知的抗病毒血清或單克隆抗體,對分離毒株進行血清學(xué)鑒定,以確定病毒的種類、血清型及其亞型。常用的血清學(xué)試驗有血清中和試驗、血清抑制試驗、免疫熒光試驗等。此外,可采用一些血清學(xué)技術(shù)如免疫沉淀技術(shù)和免疫轉(zhuǎn)印技術(shù)分析病毒的結(jié)構(gòu)蛋白成分。中和試驗基本原理：特異性的抗病毒免疫血清（即中和抗體）和病毒體表面的抗原結(jié)合后,使病毒不能吸附于敏感細胞,或兩者結(jié)合后抑制了病毒的穿入和/或脫殼過程。因此,病毒就失去了感染的能力。中和試驗是以測定病毒的感染力為基礎(chǔ)的,試驗必須在培養(yǎng)的細胞內(nèi),或動物、雞

16、胚等活體內(nèi)進行,而且都必須是對病毒敏感的。以病毒受免疫血清中和后的殘存感染力為依據(jù),判定中和抗體的滴度。中和試驗需要設(shè)對照試驗。結(jié)果判定的科學(xué)依據(jù)：用細胞培養(yǎng)進行試驗時,可依據(jù)細胞病變情況、蝕斑數(shù)量、顏色反應(yīng)等。用雞胚進行試驗時,可依據(jù)雞胚的死亡數(shù)、絨毛尿囊膜斑點數(shù)量和特征、血凝素產(chǎn)生情況等;用動物進行試驗時,可依據(jù)動物死亡數(shù)、發(fā)病數(shù)、出現(xiàn)癥狀數(shù)等。操作步驟：中和試驗常用的有兩種方法：一種是固定病毒數(shù)量,一般用100TCID50的病毒與等量一系列倍比稀釋的血清進行中和試驗。然后接種于動物、雞胚或細胞中，用Reed-Muench法計算50%感染的血清中和終點。另一種是固定血清用量與等量一系列對數(shù)

17、稀釋的病毒進行中和試驗。病毒毒價單位：半數(shù)致死量(LD50)作為毒價測定單位，即經(jīng)規(guī)定的途徑，以不同的劑量接種試驗動物，在一定時間內(nèi)能致半數(shù)試驗動物死亡的劑量。用雞胚測定時，毒價單位為雞胚半數(shù)致死量(ELD50)或雞胚半數(shù)感染量(EID50)。用細胞培養(yǎng)測定時，用組織細胞半數(shù)感染量(TCID50)。在測定疫苗的免疫性能時，則用半數(shù)免疫量(IMD50)或半數(shù)保護量(PD50)。病毒毒價的測定（微量法）(1) 病毒的制備將病毒接種于單層細胞，37吸附1h后加入維持液，置溫箱培養(yǎng)；逐日觀察，待細胞病變（CPE）達75%以上，收獲病毒懸液凍融或超聲波處理，以3 000r/min離心10min，取上清液

18、，定量分裝成1ml小瓶置-70保存?zhèn)溆?，選用的病毒必須是對細胞有較穩(wěn)定的致病力。(2) 病毒毒價測定取置-70冰箱保存的病毒一瓶，將病毒在96孔培養(yǎng)板上作10倍遞進稀釋即10-1，10-2，10-3 ，每孔病毒懸液量為50l，每個稀釋度作8孔，每孔加入100l細胞懸液，每塊板的最后一行設(shè)8孔細胞對照，制備細胞懸液的濃度以使細胞在24h內(nèi)長滿單層為度。把培養(yǎng)板置5%CO2溫箱37培養(yǎng)，從48h-14d逐日觀察細胞病變，記錄結(jié)果。中和試驗可應(yīng)用于： 1.病毒株的種型鑒定：中和試驗具有較高的特異性，利用同一病毒的不同型的毒株或不同型標準血清，即可測知相應(yīng)血清或病毒的型，所以中和試驗不但可以定屬而且可

19、以定型。 2.測定血清抗體效價：中和抗體出現(xiàn)于病毒感染的較早期，在體內(nèi)的維持時間較長。動物體內(nèi)中和抗體水平的高低，可顯示動物抵抗病毒的能力。 3.分析病毒的抗原性。血凝抑制試驗基本原理:某些病毒具有血凝素,能選擇性地作用于個別種類的哺乳動物的紅細胞表面的受體,病毒附著于細胞而發(fā)生凝集反應(yīng),稱為紅細胞凝集現(xiàn)象(簡稱血凝)。如果將病毒特異性抗體加入病毒或血凝素懸液中,作用一定時間后,由于抗原(血凝素)與抗體發(fā)生特異性結(jié)合,這種結(jié)合妨礙了病毒血凝素對紅細胞的附著,因而血凝現(xiàn)象被抑制,這種試驗稱為血凝抑制試驗。用簡式表示:病毒+紅細胞 凝集病毒+抗體+紅細胞 凝集被抑制免疫熒光試驗基本原理：有些熒光素

20、能和抗體分子結(jié)合,并且保持抗體活力,和相應(yīng)的抗原特異性結(jié)合,并形成免疫復(fù)合物。此種復(fù)合物因有熒光素作標記,借助熒光顯微鏡,能觀察到它的存在及位置,從而可以確定相應(yīng)的病毒抗原。免疫熒光試驗分直接法和間接法兩種:直接法:直接法是將熒光素標記在病毒特異性抗體分子上,標記的抗體直接與固定在載玻片細胞內(nèi)的病毒抗原結(jié)合,然后于熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。直接法的優(yōu)點是簡便、特異;缺點是敏感性較低,只能檢測一種病毒抗原。間接法:將熒光素標記在抗人或抗動物抗體即抗抗體分子上,用來檢測抗體與病毒抗原形成的復(fù)合物,因此間接法有兩對抗原抗體系統(tǒng)。間接法的優(yōu)點是敏感性高，標記一種抗體可用于多種抗原的檢測;缺點是有時出現(xiàn)非特

21、異性熒光,所以對操作要求更高。操作步驟：首先制備含有病毒抗原的細胞片：在細胞培養(yǎng)瓶中加入載玻片,讓細胞在載玻片上生長,并感染病毒。根據(jù)病毒復(fù)制特性,一定時間后用冷丙酮固定,用抗體和/或熒光標記抗體染色。于熒光顯微鏡下觀察、記錄結(jié)果。（2）病毒的分子生物學(xué)鑒定分子生物學(xué)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于病毒的鑒定：包括病毒基因的PCR擴增及其序列分析,核酸雜交技術(shù),病毒全基因組序列測定分析等,從而可獲得分離毒株的基因組信息,依據(jù)基因組序列繪制遺傳進化樹分析比較分離毒株的遺傳變異情況,確定分離毒株的基因類型。（3）電子顯微鏡技術(shù)細胞培養(yǎng)、雞胚培養(yǎng)和動物培養(yǎng)的病毒可以借助電子顯微鏡技術(shù),包括超薄切片和負染技術(shù),觀察標

22、本中的病毒形態(tài)結(jié)構(gòu),尤其是形態(tài)結(jié)構(gòu)比較特殊的病毒,如腺病毒、痘病毒、冠狀病毒、輪狀病毒、流感病毒、彈狀病毒等具有更特殊的鑒別價值。某些病毒感染早期的標本和某些難以培養(yǎng)的病毒可以用電子顯微鏡技術(shù)觀察標本中的病毒顆粒。如可以從甲型肝炎病人的糞便中檢出甲型肝炎病毒顆粒,從嬰幼兒腹瀉的糞便中檢出輪狀病毒和諾沃克病毒顆粒等。有時在臨床上對水痘帶狀皰疹病毒和天花病毒引起的皰疹很難區(qū)別,借助電子顯微鏡技術(shù)可在數(shù)小時內(nèi)做出明確的鑒別診斷。二、病毒感染單位的測定病毒的滴度（titer）：樣本中病毒的濃度病毒滴度可以通過用系列稀釋的病毒接種細胞培養(yǎng)、雞胚或?qū)嶒瀯游?檢測病毒增殖的情況而確定。常用于病毒感染單位測定

23、的技術(shù)有空斑試驗、終點稀釋法、熒光-斑點試驗、轉(zhuǎn)化試驗等,最常用的是前兩種。1.空斑試驗是一種檢查和準確測定病毒滴度的方法。將稀釋的病毒懸液加入單層細胞培養(yǎng)瓶中。病毒吸附后，再覆蓋一層融化的半固體營養(yǎng)瓊脂，使病毒在單層細胞培養(yǎng)中有限擴散。結(jié)果是每一個有感染性的病毒在單層細胞中可產(chǎn)生一個局限性的感染灶。用活性染料 (如中性紅) 染色，則活細胞著色，受病毒感染而破壞的細胞不著色，形成肉眼可見的空斑/蝕斑(plaque)。每個蝕斑是由一個感染性病毒顆粒形成的，稱作空斑形成單位 (plaque forming unit, PFU)。病毒懸液中的感染性病毒量的滴度可用PFUml表示。根據(jù)樣本的稀釋度和空

24、斑數(shù),計算每毫升空斑形成單位(PFU),即可確定病毒的滴度。為了盡量減小計算病毒滴度的誤差,進行空斑試驗時應(yīng)對病毒液做系列稀釋,依據(jù)細胞培養(yǎng)板(瓶、皿)的面積,僅計算含20100個空斑的培養(yǎng)板,因超過100個空斑的培養(yǎng)板會導(dǎo)致計數(shù)不準確。空斑試驗是純化和滴定病毒的一個重要手段,只是并非所有病毒或毒株都能形成空斑。2.終點稀釋法終點稀釋法endpoint dilution assay)用于測定幾乎所有種類的病毒滴度,包括某些不能形成空斑的病毒,并可用以確定病毒對動物的毒力或毒價。將病毒做系列稀釋,選擇46個稀釋度,接種一定數(shù)量的細胞、雞胚或動物,每個稀釋度做36個重復(fù)。使用細胞培養(yǎng),可通過CPE

25、來判定組織培養(yǎng)半數(shù)感染量(TCID50)。在雞胚或動物,是以死亡或發(fā)病來測定。動物實驗：以感染發(fā)病作為指標時,可計算半數(shù)感染量(ID50);以體溫反應(yīng)作為指標時,可計算半數(shù)反應(yīng)量(RD50) 。用雞胚測定時,可計算雞胚半數(shù)致死量(ELD50)或雞胚半數(shù)感染量(EID50)3.熒光-斑點試驗是空斑試驗的一種改良方法,用于測定細胞培養(yǎng)時不會引致CPE的病毒滴度,如豬瘟病毒。該方法的起始步驟與空斑試驗一致.在病毒充分吸附和基因表達之后,用甲醇或丙酮固定細胞,用針對病毒蛋白的抗體進行處理,然后加入熒光素標記的二抗。將細胞置熒光顯微鏡下觀察,病毒感染細胞形成熒光斑點,病毒的滴度以每毫升熒光斑點形成單位。

26、4.轉(zhuǎn)化試驗用于測定某些不形成空斑的反轉(zhuǎn)錄病毒的滴度。Rous肉瘤病毒轉(zhuǎn)化雞胚細胞就是一個例子.受到轉(zhuǎn)化的細胞可形成小的斑點,容易與其余的單層細胞相互區(qū)別。感染性以每毫升斑點形成單位（focus-forming unit，F(xiàn)FU ）表示。三、病毒顆粒的檢測方法：電鏡技術(shù)、血凝試驗、病毒酶活性測定、綠色熒光蛋白標記最直觀的方法是用電子顯微鏡（electron microscopy，EM）觀察病毒顆粒病毒濃度要求：107如：某些病毒料中含毒量較高,如輪狀病毒引致的腹瀉的糞便,EM觀察較易發(fā)現(xiàn)病毒,但像口蹄疫病毒或豬瘟病毒,病料中一般含毒量較低,EM不作為常規(guī)檢驗手段。1、電鏡技術(shù)免疫電鏡(IEM)

27、免疫電鏡(IEM)技術(shù)是應(yīng)用病毒的特異抗體的電鏡技術(shù),可檢出某些憑形態(tài)特征較難區(qū)分的病毒。由于抗體與病毒顆粒相結(jié)合,凝聚了樣本中的病毒。可提高檢出率。高滴度的抗血清或單克隆抗體是決定IEM成敗的關(guān)鍵材料。2、血凝試驗許多動物病毒,如正黏病毒科、副黏病毒科、腺病毒科的成員,能夠凝集某些動物(如雞、小鼠、豚鼠)或人的紅細胞。這些病毒含有可與紅細胞結(jié)合的蛋白質(zhì),如禽流感病毒的囊膜上有一種稱為血凝素的糖蛋自,可與紅細胞表面的N-乙酰神經(jīng)氨酸糖蛋自結(jié)合,引起紅細胞凝集。利用這種特性,可做血凝試驗來檢測這些病毒的存在。一般將病毒液在血凝反應(yīng)板上做倍比稀釋,加入紅細胞,未凝集的紅細胞呈圓點或紐扣狀沉于孔底,

28、而凝集的紅細胞彌漫性格狀覆蓋整個孔。該方法快速,但如犬細小病毒檢驗樣本中的病毒粒子含量若少于lO9/g,敏感性則差。+：血球完全凝集，成厚膜狀鋪于管底。+： 血球呈薄層貼附于管底，邊緣不整齊。+： 中央呈小圓盤狀，邊緣凝集呈顆粒狀。+： 中央呈彌散圓盤狀，邊緣有少量凝集顆粒。： 無凝集，血球自然沉于管底呈一小圓盤狀。 3、病毒酶活性測定一些動物病毒含有核酸聚合酶，可將病毒與放射性標記的前體混合,測定其放射性活性,該方法常用于反轉(zhuǎn)錄病毒的反轉(zhuǎn)錄活性的檢測,因它們不能轉(zhuǎn)化細飽,也不能形成空斑。因酶活性與病毒粒子數(shù)量成比例關(guān)系,因此該方法可以快速跟蹤感染過程中病毒的增殖侑況。4、綠色熒光蛋白標記用于

29、檢測病毒的轉(zhuǎn)錄或翻譯過程,在活細胞中可直接觀察到，不需要固定細胞,也不需要底物或酶。可將綠色熒光蛋白的基因序列插入病毒基因組,不影響病毒蛋白的功能,用重組病毒感染細胞后,即可產(chǎn)生綠色熒光蛋白?？捎糜谘芯坎《镜膩喖毎ㄎ?分析病毒在活細胞中的吸附、侵入、脫殼、復(fù)制、裝配和釋出過程.四、病毒的血清學(xué)診斷 原理是用已知病毒抗原來檢測病人或動物血清中有無相應(yīng)抗體，故須待病人或動物感染后體內(nèi)產(chǎn)生抗體時才能檢出。 另外，在采取臨床標本及病人、動物血清應(yīng)注意病程，必須采取患者急性期血清與恢復(fù)期血清 (雙份血清) 進行血清學(xué)試驗。若第2次血清抗體滴度比第1次高出4倍以上時，才有診斷意義。血清學(xué)技術(shù)1、免疫熒光

30、技術(shù)2、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）3、免疫沉淀技術(shù)4、免疫轉(zhuǎn)印技術(shù)5、中和試驗6、血凝試驗和血凝抑制試驗7、補體結(jié)合試驗（一）病毒抗原的直接檢出除對細胞培養(yǎng)中的病毒可進行鑒定外,對一些血清型類別不多或在常規(guī)細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中還不能成功培養(yǎng)的病毒,應(yīng)用免疫熒光技術(shù)或酶聯(lián)免疫吸附實驗直接檢測病毒抗原是快速而簡單的方法。1.免疫熒光法(immunofluorescent assay，IF)根據(jù)抗原抗體特異性結(jié)合的反應(yīng)特點,將熒光色素與待檢病毒的特異性抗體以化學(xué)的方法結(jié)合起來。將熒光標記了的抗體在特定的條件下浸染標本,使抗體與標本中的抗原(病毒)發(fā)生結(jié)合反應(yīng),細胞內(nèi)的病毒或抗原可被熒光素標記的特異性抗

31、體結(jié)合,在熒光顯微鏡下可見斑點狀黃綠色熒光,根據(jù)所用抗體的特異性判斷為何種病毒感染。免疫熒光(IF)法用于鑒定病毒具有快速、特異的優(yōu)點。此方法主要包括直接免疫熒光法、間接免疫熒光法以及在間接法的基礎(chǔ)上發(fā)展而成的補體結(jié)合法。2.酶聯(lián)免疫吸附試驗 (Enzyme-Linked Immunosorbent Assays,ELISA)ELISA使用病毒特異性抗體檢測標本中的病毒抗原。ELISA法用于鑒定病毒具有簡便、快速、特異的優(yōu)點。3.免疫沉淀(immunoprecipitation)基于病毒特異性抗體與感染細胞或組織的可溶性提取物中的病毒蛋白的相互作用。病毒蛋白事先經(jīng)放射性同位素標記的氨基酸進行代

32、謝標記,將病毒與抗體作用,分離抗體-病毒蛋白復(fù)合物,然后將病毒蛋白從復(fù)合物中解離,再經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳,最后經(jīng)放射自顯影,可觀察到病毒蛋白帶條。該技術(shù)可用于分析病毒蛋白的許多特性,如存在于病毒粒子和感染細胞內(nèi)的病毒蛋白種類,蛋白的分子質(zhì)量,蛋白的合成動態(tài),亞細胞定位,病毒蛋白與其他病毒或細胞蛋白的結(jié)合情況。4.免疫轉(zhuǎn)印(immunoblotting)是基于抗體與固定在濾膜上的病毒蛋白質(zhì)的相互作用。病毒蛋白經(jīng)聚丙烯配胺凝膠電泳,然后轉(zhuǎn)印到對蛋白質(zhì)有很強親和性的濾膜(如硝酸纖維素濾膜)上，經(jīng)免疫染色(如免疫酶染色)檢測結(jié)合在膜上的蛋白質(zhì)。由于結(jié)合到膜上的蛋白質(zhì)是變性的,因此識別非線性抗原表位的抗

33、體不適合用于檢測。 該方法可用于病毒蛋白的分析,其主要優(yōu)點在于不需要進行病毒蛋白的標記,因此適用于組織、器官或培養(yǎng)細胞中病毒蛋白的檢測。（二）病毒抗體的直接檢出應(yīng)用病毒特異性抗原檢測病毒感染患者血清中的抗體也是診斷病毒感染的的重要手段，可有IgG和IgM兩種。IgM抗體出現(xiàn)于病毒感染早期,可用于快速診斷病毒感染。IgG抗體出現(xiàn)較遲,在血清中存在的時間也較長,因此IgG類抗體用于臨床診斷必須具有早期和恢復(fù)期雙份血清,或有隨訪的血清,兩次標本中抗體的效價需有4倍或以上的升高才有診斷價值。ELISA或免疫印跡法可檢測血清中針對某種病毒抗原亞單位的抗體,例如,該法已用于HIV患者抗體的確認實驗。其他常

34、用的方法還包括:1.中和試驗2.補體結(jié)合試驗3.血凝抑制試驗1.中和試驗(neutralizing test,NT test)是病毒在活體內(nèi)或細胞培養(yǎng)中被特異性抗體中和而失去感染性的一種試驗。針對病毒的一些蛋白質(zhì)抗原或抗原表位的抗體與病毒結(jié)合后可以中和病毒的感染性。中和抗體(netralizing antibodies,NTAb)是作用于病毒表面抗原 (衣殼或包膜) 的抗體，同種不同型病毒間一般無交叉，特異性高，而且抗體在體內(nèi)維持時間長。因此流行病學(xué)檢查常用此法。病毒中和試驗可以在細胞培養(yǎng)、雞胚或動物上進行,一般將抗體稀釋,與一定量的病毒混合,然后檢測其在細胞培養(yǎng)、雞胚或動物上的殘余感染性。終

35、點是以抑制細胞病變(細胞培養(yǎng)或病毒復(fù)制雞胚或動物的抗體最高稀釋度來表示。中和試驗具有很強的特異性,是檢測病毒和新分離病毒毒株的鑒定最經(jīng)典的方法,也可用于檢測病毒感染動物血清中的抗體?？捎脕頇z查患者血清中抗體的消長情況,也可用來鑒定未知病毒或研究病毒的抗原結(jié)構(gòu)。中和試驗的結(jié)果呈現(xiàn)“陽性”不一定表示正在感染中，也可能因以前有過隱性感染所致。因此，中和試驗適用于人群免疫情況的調(diào)查，在臨床診斷上較少使用。2.補體結(jié)合試驗 (complement fixation test,CF test)用于檢測人或動物血清中的病毒抗體。用已知病毒內(nèi)部可溶性抗原來檢測病人或動物血清中相應(yīng)抗體。一般是血清中IgM類抗體

36、。原理：病毒抗原與抗體的相互反應(yīng)可以引起補體結(jié)合,最終不會導(dǎo)致細胞膜溶解。在補體結(jié)合試驗中,利用紅細胞作為靶細胞，溶血系統(tǒng)作為指示系統(tǒng),因紅細胞膜的溶解易于觀察到。游離的補體可以溶解紅細胞膜。如果存在抗原抗體結(jié)合反應(yīng), 將與補體發(fā)生結(jié)合,失去溶解紅細胞作用。利用加入“結(jié)合了溶血素 (即紅細胞抗體) ”的綿羊紅細胞可以檢測到是否存在病毒抗原。如果補體被病毒抗原抗體復(fù)合物結(jié)合,則紅細胞仍然是完整的;相反,如果補體未被結(jié)合,紅細胞將在游離的補體的作用下被溶解。因補體結(jié)合試驗中常使用粗制的病毒抗原,因此該方法的特異性不是很高.“補體結(jié)合抗原”即CF抗原是病毒的內(nèi)部抗原，同種異型間常有交叉反應(yīng)，故特異性

37、較中和試驗低。但“補體結(jié)合抗體”即 CF抗體產(chǎn)生較早，消失較快，常用于病毒早期感染的診斷，故CF陽性可作為近期感染的指標。3.血凝抑制試驗(hemagglutinatia inhibition test, HI test) 許多病毒表面具有血凝素(HA) ，能凝集雞、豚鼠、人等的紅細胞，稱血凝現(xiàn)象。這種現(xiàn)象能被相應(yīng)抗體（即抗血凝素抗體）所抑制，檢測血凝抑制抗體的試驗，稱HI試驗。即具有HA病毒的抗體，可阻斷病毒與紅細胞結(jié)合。原理是血凝素(HA)對應(yīng)的抗體，即抗血凝素抗體與病毒結(jié)合后，抑制了病毒表面的HA與紅細胞的結(jié)合。病毒 +雞RBC = 凝集（血凝試驗）病毒 +特異性抗體 +雞RBC=不凝集

38、 （血凝抑制試驗）本試驗簡易、經(jīng)濟，特異性高，常用于粘病毒、流感病毒及乙型腦炎病毒感染的輔助診斷及流行病學(xué)調(diào)查，也可鑒定病毒的型與亞型。五、病毒核酸的檢測指利用一些分子生物學(xué)技術(shù),如基因組電泳分析、核酸雜交、聚合酶鏈式反應(yīng)、酶切圖譜分析、寡核苷酸指紋圖、DNA芯片技術(shù)等,通過檢測病毒的核酸而確證樣本中病毒的存在。目前PCR等技術(shù)已廣泛用于病毒的檢測和病毒病的診斷。由于大多數(shù)病毒的基因均已克隆并已知道其核酸序列,因此可以利用病毒的基因作為探針(probes)進行雜交以檢測標本中有無相應(yīng)的病毒核酸,或針對病毒的序列設(shè)計相應(yīng)的引物,作多聚酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction

39、Assay ,PCR)。近年隨著技術(shù)的進步,已研制出多種高通量的檢測病毒核酸的技術(shù)。1、核酸雜交技術(shù)核酸雜交是病毒診斷領(lǐng)域中發(fā)展較快的一項新技術(shù),主要分為Southern雜交和Northern雜交兩大類。其基本原理是雙鏈DNA(或RNA)在加熱或堿處理下,變性解開成單鏈,然后用一條已知的特異性的核苷酸序列的單鏈DNA,以同位素或非放射性核素標記后制成探針去與固態(tài)支持物上的變性單鏈DNA進行雜交,再用放射自顯影技術(shù)或用生物素-親和素系統(tǒng)進行檢查,以確定待測核酸中有無與探針DNA同源的DNA存在。由于病毒基因很多已成功地被克隆及進行了核苷酸序列測定,因此可以利用特定的病毒基因作為探針,用核酸雜交的

40、方法檢測標本中有無相應(yīng)的病毒核酸。核酸雜交技術(shù)(nucleio acid hybridization technique)方法包括有斑點核酸雜交、細胞內(nèi)原位雜交、DNA印跡雜交和RNA印跡雜交等。2、PCR技術(shù)近年來發(fā)展了一系列以PCR為基礎(chǔ)的體外核酸擴增技術(shù),用于檢測不易感或不能培養(yǎng)的病毒。此方法特異性強、敏感性高、簡便快速,已成功用于HCV、H 、CMV、HPV等多種病毒性感染的臨床檢測中。由于PCR方法十分敏感,可檢出fg水平的病毒核酸,故操作時應(yīng)注意PCR產(chǎn)物的氣溶膠污染以防出現(xiàn)假陽性:此外,病毒核酸檢測陽性并不等于標本中存在有感染性的活病毒。隨著PCR技術(shù)的廣泛應(yīng)用,派生出了一系列的

41、新技術(shù)和方法,根據(jù)不同的檢測目的可以選用相適應(yīng)的技術(shù)方法。利用實時定量PCR法(real time quantitatice PCR)檢測病毒載量;利用原位(in situ) PCR法定位檢測細胞或組織中的病毒感染;利用巢式(nested) PCR可以提高PCR的敏感性和特異性等等。3、高通量的病毒核酸檢測技術(shù)突發(fā)傳染病病原體的快速鑒定DNA芯片技術(shù)目前基因芯片主要有兩種：一種是DNA合成芯片,在芯片的特定部位原位合成寡核苷酸;另一種是DNA微集芯片,將克隆基因或PCR擴增的基因片段有序地顯微打印到芯片上。DNA芯片技術(shù)的優(yōu)點一次性可以完成大量樣品DNA序列的檢測和分析,最新研發(fā)的高密度病原體

42、基因芯片能檢測1700多種人類病毒。DNA芯片技術(shù)解決了傳統(tǒng)核酸雜交技術(shù)的許多不足,在病毒診斷和流行病學(xué)調(diào)查方面有著廣闊的應(yīng)用前景。六、病毒感染的快速診斷快速診斷主要是指從含有病毒標本及感染機體的血清中檢測病毒顆粒、蛋白抗原、IgM抗體和核酸等，往往在數(shù)小時內(nèi)即可得出結(jié)果。 (一) 形態(tài)學(xué)檢查1.普通光學(xué)顯微鏡檢查2.電鏡和免疫電鏡檢查 1、普通光學(xué)顯微鏡檢查法某些受病毒感染的細胞內(nèi),可形成與正常細胞結(jié)構(gòu)和著色不同的斑塊,稱為包涵體。有些病毒在宿主細胞內(nèi)增殖后，在細胞的一定部位(胞核、胞漿或兩者兼有) 出現(xiàn)一個或數(shù)個、圓形或橢圓形、嗜酸性或嗜堿性的結(jié)構(gòu)，即包涵體。包涵體對病毒感染的診斷有一定價值。光學(xué)顯微鏡是病毒診斷的輔助方法之一,借助染色技術(shù)可以直接觀察病毒產(chǎn)生的核內(nèi)或胞漿內(nèi)包涵體和病毒感染細胞的具體形態(tài)。應(yīng)用光學(xué)顯微鏡檢查包涵體,根據(jù)不同病毒包涵體的形態(tài)、染色、存在部位的差異,可輔助診斷某些病毒性疾病。例如從病犬大腦海馬會發(fā)現(xiàn)胞漿中嗜酸性包涵體(內(nèi)基小體),即可確診為狂犬病;在麻疹病毒感染細胞的核內(nèi)及胞漿