植物組織培養(yǎng)技術(shù)(二)ppt課件

1、二 環(huán)境條件在植物組織培育中溫度、光照、濕度等各種環(huán)境條件，培育基組成、pH值、浸透壓等各種化學(xué)環(huán)境條件都會(huì)影響組織培育育苗的生長(zhǎng)和發(fā)育。 溫度(temperature) 由于溫度是植物組織培育中的重要要素，所以植物組織培育在最適宜的溫度下生長(zhǎng)分化才干表現(xiàn)良好，大多數(shù)植物組織培育都是在2327之間進(jìn)展，普通采用25 2。低于15時(shí)培育，植物組織會(huì)表現(xiàn)生長(zhǎng)停頓，高于35時(shí)對(duì)植物生長(zhǎng)不利。但是，不同植物培育的適溫不同，百合的最適溫度是20、月季足25-27、番茄是28。溫度不僅影響植物組織培育育苗的生長(zhǎng)速度，也影響其分化增殖以及器官建成等發(fā)育進(jìn)程。如煙草芽的構(gòu)成以28為最好，在120以下，33以上

2、構(gòu)成率皆最低。不同培育目的采用的培育溫度也不同，百合鱗片在30以下再生的小鱗莖的發(fā)葉速度和百分率都比在25以下的高。桃胚在25條件進(jìn)展一定時(shí)間的低溫處置，有利于提高胚培育成活率。用35處置草莓的莖尖分生組織35d，可得到無病毒苗。 光照(light) 組織培育中光照也是重要的條件之一，主要表如今光強(qiáng)、光質(zhì)、以及光照時(shí)間方面 1光照強(qiáng)度(light intensity)光照強(qiáng)度對(duì)培育細(xì)胞的增殖和器官的分化有重要影響，從目前的研討情況看，光照強(qiáng)度對(duì)外植體及細(xì)胞的最初分裂有明顯的影響。普通來說，光照強(qiáng)度較強(qiáng)，幼苗生長(zhǎng)的粗壯，而光照強(qiáng)度較弱幼苗容易徒長(zhǎng)。2光質(zhì)(light wave)光質(zhì)對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)

3、，培育組織的增殖以及器官的分化都有明顯的影響。如百合珠芽在紅光下培育，8周后，分化出愈傷組織。但在藍(lán)光下培育，幾周后才出現(xiàn)愈傷組織，而唐菖蒲子球塊接種15d后，在藍(lán)光下培育首先出現(xiàn)芽，構(gòu)成的幼苗生長(zhǎng)旺盛，而白光下幼苗纖細(xì)。3光周期(light period)試管苗培育時(shí)要選用一定的光暗周期來進(jìn)展組織培育，最常用的周期是16h的光照，8h的黑暗。研討闡明，對(duì)短日照敏感的種類的器官組織，在短日照下易分化，而在長(zhǎng)日照下產(chǎn)生愈傷組織，有時(shí)需求暗培育，尤其是一些植物的愈傷組織在暗下比在光下更好。如紅花、烏飯樹的愈傷組織。 濕度 (humidity)濕度的影響包括培育容器堅(jiān)持和環(huán)境的濕度條件，容器內(nèi)主要受

4、培育基水分含量和封口資料的影響。前者又受瓊脂含量的影響。在冬季應(yīng)適當(dāng)減少瓊脂用量，否那么，將使培育基干硬，以致不利于外植體接觸或插進(jìn)培育基，導(dǎo)致生長(zhǎng)發(fā)育受阻。封口資料直接影響容器內(nèi)濕度情況，但封鎖性較高的封口資料易引起透氣性受阻，也會(huì)導(dǎo)致植物生長(zhǎng)發(fā)育受影響。環(huán)境的相對(duì)濕度可以影響培育基的水分蒸發(fā)，普通要求70%80%的相對(duì)濕度，常用加濕器或經(jīng)常灑水的方法來調(diào)理濕度。濕度過低會(huì)使培育基喪失大量水分，導(dǎo)致培育基各種成分濃度的改動(dòng)和浸透壓的升高，進(jìn)而影響組織培育的正常進(jìn)展。濕度過高時(shí)，易引起棉塞長(zhǎng)霉，呵斥污染。 浸透壓(penetrating pressure)培育基中由于有添加的鹽類、蔗糖等化合物

5、，因此，而影響到浸透壓的變化。通常12個(gè)大氣壓對(duì)植物生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，2個(gè)大氣壓以上就對(duì)植物生長(zhǎng)有妨礙作用，而56個(gè)大氣壓植物生長(zhǎng)就會(huì)完全停頓，6個(gè)大氣壓植物細(xì)胞就不能生存。pH值 (pH value)不同的植物對(duì)培育基最適pH值的要求也是不同的(表21)，大多在5、65左右，普通培育基皆要求5.8，這根天性順應(yīng)大多植物培育的需求。 pH值適度因資料而異，也因培育基的組成而不同。以硝態(tài)氮作氮源和以銨態(tài)氮作氮源就不一樣，后者較高一些。普通來說當(dāng)pH值高于65時(shí)，培育基全變硬；低于5時(shí)，瓊脂不能很好地凝固。由于高溫滅菌會(huì)降低pH值(約0.20.3個(gè)pH值)因此在配制時(shí)常提高pH值0203單位。pH值

6、大小調(diào)整可用01M的NaOH和0IM的HCI來調(diào)整。lml的NaOH可使pH值升高02單位，lml的HCl可使pH值降低02單位。調(diào)理時(shí)一定要充分?jǐn)嚢杈鶆颉?種類最適pH值種類最適pH值杜鵑4.0月季5.8越桔4.5胡蘿卜、石刁柏6.0蠶豆5.5桃7.0番茄5.7不同植物的最適pH值 氧氣(oxygen)氧氣是組織培育中必需的要素，瓶蓋封鎖時(shí)要思索通氣問題，可用附有濾氣膜的封口資料。通氣最好的是棉塞封鎖瓶口，但棉塞易使培育基枯燥，夏季易引起污染。固體培育基可加進(jìn)活性炭來添加通氣度，以利于發(fā)根。培育室要經(jīng)常換氣，改善室內(nèi)的通氣情況。液體振蕩培育時(shí)，要思索振蕩的次數(shù)、振幅等，同時(shí)要思索容器的類型、

7、培育基等 第二節(jié) 培育基的制備 一、母液(stock solution)的配制和保管在植物組織培育任務(wù)中，配制培育基是日常必備的任務(wù)。為簡(jiǎn)便起見，通常先配制一系列母液，即貯備液。所謂母液是欲配制液的濃縮液，這樣不但可以保證各物質(zhì)成分的準(zhǔn)確性及配制時(shí)的快速移取，而且還便于低溫保藏。普通母液配成比所需濃度高10-100倍。母液配制時(shí)可分別配成大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)物和激素類等。配制時(shí)留意一些離子之間易發(fā)生沉淀，如Ca2+和S042+，Ca2+、Mg2+和PO43- 一同溶解后，會(huì)產(chǎn)生沉淀，一定要充分溶解再放入母液中。配制母液時(shí)要用蒸餾水或重蒸餾水。藥品應(yīng)選取等級(jí)較高的化學(xué)純或分析純。藥品的

8、稱量及定容都要準(zhǔn)確。各種藥品先以少量水讓其充分溶解，然后依次混合。普通配成大量元素、微量元素、鐵鹽、維生素等母液，其中維生素、氨基酸類可以分別配制，也可以混在一同。母液配好后放人冰箱內(nèi)低溫保管，用時(shí)再按比例稀釋。 母液的配制方法：?jiǎn)闻浞ǎ簩⑴嘤浞街械母鞣N成分分別配成一定濃度的母液。普通用a:b表示，即每b毫升溶液中含有a毫克溶質(zhì)?；炫浞ǎ簩最悹I(yíng)養(yǎng)成分按配方中的用量擴(kuò)展一定倍數(shù)稱量，分別溶解后每一類混合在一同定容到一定體積配成混合母液，濃度可用a mg/L表示，即配制一升培育基汲取該母液a ml.生長(zhǎng)素配制時(shí)可先用少量95%酒精助溶。2，4D可用O1molL的NaOH或KOH助溶，參與溫水

9、定容。生長(zhǎng)素常配成1mgml的溶液貯于冰箱中備用。細(xì)胞分裂素類普通先用少量1N鹽配溶解后，再參與溫水冷卻后定容，鐵鹽配法MS為例：在裝有400ml 蒸餾水的燒杯中參與2?？列遭c，溶解后參與3.73g EDTA-Na2，加熱使其全部溶解，然后邊攪拌邊漸漸參與2.78g FeSO4.7H2O直至全部溶解，冷卻后定容至500ml，置于冰箱中備用。第三節(jié) 培育基的選擇在建立一個(gè)新的實(shí)驗(yàn)體系時(shí)，為了能研制出一種適宜的培育基，最好先由一種已被廣泛運(yùn)用的根本培育基(如Ms培育基或B5培育基)開場(chǎng)。當(dāng)經(jīng)過一系列的實(shí)驗(yàn)，對(duì)這種培育基做了某些定性和定量的小變動(dòng)之后，即有能夠得到一種能滿足實(shí)驗(yàn)需求的新培育基，選擇最

10、正確培育基。常用實(shí)驗(yàn)方法主要有單因子實(shí)驗(yàn)、多因子實(shí)驗(yàn)及廣譜實(shí)驗(yàn)等。 一、單因子實(shí)驗(yàn)在單因子實(shí)驗(yàn)中由于培育基中其他成分都維持在普通程度上，所以只變動(dòng)一個(gè)因子，就可以找出這一因子對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響和影響的程度。例如Ms根本培育基的其他成分和用量都不變，只變動(dòng)NAA用量對(duì)某一培育物生根的影響，這種只研討一個(gè)要素的實(shí)驗(yàn)就是單因子實(shí)驗(yàn)。生物學(xué)實(shí)驗(yàn)不同于物理學(xué)或化學(xué)實(shí)驗(yàn)，最顯著的差別是在生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中必需設(shè)置對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組可以有一組或幾組，隨實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜性而設(shè)置，對(duì)照組也能夠有一組以上。實(shí)驗(yàn)中要求對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組中的實(shí)驗(yàn)個(gè)體，即植物組織塊或其他培育物，必需在遺傳性、生理形狀、前培育條件等方面，盡能夠完全一致。

11、以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果是來源于實(shí)驗(yàn)因子，而不是由于實(shí)驗(yàn)資料的不一致導(dǎo)致的。實(shí)驗(yàn)中各處置普通都要設(shè)有一定的反復(fù)，以獲得可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。隨實(shí)驗(yàn)規(guī)模和要求不同，大多每個(gè)工程要有410瓶，每瓶至少3塊培育物或3叢小幼苗。2種激素5種濃度的實(shí)驗(yàn)組合6-BAmg/L） 0 0.5 2.5 5 10NAA 0 1 2 3 4 5(mg/L) 0.5 6 7 8 9 10 2.5 11 12 13 14 15 5 16 17 18 19 20 10 21 22 23 24 25 對(duì)培育基中兩個(gè)或兩個(gè)以上要素進(jìn)展研討的實(shí)驗(yàn)稱為多因子實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)可采用完全實(shí)驗(yàn)方案，也可選用正交設(shè)計(jì)方案，完全實(shí)驗(yàn)方案具有平衡完全的特點(diǎn)，各個(gè)

12、因子的每個(gè)程度都相互搭配，構(gòu)成了一切能夠的處置組合，如研討NAA和6BA的最正確濃度組合，每個(gè)因子各設(shè)5個(gè)濃度程度(0，0.5，2.5，5，10mgL)，這兩種因子各種濃度的一切組合，就構(gòu)成了一個(gè)具有25項(xiàng)處置的實(shí)驗(yàn)見表33。 二、多因子實(shí)驗(yàn)完全實(shí)驗(yàn)方案實(shí)驗(yàn)因子越多，處置數(shù)越多，實(shí)驗(yàn)越復(fù)雜，耗費(fèi)的精神、物力越多。為了減少實(shí)驗(yàn)處置，但又能準(zhǔn)確全面地獲得實(shí)驗(yàn)信息，通常采用正交實(shí)驗(yàn)。例如，采用正交設(shè)計(jì)，在運(yùn)用此表時(shí)就可以安排4個(gè)因子，3種程度的實(shí)驗(yàn)，一共做9種不同搭配的實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果相當(dāng)于做了27次種種搭配的實(shí)驗(yàn)。正交實(shí)驗(yàn)雖然是多要素搭配在一同的實(shí)驗(yàn)，但是在實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析中，每一種要素所起的作用卻又可

13、以明白無誤地表現(xiàn)出來。因此，一次系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，就可以把問題分析得清清楚楚，用有限的時(shí)間獲得成倍的收獲。在組織培育研討中，可用于同時(shí)探求培育基中適宜的幾種成分的用量，如細(xì)胞分裂素、生長(zhǎng)素、糖和其他成分的用量。三、逐漸添加和逐漸排除的實(shí)驗(yàn)方法在植物組織分化與再生的研討中，在沒有獲得可靠的分化與再生之前，往往添加各種有機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分，而在獲得了穩(wěn)定的再生之后，就可以逐漸減少這些成分。在逐漸添加時(shí)是使實(shí)驗(yàn)勝利，在逐漸減少時(shí)是減少范圍，以便找到最有影響力的因子，或是為了適用上的需求竭力使培育基簡(jiǎn)化，以降低本錢和利于推行。在尋求最正確激素配比時(shí)，也經(jīng)常用到這種加加減減的簡(jiǎn)一方法。 四、廣譜實(shí)驗(yàn)法在廣譜實(shí)驗(yàn)法

14、中，把培育基中一切組分分為4大類：無機(jī)鹽、有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(蔗糖、氨基酸和肌醇等)、生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素。對(duì)每一類物質(zhì)選定低(L)、中(M)、和高(H)3個(gè)濃度。4類物質(zhì)各3種濃度的自在組合即構(gòu)成了一項(xiàng)包括81個(gè)處置的實(shí)驗(yàn)。在這81個(gè)處置中最好的一個(gè)可用4個(gè)字母表示。例如，一個(gè)包含中等濃度無機(jī)鹽，低等濃度生長(zhǎng)素、中等濃度細(xì)胞分裂素和高等濃度有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的處置即可表示為MLMH。到達(dá)這個(gè)階段，再試用不同類型的生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素即可找到培育基的最正確配方。這是由于不同類型的生K素和細(xì)胞分裂素對(duì)不同植物的活性有所不同。 第四章 操作技術(shù) 第一節(jié) 滅菌和接種 滅菌是組織培育重要的任務(wù)之一。初學(xué)者首先要清楚有

15、菌和無菌的范疇。有菌的范疇是：凡是暴露在空氣中的物體，接觸自然水源的物體，至少它的外表都是有菌的。依此觀念，無菌室等未經(jīng)處置的地方、超凈臺(tái)外表、簡(jiǎn)單煮沸的培育基、我們運(yùn)用的刀、剪在未處置之前、我們身體的整個(gè)外表及與外界相連的內(nèi)表，如整個(gè)消化道、呼吸道，即我們呼出的氣體、培育容器無論洗得多干凈等等都是有菌的。這里所指的菌，包括細(xì)菌、真菌、放線菌、藻類及其他微生物。茵的特點(diǎn)是：極小，肉眼看不見。無處不在，無時(shí)不有，無孔不人。在自然條件下忍受力強(qiáng)，生活條件要求簡(jiǎn)單，繁衍力極強(qiáng)，條件適宜時(shí)便可大量繁殖。 無菌的范疇是：經(jīng)高溫灼燒或一定時(shí)間蒸煮過后的物體，經(jīng)其他物理的或化學(xué)的滅菌方法處置后的物體(當(dāng)然這

16、些方法必需曾經(jīng)證明是有效的)，高層大氣、巖石內(nèi)部、安康的動(dòng)、植物的不與外部接觸的組織內(nèi)部，強(qiáng)酸強(qiáng)堿，化學(xué)元素滅菌劑等外表和內(nèi)部等等都是無菌的。從以上可以看出：在地球外表無菌世界要比有菌世界小得多。菌是指用物理或化學(xué)的方法，殺死物體外表和孔隙內(nèi)的一切微生物或生物體，即把一切生命的物質(zhì)全部殺死。與此相關(guān)的一個(gè)概念是消毒，它指殺死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再發(fā)生危害作用，顯然經(jīng)過消毒，許多細(xì)菌芽孢、霉菌的厚垣孢子等不會(huì)完全殺死，即由于在消毒后的環(huán)境里和物品上還有活著的微生物，所以經(jīng)過嚴(yán)厲滅菌的操作空間(接種室、超凈臺(tái)、等)和運(yùn)用的器皿，以及操作者的穿著和手都不帶任何活著的微生物。在這樣的條件

17、下進(jìn)展的操作，就叫做無菌操作。 常用的滅菌方法常用的滅菌方法可分為物理的和化學(xué)的兩類，即：物理方法如干熱(烘燒和灼燒)、濕熱(常壓或高壓蒸煮)、射線處置(紫外線、超聲波、微波)、過濾、清洗和大量無菌水沖洗等措施；化學(xué)方法是運(yùn)用升汞、甲醛、過氧化氫、高錳酸鉀、來蘇兒、漂白粉、次氯酸鈉、抗菌素、酒精化學(xué)藥品處置。這些方法和藥劑要根據(jù)任務(wù)中的不同資料不同目的適中選用。 濕熱滅菌培育基培育基在制備后的24h內(nèi)完成滅菌工序。高壓滅菌的原理是：在密閉的蒸鍋內(nèi)，其中的蒸氣不能外溢，壓力不斷上升，使水的沸點(diǎn)不斷提高，從而鍋內(nèi)溫度也隨之添加。在o1MPa的壓力下，鍋內(nèi)溫度達(dá)121。在此蒸氣溫度下，可以很快殺死各

18、種細(xì)菌及其高度耐熱的芽孢。留意完全排除鍋內(nèi)空氣，使鍋內(nèi)全部是水蒸氣，滅菌才干徹底。高壓滅菌放氣有幾種不同的做法，但目的都是要排凈空氣，使鍋內(nèi)均勻升溫，保證滅菌徹底。常用方法是：封鎖放氣閥，通電后，待壓力上升到O05MPa時(shí)，翻開放氣閥，放出空氣，待壓力表指針歸零后，再封鎖放氣閥。關(guān)閥再通電后，壓力表上升到達(dá)01MPa時(shí)壓力01-015MPa，20min。對(duì)高壓滅菌后不蛻變的物品，如無菌水、栽培介質(zhì)、接種器具，可以延伸滅菌時(shí)間或提高壓力。而培育基要嚴(yán)厲遵守保壓時(shí)間，既要保壓徹底，又要防止培育基中的成分蛻變或效能降低，不能隨意延伸時(shí)間。對(duì)于一些布制品，照實(shí)驗(yàn)服、口罩等也可用高壓滅菌。洗凈晾干后用耐

19、高壓塑料袋裝好，高壓滅菌20-30min。高壓滅菌前后的培育基，其pH值下降0.2-0.3單位。高壓后培育基pH值的變化方向和幅度取決于多種要素。在高壓滅菌前用堿調(diào)高pH值至預(yù)定值的那么相反。培育基中成分單一時(shí)和培育基中含有高或較高濃度物質(zhì)時(shí)，高壓滅菌后的pH值變化幅度較大，甚至可大于2個(gè)pH值單位。環(huán)境pH值的變化大于0.5單位就有能夠產(chǎn)生明顯的生理影響。高壓滅菌通常會(huì)使培育基中的蔗糖水解為單糖，從而改動(dòng)培育基的浸透壓。在8%-20%蔗糖范圍內(nèi)，高壓滅菌后的培育基約升高043倍。培育基中的鐵在高壓滅菌時(shí)會(huì)催化蔗糖水解，可使15%-25%的蔗糖水解為葡萄糖和果糖。培育基值小于5.5，其水解量更

20、多，培育基中添加0.1%活性炭時(shí)，高壓下蔗糖水解大大加強(qiáng)，添加1%活性炭，蔗糖水解率可達(dá)5%。 防止高壓滅菌培育基變化的方法：(1)經(jīng)常留意搜集有關(guān)高壓滅菌影響培育基成分的資料，及時(shí)采取有效措施。(2)設(shè)計(jì)培育基配方時(shí)盡量采用效果類似的穩(wěn)定試劑并準(zhǔn)確掌握劑量。如防止運(yùn)用果糖和山梨醇而用甘露醇，以IBA替代IAA，控制活性炭的用量(在0.1%以下)留意pH值對(duì)高壓滅菌下培育基中成分的影響等。(3)配制培育基時(shí)應(yīng)留意成分的適當(dāng)分組與參與的順序。如將磷、鈣和鐵放在最后參與。(4)留意高壓滅菌后培育基pH值的變化及回復(fù)動(dòng)態(tài)。如高壓滅菌后的pH值常由5.80升高至6.48。而96h后又回降至5.8左右。

21、這樣在實(shí)驗(yàn)中就可以根據(jù)這一規(guī)律加以掌握。 灼燒滅菌用于無菌操作的器械 在無菌操作時(shí)，把鑷子、剪子、解剖刀等浸入95%的酒精中，運(yùn)用之前取出在酒精燈火焰卜灼燒火菌。冷卻后，立刻便用。操作中可采用250或500ml的廣口瓶，放入95%的酒精，以便插入工具。 干熱滅菌玻璃器皿及耐熱器具干熱滅菌是利用烘箱加熱到160-180C的溫度來殺死微生物。由于在干熱條件下，細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的抗熱性大為提高，接近芽抱的抗熱程度，通常采用170繼續(xù)90min來滅菌。干熱滅菌的物品要預(yù)先洗凈并枯燥，工具等要妥為包扎，以免滅菌后取用時(shí)重新污染。包扎可用耐高溫的塑料。滅菌時(shí)應(yīng)漸進(jìn)升溫，到達(dá)頂定溫度后記錄時(shí)間。烘箱內(nèi)放置的物

22、品的數(shù)量不宜過多，以免妨礙熱對(duì)流和穿透，到指定時(shí)延續(xù)電后，待充分冷涼，才干翻開烘箱，以免因驟冷而使器皿破裂。干熱滅菌能源耗費(fèi)太大，浪費(fèi)時(shí)間。 過濾滅菌不耐熱的物質(zhì) 一些生長(zhǎng)調(diào)理劑，如赤霉素、玉米素、零落酸和某些維生素是不耐熱的，不能用高壓滅菌處置，通常采用過濾滅菌方法。防細(xì)菌濾膜的網(wǎng)孔的直徑為0.45m以下，當(dāng)溶液經(jīng)過濾膜后，細(xì)菌的細(xì)胞和真菌的孢子等因大于濾膜直徑而被阻，在需求過濾滅菌的液體量大時(shí)，常運(yùn)用抽濾安裝；液量小時(shí)，可用注射器。運(yùn)用前對(duì)其高壓滅菌，將濾膜裝在注射器的靠針管處，將待過濾的液體裝入注射器，推壓注射器活塞桿，溶液壓出濾膜，從針管壓出的溶液就是無菌溶液。 紫外線和熏蒸滅菌空間(

23、1)紫外線滅菌 在接種室、超凈臺(tái)上或接種箱里用紫外燈滅菌。紫外線滅菌是利用輻射因子滅菌，細(xì)菌吸收紫外線后，蛋白質(zhì)和核酸發(fā)生構(gòu)造變化，引起細(xì)菌的染色體變異，呵斥死亡。紫外線的波長(zhǎng)為200300nm，其中以260nm的殺菌才干最強(qiáng)，但是由于紫外線的穿透物質(zhì)的才干很弱，所以只適于空氣和物體外表的滅菌，而且要求距照射物以不超越1.2m為宜。(2)熏蒸滅菌 用加熱熄滅、氧化等方法，使化學(xué)藥劑變?yōu)闅怏w形狀分散到空氣中，以殺死空氣和物體外表的微生物。這種方法簡(jiǎn)便，只需求把消毒的空間封鎖嚴(yán)密即可。常用熏蒸劑是甲醛，熏蒸時(shí)，房間封鎖嚴(yán)密，按58mlm3用量，將甲醛置于廣口容器中，加5g/m3高錳酸鉀氧化揮發(fā)。熏

24、蒸時(shí)，房間可預(yù)先噴濕以加強(qiáng)效果。冰醋酸也可進(jìn)展加熱熏蒸，但效果不如甲醛。 化學(xué)消毒劑的種類很多，它們使微生物的蛋白量變性，或競(jìng)爭(zhēng)其酶系統(tǒng)，或降低其外表張力，添加菌體細(xì)胞漿膜的通透性，使細(xì)胞破裂或溶解。普通說來，溫度越高，作用時(shí)間越長(zhǎng)，殺菌效果越好。另外，由于消毒劑必需溶解于水才干發(fā)揚(yáng)作用，所以要制成水溶形狀，如升汞與高錳酸鉀。還有消毒劑的濃度普通是濃度越大，殺菌才干越強(qiáng)，但石炭酸和酒精例外。噴霧滅菌物體外表物體外表可用一些藥劑涂擦、噴霧滅菌。如桌面、墻面、雙手、植物資料外表等，可用70%的酒精反復(fù)涂擦滅菌，l%-2%的來蘇兒溶液以及0.25%1%的新潔爾滅也可以。植物資料外表用消毒劑滅菌從外界

25、或室內(nèi)選取的植物資料，都不同程度地帶有各種微生物。這些污染源一旦帶人培育基，便會(huì)呵斥培育基污染。因此，植物資料必需經(jīng)嚴(yán)厲的外表滅菌處置，再經(jīng)無菌操作手續(xù)接到培育基上，這一過程叫做接種。 第一步，將采來的植物資料除去不用的部分，將需求的部分仔細(xì)洗干凈，如用適當(dāng)?shù)乃⒆拥人⑾?。把資料切割成適當(dāng)大小，即滅菌容器能放人為宜。置自來水龍頭下流水沖洗幾分鐘至數(shù)小時(shí)，沖洗時(shí)間視資料清潔程度而宜。易漂浮或細(xì)小的資料，可裝入紗布袋內(nèi)沖洗。流水沖洗在污染嚴(yán)重時(shí)特別有用。洗時(shí)可參與洗衣粉清洗，然后再用自來水沖凈洗衣粉水。洗衣粉可除去輕度附著在植物外表的污物，除去脂質(zhì)性的物質(zhì)，便于滅菌液的直接接觸。當(dāng)然，最理想的清洗物

26、質(zhì)是外表活性物質(zhì)吐溫。第二步是對(duì)資料的外表浸潤(rùn)滅菌。要在超凈臺(tái)或接種箱內(nèi)完成，預(yù)備好消毒的燒杯、玻璃棒、70%酒精、消毒液、無菌水、手表等。用70%酒精浸1030s。由于酒精具有使植物資料外表被浸濕的作用，加之70%酒精穿透力強(qiáng)，也很易殺傷植物細(xì)胞，所以浸潤(rùn)時(shí)間不能過長(zhǎng)。有一些特殊的資料，假照實(shí)、花蕾、包有苞片、苞葉等的孕穗，多層鱗片的休眠芽等等，以及主要取用內(nèi)部的資料，那么可只用70%酒精處置稍長(zhǎng)的時(shí)間。處置完的資料在無菌條件下，待酒精蒸發(fā)后再剝除外層，取用內(nèi)部資料。第三步是用滅菌劑處置。外表滅菌劑的種類較多，可根據(jù)情況選取12種運(yùn)用見表。滅菌劑使用濃度(%)持續(xù)時(shí)間（min）去除的難易效果

27、次氯酸鈣910530易很好次氯酸鈉2530易很好氯化汞0.1158較難最好抗菌素450mg/L3060中較好常用滅菌劑運(yùn)用濃度及效果比較表上述滅菌劑應(yīng)在運(yùn)用前暫時(shí)配制，氯化汞可短期內(nèi)貯用。次氯酸鈉和次氯酸鈣都是利用分解產(chǎn)生氯氣來殺菌的，故滅菌時(shí)用廣口瓶加蓋較好；升汞是由重金屬汞離子來到達(dá)滅菌的；過氧化氫是分解中釋放原子態(tài)氧來殺菌的，這種藥劑殘留的影響較小，滅菌后用無菌水涮洗34次即可；由于用升汞液滅菌的資料，難以對(duì)升汞殘毒較難去除，所以該當(dāng)用無菌水涮洗810次，每次不少于3min，以盡量去除殘毒。滅菌時(shí)，把瀝干的植物資料轉(zhuǎn)放到燒杯或其他器皿中，記好時(shí)間，倒人消毒溶液，不時(shí)用玻璃棒悄然攪動(dòng)，以促

28、進(jìn)資料各部分與消毒溶液充分接觸，驅(qū)除氣泡，使消毒徹底。在快到時(shí)間之前12min，開場(chǎng)把消毒液傾人一備好的大燒杯內(nèi)，要留意勿使資料倒出，傾凈后立刻倒入無菌水，輕攪涮洗。滅菌時(shí)間是從倒人消毒液開場(chǎng)，至倒入無菌水時(shí)為止。記錄時(shí)間還便于比較消毒效果，以便矯正。滅菌液要充分浸沒資料，寧可多用些滅菌液，切勿勉強(qiáng)在一個(gè)體積偏小的容器中運(yùn)用很多資料滅菌。在滅菌溶液中加吐溫80或Tnton X效果較好，這些外表活性劑主要作用是使藥劑更易于展布，更容易浸人到滅菌的資料外表。但吐溫加人后對(duì)資料的損傷也在添加，應(yīng)留意吐溫的用量和滅菌時(shí)間，普通參與滅菌液的O.5%，即在100ml參與15滴。最后一步是用無菌水涮洗，涮洗

29、要每次3min左右，視采用的消毒液種類，涮洗3-l0次左右。無菌水涮洗作用是免除消毒劑殺傷植物細(xì)胞的副作用。 二、無菌操作接種時(shí)由于有一個(gè)敞口的過程，所以是極易引起污染的時(shí)期，這一時(shí)期主要由空氣中的細(xì)菌和任務(wù)人員本身引起，接種室要嚴(yán)厲進(jìn)展空間消毒。接種室內(nèi)堅(jiān)持定期用1%3%的高錳酸鉀溶液對(duì)設(shè)備、墻壁、地板等進(jìn)展擦洗。除了運(yùn)用前用紫外線和甲醛滅菌外，還可在運(yùn)用期間用70%的酒精或3%的來蘇兒噴霧，使空氣中灰塵顆粒沉降下來。無菌操作可按以下步驟進(jìn)展： (1)在接種4h前用甲醛熏蒸接種室，并翻開其內(nèi)紫外燈進(jìn)展滅菌；(2)在接種前20min，翻開超凈任務(wù)臺(tái)的風(fēng)機(jī)以及臺(tái)上的紫外燈；(3)接種員先洗凈雙手

30、，在緩沖間換好公用實(shí)驗(yàn)服，并換穿拖鞋等；(4)上任務(wù)臺(tái)后，用酒精棉球擦拭雙手，特別是指甲處。然后擦拭任務(wù)臺(tái)面；(5)先用酒精棉球擦拭接種工具，再將鑷子和剪子從頭至尾過火一遍，然后反復(fù)過火尖端處，對(duì)培育皿要過火烤干；(6)接種時(shí)，接種員雙手不能分開任務(wù)臺(tái)，不能說話、走動(dòng)和咳嗽等；(7)接種終了后要清理干凈任務(wù)臺(tái)，可用紫外燈滅菌30min。假設(shè)延續(xù)接種，每5天要大強(qiáng)度滅菌一次。三、接種 (1)將初步洗滌及切割的資料放人燒杯，帶入超凈臺(tái)上，用消毒劑滅菌，再用無菌水沖洗，最后瀝去水分，取出放置在滅過菌的4層紗布上或?yàn)V紙上。(2)資料吸干后，一手拿鑷子，一手拿剪子或解剖刀，對(duì)資料進(jìn)展適當(dāng)?shù)那懈?。如葉片切

31、成0.5cm見方的小塊；莖切成含有一個(gè)節(jié)的小段。微莖尖要?jiǎng)兂芍缓琹2片幼葉的莖尖大小等。在接種過程中要經(jīng)常灼燒接種器械，防止交叉污染。(3)用灼燒消毒過的器械將切割好的外植體插植或放置到培育基上。詳細(xì)操作過程是：先解開包口紙，將試管幾乎程度拿著，使試管囗接近酒精燈火焰，并將管口在火焰上方轉(zhuǎn)動(dòng)，使管口里外灼燒數(shù)秒鐘。假設(shè)用棉塞蓋口，可先在管口外面灼燒，去掉棉塞，再燒管口里面。然后用鑷子夾取一塊切好的外植體送入試管內(nèi)，悄然插入培育基。假設(shè)是葉片直接附在培育基上，以放13塊為宜。至于資料放置方法除莖尖、莖段要正放(尖端向上)外，其他尚無一致要求。放置資料數(shù)量如今傾向少放，經(jīng)過統(tǒng)計(jì)以為：對(duì)外植體每次接

32、種以一支試管放一枚組塊為宜，這樣可以節(jié)約培育基和人力，一旦培育物污染可以丟棄，接完種后，將管口在火焰上再灼燒數(shù)秒鐘。并用棉塞，塞好后，包上包口紙，包囗紙里面也要過火。第二節(jié) 培育和馴化 指把培育資料放在培育室(有光照、溫度條件)里，使之生長(zhǎng)，分裂和分化構(gòu)成愈傷組織或進(jìn)一步分化成再生植株的過程。 1培育方法(1)固體培育法 即用瓊脂固化培育基來培育植物資料的方法。是如今最常用的方法。雖然該方法設(shè)備簡(jiǎn)單，易行，但營(yíng)養(yǎng)分布不均，生長(zhǎng)速度不平衡，并常有褐化中毒景象發(fā)生。(2)液體培育法 即用不加固化劑的液體培育基培育植物資料的方法。由于液體中氧氣含量較少，所以通常需求經(jīng)過攪動(dòng)或振動(dòng)培育液的方法以確保氧

33、氣的供應(yīng)，采用往復(fù)式搖床或旋轉(zhuǎn)式搖床進(jìn)展培育，其速度普通為50-100rmin，這種定期浸沒的方法，既能使培育基均一，又能保證氧氣的供應(yīng)。 2培育步驟(1)初代培育 初代培育旨在獲得無菌資料和無性繁衍系。即接種某種外植體后，最初的幾代培育。初代培育時(shí)，常用誘導(dǎo)或分化培育基，即培育基中含有較多的細(xì)胞分裂素和少量的生長(zhǎng)素。初代培育建立的無性繁衍系包括：莖梢、芽叢、胚狀體和原球莖等。根據(jù)初代培育時(shí)發(fā)育的方向可分為：1)頂芽和腋芽的發(fā)育采用外源的細(xì)胞分裂素，可促使具有頂芽或沒有腋芽的休眠側(cè)芽啟動(dòng)生長(zhǎng)，從而構(gòu)成 一個(gè)微型的多枝多芽的小灌木叢狀的構(gòu)造。在幾個(gè)月內(nèi)可以將這種叢生苗的一個(gè)枝條轉(zhuǎn)接繼代，反復(fù)芽苗

34、增殖的培育，并且迅速獲得多數(shù)的嫩莖。然后將一部分嫩莖轉(zhuǎn)移到生根培育基上，就能得到可種植到土壤中去的完好的小植株。一些木本植物和少數(shù)草本植物也可以經(jīng)過這種方式來進(jìn)展再生繁衍，如月季、茶花、菊花、香石竹等等。這種繁衍方式也稱作微型扦插，它不經(jīng)過發(fā)生愈傷組織而再生，所以是最能使無性系后代堅(jiān)持原種類特性的一種繁衍方式。適宜這種再生繁衍的植物，在采樣時(shí)，只能采用頂芽、側(cè)芽或帶有芽的莖切段，其他如種子萌生后取枝條也可以。莖尖培育可看作是這方面較為特殊的一種方式。它采用極其幼嫩的頂芽的莖尖分生組織作為外植體進(jìn)展接種。在實(shí)踐操作中，采用包括莖尖分生組織在內(nèi)的一些組織來培育，這樣便保證了操作方便以及容易成活。用

35、靠培育定芽得到的培育物普通是莖節(jié)較長(zhǎng)，有直立向上的莖梢，擴(kuò)繁時(shí)主要用切割莖段法，如香石竹、矮牽牛、菊花等。但特殊情況下也會(huì)生出不定芽，構(gòu)成芽叢。 2)不定芽的發(fā)育在培育中由外植體產(chǎn)生不定芽，通常首先要經(jīng)脫分化過程，構(gòu)成愈傷組織的細(xì)胞。然后，經(jīng)再分化，即由這些分生組織構(gòu)成器官原基，它在構(gòu)成器官的縱軸上表現(xiàn)出單向的極性(這與胚狀體不同)。多數(shù)情況下它先構(gòu)成芽，后構(gòu)成根。另一種方式是從器官中直接產(chǎn)生不定芽，有些植物具有從各個(gè)器官上長(zhǎng)出不定芽的才干如矮牽牛、福祿考、懸鉤子等。當(dāng)在試管培育的條件下，培育基中提供了營(yíng)養(yǎng)，特別是提供了延續(xù)不斷植物激素的供應(yīng)，使植物構(gòu)成不定芽的才干被大大地激發(fā)起來。許多種類的

36、外植體外表幾乎全部為不定芽所覆蓋。在許多常規(guī)方法中不能無性繁衍的種類，在試管條件下卻能較容易地產(chǎn)生不定芽而再生，如柏科，松科，銀杏等一些植物。許多單子葉植物貯藏器官能劇烈地發(fā)生不定芽，用臼合鱗片的切塊就可大量構(gòu)成不定鱗莖。在不定芽培育時(shí)，也常用誘導(dǎo)或分化培育基。用靠培育不定芽得到的培育物，普通采用芽叢進(jìn)展繁衍，如非洲菊、草莓等。3)體細(xì)胞胚狀體的發(fā)生與發(fā)育體細(xì)胞胚狀體類似于合子胚但又有所不同，它也經(jīng)過球形、心形、魚雷形和子葉形的胚胎發(fā)育時(shí)期，最終發(fā)育成小苗。但它是由體細(xì)胞發(fā)生的。胚狀體可以從愈傷組織外表產(chǎn)生，也可從外植體外表已分化的細(xì)胞中產(chǎn)生，或從懸浮培育的細(xì)胞中產(chǎn)生，也可從外植體外表已分化的

37、細(xì)胞中產(chǎn)生，或從懸浮培育的細(xì)胞中產(chǎn)生。 (2)繼代培育在初代培育的根底上所獲得的芽、苗、胚狀體和原球莖等，數(shù)量都還不多，它們需求進(jìn)一步增殖，使之越來越多，從而發(fā)揚(yáng)快速繁衍的優(yōu)勢(shì)。繼代培育是繼初代培育之后的延續(xù)數(shù)代的擴(kuò)繁培育過程。旨在繁衍出相當(dāng)數(shù)量的無根苗，最后能到達(dá)邊繁衍邊生根的目的。繼代培育的后代是按幾何級(jí)數(shù)添加的過程。假設(shè)以2株苗為根底，那么經(jīng)10代將生成210株苗。繼代培育中擴(kuò)繁的方法包括：切割莖段、分別芽叢、分別胚狀體、分別原球莖等。切割莖段常用于有伸長(zhǎng)的莖梢、莖節(jié)較明顯的培育物。這種方法簡(jiǎn)便易行，能堅(jiān)持母種特性。培育基常是MS0根本培育基；分別芽叢適于由愈傷組織生出的芽叢。培育基常是

38、分化培育基。假設(shè)芽叢的芽較小，可先切成芽叢小塊，放人MS0培育基中，待到稍大時(shí)，再別分開來繼續(xù)培育。增殖運(yùn)用的培育基對(duì)于一種植物來說每次幾乎完全一樣由于培育物在接近最良好的環(huán)境條件，營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)和激素調(diào)控下，排除了其他生物的競(jìng)爭(zhēng)，所以可以按幾何級(jí)數(shù)增殖；在快速繁衍中初代培育只是一個(gè)必經(jīng)的過程，而繼代培育那么是經(jīng)常性不停的進(jìn)展過程。但在到達(dá)相當(dāng)?shù)臄?shù)量之后，那么應(yīng)思索使其中一部分轉(zhuǎn)入生根階段。從某種意義上講，增殖只是貯備母株，而生根才是增殖資料的分流，消費(fèi)出廢品。 培育過程中常出現(xiàn)的問題及處理方法初代培育外植體的褐變外植體褐變是指在接種后，其外表開場(chǎng)褐變，有時(shí)甚至?xí)拐麄€(gè)培育基褐變的景象。它的出現(xiàn)是由

39、于植物組織中的多酚氧化酶被激活，而使細(xì)胞的代謝發(fā)生變化所致。在褐變過程中，會(huì)產(chǎn)生醌類物質(zhì)，它們多呈棕褐色，當(dāng)分散到培育基后，就會(huì)抑制其他酶的活性，從而影響所接種外植體的培育。 褐變的主要緣由植物種類 研討闡明，在不同種類間的褐變景象是不同的。由于多酚氧化酶活性上的差別，因此，有些花卉種類的外植體在接種后較容易褐變，而有些花卉種類的外植體在接種后不容易褐變。因此，在培育過程中應(yīng)該有所選擇，對(duì)不同的種類分別進(jìn)展處置。生理形狀 由于外植體的生理形狀不同，所以在接種后褐變程度也有所不同。普通來說，處于幼齡期的植物資料褐變程度較淺，而從曾經(jīng)成年的植株采收的外植體，由于含醌類物質(zhì)較多，因此褐變較為嚴(yán)重。普

40、通來說，幼嫩的組織在接種后褐變程度并不明顯，而老熟的組織在接種后褐變程度較為嚴(yán)重。培育基成分 濃度過高的無機(jī)鹽會(huì)使某些欣賞植物的褐變程度添加，此外，細(xì)胞分裂素的程度過高也會(huì)刺激某些外植體的多酚氧化酶的活性，從而使褐變景象加深。培育條件不當(dāng) 假設(shè)光照過強(qiáng)、溫度過高、培育時(shí)間過長(zhǎng)等，均可使多酚氧化酶的活性提高，從而加速被培育的外植體的褐變程度。減輕褐變景象發(fā)生的方法選擇適宜的外植體 普通來說，最好選擇生優(yōu)點(diǎn)于旺盛的外植體，這樣可以使褐變景象明顯減輕。適宜的培育條件 無機(jī)鹽成分、植物生長(zhǎng)物質(zhì)程度、適宜溫度、及時(shí)繼代培育均可以減輕資料的褐變景象。運(yùn)用抗氧化劑 在培育基中，運(yùn)用半胱氨酸、抗壞血酸、PVP

41、等抗氧化劑可以較為有效地防止或減輕很多外植體的褐變景象。另外，運(yùn)用0.1%-0.5%的活性炭對(duì)防止褐變也有較為明顯的效果。延續(xù)轉(zhuǎn)移 對(duì)容易褐變的資料可間隔1224h的培育后，再轉(zhuǎn)移到新的培育基上，這樣經(jīng)過延續(xù)處置7-l0d后，褐變景象便會(huì)得到控制或大為減輕。 繼代培育時(shí)資料的玻璃化實(shí)際闡明，當(dāng)植物資料不斷地進(jìn)展離體繁衍時(shí)，有些培育物的嫩莖、葉片往往會(huì)呈半透明水漬狀，這種景象通常稱為玻璃化。它的出現(xiàn)會(huì)使試管苗生長(zhǎng)緩慢、繁衍系數(shù)有所下降。玻璃化為試管苗的生理失調(diào)癥。由于出現(xiàn)玻璃化的嫩莖不宜誘導(dǎo)生根，因此，使繁衍系數(shù)大為降低。在不同的種類、種類間，試管苗的玻璃化程度也有所差別。當(dāng)培育基上細(xì)胞分裂素程

42、度較高時(shí)，也容易出現(xiàn)玻璃化景象。在培育基中添加少量聚乙烯醇、零落酸等物質(zhì)，可以在一定程度上減輕玻璃化的景象發(fā)生。 呈現(xiàn)玻璃化的試管苗，其莖、葉外表無蠟質(zhì)，體內(nèi)的極性化合物程度較高，細(xì)胞持水力差，植株蒸騰作用強(qiáng)，無法進(jìn)展正常移栽。這種情況主要是由于培育容器中空氣濕度過高，透氣性較差呵斥的，其詳細(xì)處理的方法為： 添加培育基中的溶質(zhì)程度，以降低培育基的水勢(shì)； 減少培育基中含氮化合物的用量； 添加光照； 添加容器通風(fēng)，最好進(jìn)展CO2施肥，這對(duì)減輕試管苗玻璃化的景象有明顯的作用； 降低培育溫度，進(jìn)展變溫培育，有助于減輕試管苗玻璃化的景象發(fā)生； 降低培育基中細(xì)胞分裂素含量，可以思索參與適量零落酸。 3生根

43、培育當(dāng)資料增殖到一定數(shù)量后，就要使部分培育物分流到生根培育階段。假設(shè)不能及時(shí)將培育物轉(zhuǎn)到生根培育基上去，就會(huì)使久不轉(zhuǎn)移的苗子發(fā)黃老化，或因過分擁堵而使無效苗增多呵斥丟棄浪費(fèi)。根培育是使無根苗生根的過程，這個(gè)過程目的是使生出的不定根濃密而粗壯。生根培育可采用12或者1/4MS培育基，全部去掉細(xì)胞分裂素，并參與適量的生長(zhǎng)素(NAA、IBA等)。誘導(dǎo)生根方法：將新梢基部浸入50或10010-6I IBA溶液中處置48h；在含有生長(zhǎng)素的培育基中培育4-6d；直接移入含有生長(zhǎng)素的生根培育基中。上述三種方法均能誘導(dǎo)新梢生根，但前二種方法對(duì)新生根的生長(zhǎng)發(fā)育那么更為有利。而第三種對(duì)幼根的生長(zhǎng)有抑制造用。其緣由

44、是當(dāng)根原始體構(gòu)成后較高濃度生長(zhǎng)素的繼續(xù)存在，那么不利于幼根的生長(zhǎng)發(fā)育。不過這種方法比較可行。 另外也可采用以下方法就可生根：延伸在增殖培育基中的培育時(shí)間；有意降低一些增殖倍率，減少細(xì)胞分裂素的用量(即將增殖與生根合并為一步)；切割粗壯的嫩枝在營(yíng)養(yǎng)缽中直接生根，此方法那么沒有生根階段?？梢允∪ヒ淮闻嘤圃?，切割下的插穗可用生長(zhǎng)素溶液浸蘸處置，但這種方法只適于一些容易生根的作物。另外少數(shù)植物生根比較困難時(shí)，那么需求在培育基中放置濾紙橋，使其略高于液面，靠濾紙的吸水性供應(yīng)水和營(yíng)養(yǎng)，從而誘發(fā)生根。 從胚狀體發(fā)育成的小苗，經(jīng)常有原先已分化的根，這種根可以不經(jīng)誘導(dǎo)生根階段而生長(zhǎng)。但因經(jīng)胚狀體途徑發(fā)育的苗

45、數(shù)特別多，并且個(gè)體較小，所以也常需求一個(gè)低濃度或沒有植物激素的培育基培育的階段，以便壯苗生根。 試管內(nèi)生根壯苗的階段，為了勝利地將苗移植到試管外的環(huán)境中，以使試管苗順應(yīng)外界的環(huán)境條件。通常不同植物的適宜馴化溫度不同。如菊花，以1820為宜。實(shí)際證明植物生長(zhǎng)的溫度過高不但會(huì)牽涉到蒸騰加強(qiáng)。而且還牽涉到菌類易繁殖的問題。溫度過低使幼苗生長(zhǎng)緩慢，或不易成活。春季低溫時(shí)苗床可加設(shè)電熱線，使墓質(zhì)溫度略高于氣溫23，這不但有利于生根和促進(jìn)根系興隆，而且還有利于提早成活。 移植到試管外的植物苗光強(qiáng)度應(yīng)比移植前培育有所提高，并可順應(yīng)強(qiáng)度較高的漫射光，(約4000h左右)，以維持光協(xié)作用所需光照強(qiáng)度。但光線過強(qiáng)

46、刺激蒸騰加強(qiáng)，會(huì)使水分平衡的矛盾更鋒利。 二、試管苗移栽馴化試管苗移栽是組織培育過程的重要環(huán)節(jié)，這個(gè)任務(wù)環(huán)節(jié)做不好，就會(huì)呵斥前功盡棄。為了做好試管苗的移栽，應(yīng)選擇適宜的基質(zhì)，并配合以相應(yīng)的管理措施，才干確保整個(gè)組織培育任務(wù)的順利完成。 試管苗由于是在無菌、有營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)、適宜光照和溫度近100%的相對(duì)濕度環(huán)境條件下生長(zhǎng)的，因此，在生理、形狀等方面都與自然條件生長(zhǎng)的正常小苗有著很大的差別。所以必需經(jīng)過煉苗，例如經(jīng)過控水、減肥、增光、降溫等措施，使它們逐漸地順應(yīng)外界環(huán)境，從而使生理、形狀、組織上發(fā)生相應(yīng)的變化，使之更適宜于自然環(huán)境，只需這樣才干保證試管苗順利移栽勝利。 從葉片上看，試管苗的角質(zhì)層不興隆

47、，葉片通常沒有表皮毛，或僅有較少表皮毛，甚至葉片上出現(xiàn)了大量的水孔，而且，氣孔的數(shù)量、大小也往往超越普通苗。由此可知，試管苗更適宜于高濕的環(huán)境生長(zhǎng)，當(dāng)將它們移栽到試管外環(huán)境時(shí)，試管苗失水率會(huì)很高，非常容易死亡。因此，為了改善試管苗的上述不良生理、形狀特點(diǎn)，那么必需經(jīng)過與外界相順應(yīng)的馴化處置另外，對(duì)栽培馴化基質(zhì)要進(jìn)展滅菌，由于試管苗在無菌的環(huán)境中生長(zhǎng)，對(duì)外界細(xì)菌、真菌的抵御才干極差。為了提高其成活率，在培育基質(zhì)中可摻入75%的百菌清可濕性粉劑200-500倍液，以進(jìn)展滅菌處置。 ，通常采取的措施有：對(duì)外界要添加濕度、減弱光照；對(duì)試管內(nèi)要通透氣體、增施二氧化碳肥料、逐漸降低空氣濕度等。 移栽用基質(zhì)

48、 適宜于栽種試管苗的基質(zhì)要具備透氣性、保濕性和一定的肥力，容易滅菌處置，并不利于雜菌繁殖的特點(diǎn)，普通可選用珍珠巖、蛭石、砂子等。為了添加粘著力和一定的肥力可配合草炭土或腐殖土。配時(shí)需按比例搭配，普通用珍珠巖，蛭石，草炭土或腐殖土比例為1:1:0.5。也可用砂子：草炭土或腐殖土為1:1。這些介質(zhì)在運(yùn)用前應(yīng)高壓滅菌?；蛴弥辽?h烘烤來消滅其中的微生物。要根據(jù)不同植物的栽培習(xí)性來進(jìn)展配制，這樣才干獲得稱心的栽培效果。以下引見幾種常見的試管苗栽培基質(zhì)。 (1)河砂:河砂分為粗砂、細(xì)砂兩種類型。粗砂即平常所說的河砂，其顆粒直徑為12mm。細(xì)砂即通常所說的面砂，其顆粒直徑為0.10.2mm。河砂的特點(diǎn)是排

49、水性強(qiáng)，但保水蓄肥才干較差，普通不單獨(dú)用來直接栽種試管苗。(2)草炭土:草炭土是由堆積在沼澤中的植物殘骸經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的腐爛所構(gòu)成，其保水性好，蓄肥才干強(qiáng)，呈中性或微酸性反響，但通常不能單獨(dú)用來栽種試管苗，宜與河砂等種類相互混合配成盆土而加以運(yùn)用。(3)腐殖土:腐殖土是由植物落葉經(jīng)腐爛所構(gòu)成。一種是自然構(gòu)成，一種是人為呵斥，人工制造時(shí)可將秋季的落葉搜集起來，然后埋人坑中，灌水壓實(shí)令其腐爛。第二年春季將其取出置于空氣中，在經(jīng)常噴水保濕的條件下使其風(fēng)化，然后過篩即可獲得。腐葉上含有大量的礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)、有機(jī)物質(zhì)，它通常不能單獨(dú)運(yùn)用。摻有腐殖土的栽培基質(zhì)有助于植株發(fā)根。移栽前的練苗移栽前可將培育物不開口移到自

50、然光照下鍛煉23d，讓試管苗接受強(qiáng)光的照射，使其長(zhǎng)得壯實(shí)起來，然后再開口練苗12d，經(jīng)受較低濕度的處置，以順應(yīng)未來自然濕度的條件。移栽和幼苗的管理從試管中取出發(fā)根的小苗，用自來水洗掉根部粘著的培育基，要全部除去，以防殘留培育基繁殖雜菌。但要悄然除去，應(yīng)防止呵斥傷根。栽植時(shí)用一個(gè)筷子粗的竹簽在基質(zhì)中插一小孔，然后將小苗插入，留意幼苗較嫩，防止弄傷，栽后把苗周圍基質(zhì)壓實(shí)，栽前基質(zhì)要澆透水。栽后輕澆薄水。再將苗移入高濕度的環(huán)境中。保證空氣濕度達(dá)90%以上。 (1)堅(jiān)持小苗的水分供需平衡。在移栽后5-7d內(nèi)，應(yīng)給予較高的空氣濕度條件，使葉面的水分蒸發(fā)減少，盡量接近培育瓶的條件，讓小苗一直堅(jiān)持挺拔的形狀

51、。堅(jiān)持小苗水分供需平衡首先營(yíng)養(yǎng)缽的培育基質(zhì)要澆透水，所放置的床面也要澆濕，然后搭設(shè)小拱棚，以減少水分的蒸發(fā)，并且初期要常噴霧處置，堅(jiān)持拱棚薄膜上有水珠出現(xiàn)。當(dāng)57d后，發(fā)現(xiàn)小苗有長(zhǎng)趨勢(shì)，可逐漸降低濕度，減少噴水次數(shù)，將拱棚兩端翻開通風(fēng)，使小苗順應(yīng)濕度較小的條件。約15d以后揭去拱棚的薄膜，并給予水分控制，逐漸減少澆水，促進(jìn)小苗長(zhǎng)得粗壯。(2)防止菌類繁殖。由于試管苗原來的環(huán)境是無菌的，移出來以后難以堅(jiān)持完全無菌，因此，應(yīng)盡量不使菌類大量繁殖，以利成活。所以應(yīng)對(duì)基質(zhì)進(jìn)展高壓滅菌或烘烤滅菌?？梢赃m當(dāng)運(yùn)用一定濃度的殺菌劑以便有效地維護(hù)幼苗，如多菌靈、托布津，濃度8001000倍，噴藥宜7l0d一次。

52、在移苗時(shí)盡量少傷苗，傷口過多，根損傷過多，都是呵斥死苗的緣由。噴水時(shí)可參與0.1%的尿素，或用12MS大量元素的水溶液作追肥，可加快苗的生長(zhǎng)與成活。 (3)一定的溫、光條件。試管苗移栽以后要堅(jiān)持一定的溫光條件，適宜的生根溫度是18200C，冬春季地溫較低時(shí)，可用電熱線來加溫。溫度過低會(huì)使幼苗生長(zhǎng)緩慢，或不易成活。溫度過高會(huì)使水分蒸發(fā)，從而使水分平衡遭到破壞，并會(huì)促使菌類繁殖。另外在光看管理的初期可用較弱的光照，如在小拱棚上加蓋遮陽網(wǎng)或報(bào)紙等，以防陽光灼傷小苗和添加水分的蒸發(fā)。當(dāng)小植株有了新的生長(zhǎng)時(shí)，逐漸加強(qiáng)光照，后期可直接利用自然光照。促進(jìn)光合產(chǎn)物的積累，加強(qiáng)抗性，促其成活。(4)堅(jiān)持基質(zhì)適當(dāng)

53、的通氣性。要選擇適當(dāng)?shù)念w粒狀基質(zhì)，保證良好的通氣作用。在管理過程中不要澆水過多，過多的水應(yīng)迅速瀝除，以利根系呼吸。綜上所述，試管苗在移栽的過程中，只需把水分平衡、適宜的介質(zhì)、控制雜菌和適宜的光、溫條件控制好，試管苗是很容易移栽的。 愈傷組織callus的構(gòu)成和形狀發(fā)生 植物的脫分化方式有兩種，器官發(fā)生型和胚胎發(fā)生型，在有些情況下，再分化可以直接發(fā)生于脫分化的細(xì)胞中，無須閱歷愈傷組織階段，但大多數(shù)情況下，再分化過程是在愈傷組織細(xì)胞中發(fā)生的。 一 愈傷組織構(gòu)成的條件雖然如全能性所言，發(fā)育和分化過程并不導(dǎo)致細(xì)胞全能性的喪失，但是，在一個(gè)完好的植物中，每個(gè)分化細(xì)胞都是某個(gè)器官和組織中的一個(gè)成員，它只能

54、在與其周圍成員相互協(xié)調(diào)和彼此制約當(dāng)中，恰如其分地發(fā)揚(yáng)整個(gè)植株所賦予它的一定的功能，而不具備發(fā)揚(yáng)其全能性的外部條件。然而，這些細(xì)胞假設(shè)是一旦脫離了母體植株，擺脫了原來所遭到的遺傳上的控制和生理上的制約，在不定期下的培育條件下，就會(huì)發(fā)生一種回復(fù)變化，從而失去分化形狀，變?yōu)榉稚?xì)胞，實(shí)現(xiàn)脫分化過程。然后，這些脫分化細(xì)胞經(jīng)過延續(xù)的有絲分裂，構(gòu)成愈傷組織離體隔離。大量研討闡明，幾乎一切高等植物的各種器官，如根、莖、葉和花等，以及各種組織，如皮層、莖髓和構(gòu)成層等，離體后在適當(dāng)條件下，都能產(chǎn)生愈傷組織。由此可見，愈傷組織誘導(dǎo)的成敗關(guān)鍵主要不是外植體的來源和種類，而是培育條件，其中激素的種類和濃度最為重要。當(dāng)

55、然，外植體的類型和外植物體原來在植株上所處的位置反映了內(nèi)源激素程度對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響也不能忽視。二愈傷組織構(gòu)成的過程外植體中已分化的活細(xì)胞，在外源激素的誘導(dǎo)下經(jīng)過脫分化后構(gòu)成愈傷組織，這一過程被大致劃分為三個(gè)時(shí)期誘導(dǎo)期、分裂期和構(gòu)成期。誘導(dǎo)期：細(xì)胞分裂的預(yù)備期誘導(dǎo)期是細(xì)胞預(yù)備進(jìn)展分裂的時(shí)期。接種的外植體資料的細(xì)胞通常都是成熟細(xì)胞，處于靜止形狀，細(xì)胞大小沒有多大變化，外觀無明顯特征，但細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)代謝旺盛，王凱基等1981在研討離體培育的油橄欖莖段時(shí)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)合成代謝活潑，RNA含量迅速添加，細(xì)胞核體積明顯增大。誘導(dǎo)期的長(zhǎng)短，因植物種類和外植體的生理情況和外部要素而異，如胡蘿卜的誘導(dǎo)期要好幾天

56、，新穎的菊芋塊莖那么只需22h，但菊芋塊莖經(jīng)過5個(gè)月的貯藏后，誘導(dǎo)期那么須延伸到40h以上。分裂期：細(xì)胞從開場(chǎng)分裂到繼續(xù)分裂的時(shí)期分裂期是指細(xì)胞經(jīng)過一分為二的分裂，不斷增生子細(xì)胞的過程。外植體的細(xì)胞一旦經(jīng)過誘導(dǎo)，其外層細(xì)胞開場(chǎng)迅速分裂，使細(xì)胞脫分化。分裂期主要表現(xiàn)如下：1.細(xì)胞的數(shù)目迅速添加。如胡蘿卜培育7天后，細(xì)胞數(shù)可添加10倍。2.每個(gè)細(xì)胞平均鮮重下降。這是由于細(xì)胞鮮重的添加不如細(xì)胞數(shù)目的添加快的緣故。3.細(xì)胞體積小，內(nèi)無液泡，好像根尖和莖尖的分生組織細(xì)胞特性。4細(xì)胞的核和核仁增大到最大。 5.細(xì)胞中RNA含量減少，而DNA含量堅(jiān)持不變。 6. 隨著細(xì)胞不斷分裂和組織生長(zhǎng)，細(xì)胞的總干重、蛋

57、白質(zhì)和 核酸含量大大添加，新細(xì)胞壁的合成極快?？傊?，分裂期的愈傷組織的共同特征是：細(xì)胞分裂快，構(gòu)造疏松，短少有組織的構(gòu)造，維持其不分化的形狀。構(gòu)成期：從愈傷組織到器官發(fā)生構(gòu)成期是指外植體經(jīng)過誘導(dǎo)期和分裂期后構(gòu)成了無序構(gòu)造的愈傷組織的時(shí)期。進(jìn)入構(gòu)成期后，細(xì)胞的平均大小相對(duì)穩(wěn)定，不再減少，細(xì)胞分裂由原來局限在組織外緣的平周分裂轉(zhuǎn)為組織內(nèi)部較深層部分細(xì)胞的分裂，結(jié)果構(gòu)成瘤狀或片狀的擬分生組織meristemoid，稱做分生組織結(jié)節(jié)。分生組織結(jié)節(jié)可以成為愈傷組織的生長(zhǎng)中心，或者進(jìn)一步分化為維管組織結(jié)節(jié)由分生組織結(jié)節(jié)外圍的細(xì)胞作平周分裂成為構(gòu)成層狀細(xì)胞，并構(gòu)成了部分維管組織如管胞、纖維細(xì)胞等，但不構(gòu)成維

58、管系統(tǒng)。由于此期細(xì)胞分裂已根本停頓，細(xì)胞內(nèi)發(fā)生生理代謝等的變化而開場(chǎng)構(gòu)成一些不同形狀和功能的細(xì)胞，因此有人又將此期稱為分化期。 愈傷組織的繼代培育脫分化細(xì)胞不斷進(jìn)展分裂，從而構(gòu)成了愈傷組織，愈傷組織在培育基上生長(zhǎng)一段時(shí)間以后，由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)枯竭，水分散失，以及代謝產(chǎn)物的積累，必需轉(zhuǎn)移到新穎培育基上培育。這個(gè)過程叫做繼代。經(jīng)過繼代培育，可使愈傷組織無限期地堅(jiān)持在不分的增殖形狀。然而，假設(shè)讓愈傷組織留在原培育基上繼續(xù)培育而不繼代，它們那么不可防止地發(fā)生分化，產(chǎn)生新的構(gòu)造。 三 愈傷組織的生長(zhǎng) 普通來說，愈傷組織的增殖生長(zhǎng)只發(fā)生在不與瓊脂接觸的外表，而與瓊脂接觸的一面極少細(xì)胞增殖，只是細(xì)胞分化構(gòu)成嚴(yán)密

59、的組織塊。它是愈傷組織外表或近外表瘤狀物生長(zhǎng)的結(jié)果。愈傷組織之間的質(zhì)地有顯著不同，有的很松脆，有的很堅(jiān)實(shí)，且這兩類愈傷組織可相互轉(zhuǎn)變。其方法是：參與高濃度的生長(zhǎng)物質(zhì)，可使堅(jiān)實(shí)的愈傷組織變?yōu)樗纱?。反之，減低或除去生長(zhǎng)物質(zhì)，那么松脆的愈傷組織可以轉(zhuǎn)變?yōu)閳?jiān)實(shí)。松脆愈傷組織都有大量的分生組織上中心，進(jìn)展活潑的細(xì)胞分裂，為大而未分化的細(xì)胞所分開；而不脆確實(shí)良愈傷組織很少分化，大都是高度液泡化的細(xì)胞。脆的愈傷組織是進(jìn)展懸浮培育最適宜的資料，稍經(jīng)機(jī)械振蕩，即可使組織分散成單細(xì)胞或少數(shù)幾個(gè)細(xì)胞組成的小細(xì)胞團(tuán)。在培育中細(xì)胞產(chǎn)生迅速增殖，而堅(jiān)實(shí)的愈傷組織中的細(xì)胞間被果膠質(zhì)緊緊地粘著，因此往往不能構(gòu)成良好的懸浮系統(tǒng)

60、。愈傷組織的質(zhì)地不同是由其內(nèi)部構(gòu)造上的差別所引起的。堅(jiān)實(shí)致密的愈傷組織內(nèi)無大的細(xì)胞間隙，而由管狀細(xì)胞組成維管組織；松脆愈傷組織內(nèi)有大量的細(xì)胞間隙，細(xì)胞陳列毫無次序。生長(zhǎng)旺盛的愈傷組織普通呈奶黃色或白色，有光澤，也有淡綠色或綠色的；老化的愈傷組織多轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色甚至褐色。 外植體的脫分化因植物種類和器官及其生理情況而有很大差別，如煙草、胡蘿卜等脫分化較易，而禾谷類的脫分化較難；花器脫分化較易，而莖葉較難；幼嫩組織脫分化較易，而成熟的老組織較難。一個(gè)多細(xì)胞外植體通常包含著各種不同類型的細(xì)胞，因此，由它所構(gòu)成的愈傷組織也是異質(zhì)性的，其中不同的組分細(xì)胞具有不同的構(gòu)成完好植株或器官的才干，即不同的再分化才干