大鼠神經(jīng)干細(xì)胞分離培養(yǎng)鑒定標(biāo)準(zhǔn)化protocol(共9頁(yè))

1、 大鼠神經(jīng)干細(xì)胞分離(fnl)培養(yǎng)鑒定標(biāo)準(zhǔn)化protocol一、大鼠神經(jīng)干細(xì)胞分離(fnl)和傳代步驟手術(shù)(shush)前準(zhǔn)備1. 水浴鍋溫度調(diào)至 37 C。 組織解離液置 95%O2 5%CO2 培養(yǎng)箱中 10min。3. 用 95%乙醇消毒解剖區(qū)。4. 用消毒溶液消毒解剖器械（戊二醛，后用無(wú)菌 dH2O 沖洗，浸泡在 95%乙醇中）。 在 3 個(gè) 60 15 mm 皿中各加 3ml 的組織解離液。 提示：除無(wú)菌顯微解剖器材外，還要三套消毒器械，分別用于剝離皮膚、顱骨和腦，減少用手污染的機(jī)會(huì)。消毒過的解剖器械可以浸泡在無(wú)菌組織剝離液中，以避免乙醇接觸組織。分離腦組織新生SD大鼠(出生48h內(nèi)

2、)直接斷頭。 剃去頭頂?shù)拿l(fā)。 用浸泡過聚維酮碘消毒的紗布擦洗頭部并且去除松散的毛發(fā)。 用泡過 95乙醇消毒紗布擦洗頭部。 用手術(shù)刀片延中線全長(zhǎng)切開頭皮。 掀開皮膚顯現(xiàn)出頭蓋骨。 從雙耳后切開頭皮暴露頭蓋骨側(cè)面。 用小剪刀在兩邊切開頭蓋骨（打開頭蓋骨上部，避免損傷腦組織）。 用鑷子掀開頭蓋骨。 注意：不能用表面有乙醇的解剖工具接觸腦組織。乙醇能使組織固定。 用彎鑷在腦底部滑動(dòng)以切斷連接腦底部的脊髓(j su)、血管和顱神經(jīng)。 提示：用彎鑷時(shí)輕微向下用力抵住腦下面的顱底。來回滑動(dòng)松動(dòng)腦組織。 取腦組織，D-Hanks液充分(chngfn)漂洗后.用同一個(gè)彎鑷將腦移到盛有解離(ji l)液的 60

3、mm 皿中。 剝離大腦表面的腦膜，沖洗干凈，把腦放入第二個(gè)盛有解離液的 60mm 皿中。 提示：在解剖顯微鏡下很容易剝離腦膜。 解剖鏡下，沿中線切開大腦，精細(xì)鑷分離海馬。 將分離組織放置于第三個(gè)盛有解離液的 60mm 皿中。 用 10 號(hào)彎頭手術(shù)刀將組織切成小塊（約 1 mm3） 分散腦組織將盛有小塊組織的培養(yǎng)皿移到超凈臺(tái)， 然后用移液管將組織塊移到 5ml 的圓底聚丙烯管中。250g 離心 1min。棄上清，加入酶混合液（1ml） 。將試管水浴至少 40min，每隔 20 分鐘用移液管適當(dāng)吹打。26. 250g 離心 5min，棄上清。 加入 4ml 蛋白酶抑制劑。用移液管吹打 10 次以分

4、散沉淀，注意盡量別產(chǎn)生氣泡。29. 水浴 10min。 30. 500g 離心 5min，棄上清。 用 0.5ml SFM 重懸細(xì)胞，充分吹打以產(chǎn)生單細(xì)胞懸液。 提示：建議用火焰鈍化的小搶頭制備單細(xì)胞懸液。接種(jizhng)細(xì)胞32. 用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)并調(diào)整活細(xì)胞濃度(nngd)。臺(tái)盼蘭染色排除死細(xì)胞。 提示：接種 10-15 cells/ul有利于建立單個(gè)神經(jīng)球的培養(yǎng)。如果不做克隆分析且想獲得更多神經(jīng)球，可提高接種(jizhng)密度（如 50-100 cells/ul）。高密度接種可加快神經(jīng)球的形成，并縮短首次傳代時(shí)間間隔。 用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器和臺(tái)盼蘭測(cè)定細(xì)胞活性在 24 孔板每孔中加入

5、0.5ml 含細(xì)胞 SFM。 在 24 孔板每孔中加入 0.5ml 含細(xì)胞 SFM。 37 95% air 5% CO2 培養(yǎng)。神經(jīng)球的傳代提示： 在合并培養(yǎng)物前應(yīng)檢查每個(gè)孔是否污染， 特別是在第一次傳代時(shí)。 嚴(yán)重污染使 PH 值降低， 培養(yǎng)液顏色明顯改變（變黃）。輕微污染也較常見，無(wú)法通過觀察培養(yǎng)液顏色判斷，需在相差顯微鏡下觀察。如果你忽略了一個(gè)污染孔，下一代的所有孔都會(huì)被污染！ 將所有神經(jīng)球和培養(yǎng)液移到 15ml 錐形管。 2. 200g 離心 5min。 棄上清，加入 2ml TrypLETM。 用移液管混合神經(jīng)球和 TrypLETM。 5. 37 水浴 20min。 6. 500g 離

6、心 5min。 棄上清，加 0.5ml SFM 重懸細(xì)胞。 用移液管吹打（6070 次） 提示：吹打過程中避免產(chǎn)生氣泡。過多氣泡會(huì)降低活細(xì)胞數(shù)并增加污染(wrn)機(jī)會(huì)。 9. 用臺(tái)盼蘭計(jì)數(shù)細(xì)胞密度， 排除(pich)死細(xì)胞， 按所需密度接種到新 24 孔板。 95% air 5% CO2 37 培養(yǎng)。 提示： 神經(jīng)球傳代的最佳時(shí)間常根據(jù)試驗(yàn)需要和時(shí)間安排確定。 如果(rgu)平均每孔至少 25 個(gè)神經(jīng)球， 那么可以傳 2 個(gè)板。如果有 50 個(gè)神經(jīng)球，那么很容易從原 24 孔板傳 3 個(gè)板。鏡臺(tái)測(cè)微尺可標(biāo)準(zhǔn)化相差顯微鏡的目鏡焦距。便于快速確定神經(jīng)球的大小。神經(jīng)球的凍存和復(fù)蘇1. 將含有神經(jīng)球的

7、培養(yǎng)液從 24 孔板移入 15ml 圓錐管。2. 200g 離心 5min。3. 棄上清，用 10ml 含 15DMSO 的 SFM（不含 EGF 和 FGF）重懸細(xì)胞。 用移液管輕輕混勻，分裝 1.5ml 每管（聚丙烯冷凍管）。5. 80 冰箱過夜。6. 次日晨轉(zhuǎn)移至液氮罐保存。 提示：如果不能使用液氮，神經(jīng)球可以在80 保存幾周。活神經(jīng)球數(shù)量會(huì)隨80 存放時(shí)間延長(zhǎng)而減少。 準(zhǔn)備復(fù)蘇神經(jīng)球，將冷凍管從液氮中取出，在超凈臺(tái)內(nèi)回復(fù)至室溫。 將冷凍管內(nèi)容物轉(zhuǎn)入含有 10ml SFM 的 15ml 圓錐管中。 9. 200g 離心 5min，棄上清。 用 4ml SFM 輕輕混勻。 11. 按每孔

8、0.5ml 種 8 個(gè)孔（24 孔板）， 37 95% air 5% CO2 條件下培養(yǎng)。 提示：小神經(jīng)球比大神經(jīng)球（直徑大于 100um）更易復(fù)蘇成活。在組織培養(yǎng)基中，神經(jīng)球復(fù)蘇成活率很低（小于 20）。建議每孔至少種 50100 個(gè)神經(jīng)球。通過提高冷凍神經(jīng)球密度或在冷凍液中加入 20胎牛血清可提高復(fù)蘇成活率。但要牢記胎牛血清可以誘導(dǎo)分化。二、大鼠神經(jīng)干細(xì)胞增殖能力(nngl)檢測(cè)將BrdU溶于SFM 培養(yǎng)基，過濾除菌后加入(jir)神經(jīng)球形成后分離克隆制作的單細(xì)胞懸液中(BrdU終濃度為5mol/L)，培養(yǎng)7d待新的神經(jīng)(shnjng)球形成后，將神經(jīng)球轉(zhuǎn)移到預(yù)先涂布有多聚賴氨酸的培養(yǎng)板中

9、，貼壁2h行BrdU免疫細(xì)胞化學(xué)染色。三、大鼠神經(jīng)干細(xì)胞分化能力檢測(cè)選取部分上述傳代后形成的次代神經(jīng)球種植于預(yù)先涂布有多聚賴氨酸的24孔培養(yǎng)板中，并加入有血清培養(yǎng)基(含10胎牛血清的SFM 培養(yǎng)基)，一部分神經(jīng)球于貼壁2h后行Nestin免疫細(xì)胞化學(xué)染色，另一部分神經(jīng)球繼續(xù)培養(yǎng)，觀察其生長(zhǎng)分化情況。另將一部分次代神經(jīng)球機(jī)械分離制成單細(xì)胞懸液后加入有血清培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)，7d后分別行Tuj1 、GFAP 、免疫細(xì)胞化學(xué)染色。注：1) TuJ1是一種被認(rèn)為參與神經(jīng)元細(xì)胞類型特異性分化的微管蛋白。 2) GFAP是神經(jīng)系統(tǒng)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的標(biāo)志物。Nestin是巢蛋白，是一種中間絲類型的蛋白，能夠特異

10、性的表達(dá)在神經(jīng)上皮干細(xì)胞上一種分子標(biāo)記物；可能對(duì)神經(jīng)元的分化有作用。Nestin僅在胚胎發(fā)育早期的神經(jīng)上皮表達(dá)，出生后表達(dá)就停止。為神經(jīng)干細(xì)胞的特征性標(biāo)志物。神經(jīng)球轉(zhuǎn)入含血清培養(yǎng)液的24孔板, 24 h 后大部分貼壁; 可見有單個(gè)細(xì)胞從神經(jīng)球內(nèi)游出,貼壁生長(zhǎng),分散存在,可向四周發(fā)出放射狀條索,與周圍細(xì)胞互相聯(lián)接。2 d后突起不斷增粗和伸長(zhǎng),形態(tài)不規(guī)則; 5 d左右克隆基本分化成形態(tài)不一, 分散成突起多少不等的三種類型細(xì)胞: 細(xì)胞體呈圓形或橢圓型、突起少但很長(zhǎng)、折光性強(qiáng)的神經(jīng)元樣細(xì)胞, TuJ1免疫染色呈陽(yáng)性反應(yīng),表明神經(jīng)干細(xì)胞已部分分化為神經(jīng)元; 胞體較大、突起較多較粗、細(xì)胞數(shù)量較多的星形膠質(zhì)

11、樣細(xì)胞,其折光性弱, GFAP免疫染色呈陽(yáng)性反應(yīng);細(xì)胞胞體最小,數(shù)量也最少,具有多個(gè)細(xì)胞突起,突起較短、較細(xì)、且不斷分枝,考慮為少突膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞。NSCs由BrdU摻入后,分化培養(yǎng)的細(xì)胞中大多數(shù)顯微鏡下可見BrdU免疫染色陽(yáng)性。表一、所需儀器(yq)列表儀器名稱數(shù)量CO21解剖顯微鏡1水浴鍋1顯微分離器材4套手術(shù)刀片1套生物安全柜1臺(tái)式離心機(jī)1相差顯微鏡1表二、所需耗材列表(li bio)耗材名稱數(shù)量公司貨號(hào)報(bào)價(jià)（元）6015 mm 組織培養(yǎng)皿40個(gè)Falcon cat. no. 353002122.824孔細(xì)胞培養(yǎng)板10個(gè)Falcon cat. no. 3530471625 ml 聚丙烯圓

12、底管20個(gè)Falcon cat. no. 352063137.415 ml 聚丙烯圓椎管20個(gè)Falcon cat. no. 352095174.650 ml 聚丙烯圓椎管10個(gè)Falcon cat. no. 352070114.8表三、組織解離(ji l)液配方組織解離液2.0M NaCl 15.5ml1.0M KCl1.25ml1.0M MgCl20.8ml155mM NaHCO341.9ml1.0M Glucose2.5ml108mM CaCl20.23ml蒸餾水188.0ml此分離液在4度過濾和儲(chǔ)存在使用之前在95% O2和5% co2中充氣10分鐘。表四、消化酶混合液配方(pi fn

13、g)消化酶混合液報(bào)價(jià)（元）Trypsin(sigma. cat.no.T5266)0.04g534.69Type-1-S Hyaluronidase(sigma. cat.no.H3506)0.02g1,075.23Kynurenic acid(sigma. cat.no.K3375)0.004g1,387.62此消化酶溶液溶解于30ML組織分離液中，并用0.22um的膜過濾，分裝成1ML，儲(chǔ)存于-20度冰箱。表五、無(wú)血清(xuqng)培養(yǎng)液配方無(wú)血清培養(yǎng)液（SFM 100ml）報(bào)價(jià)（元）DMEM/F12(Invitrogen cat. no. 11330-032)94.3ml40430% G

14、lucose2.0 ml1.0M Hepes Buffer0.5ml孕酮（1000X）(Sigma cat. no. P-8783)0.1mlPutrescine（100X）(Sigma cat. no.P5780)1.0ml286.65B27 Growth supplement (Invitrogen cat. no. 17504-044)2.0 ml1190EGF(Sigma cat. no.E4127)20ul1728.09FGF(Sigma cat. no.F0291)20ul1,291.68ITSITSS(Cyagen cat. no. ITSS-10201-10)100ul490肝

15、素(Sigma cat. no.H3149)7.32ul4,829.76新開封的DMEM/F12（500ml）培養(yǎng)基中需要增加8ML 15%的NaHCO3溶液并儲(chǔ)存于4度表六、抗體和試劑列表抗體名稱數(shù)量公司貨號(hào)報(bào)價(jià)（元）Nestin1Abcam-ab931574,189 TuJ11Abcam-ab145454,595GFAP1Abcam-ab72604,443Brdu1Abcam-ab63264,443TrypLETM express1Invitrogen-12604-021605 BrdU Labeling Reagent1Invitrogen-00-0103713實(shí)驗(yàn)(shyn)風(fēng)險(xiǎn)：1.

16、神經(jīng)球的形成：此實(shí)驗(yàn)(shyn)即使嚴(yán)格按照protocol來操作，也會(huì)伴隨著很多不確定的風(fēng)險(xiǎn)。如，在組織分離過程中污染問題或是配置分離培養(yǎng)基時(shí)產(chǎn)生的污染。在神經(jīng)球培養(yǎng)的過程中，如果起始細(xì)胞密度過于高，那么死細(xì)胞或是即將死的細(xì)胞就會(huì)降低培養(yǎng)基的PH值， PH值降低將會(huì)阻止神經(jīng)球的形成和發(fā)育。2.雖然所有腦區(qū)都能產(chǎn)生神經(jīng)球，但特殊(tsh)的區(qū)域會(huì)產(chǎn)生更多神經(jīng)球，集中分離形成腦室的細(xì) 胞層（主要是 SVZ、海馬、從室下區(qū)到嗅球的吻側(cè)遷移流），這些區(qū)域?qū)a(chǎn)生更多神經(jīng)球。本實(shí)驗(yàn)是分離海馬區(qū)域的神經(jīng)球，所以精確定位分離到目標(biāo)區(qū)域很重要。3.操作經(jīng)驗(yàn)和解剖顯微鏡對(duì)組織塊切割很有幫助。小組織塊更容易分散并產(chǎn)生更多神經(jīng)球。如果組織塊不夠小和不夠均勻，將不易形成更多的神經(jīng)球。4. 切碎的小組織(zzh)塊，加入酶混合液后，要在顯微鏡下密切關(guān)注(gu