肺癌突變檢測(cè)進(jìn)展課件

1、肺癌基因檢測(cè)進(jìn)展“Personalized medicine is the tailoring of medical treatment to the individual characteristics of each patient.”As defined by the Presidents Council of Advisors on Science and Technology (PCAST)個(gè)體化醫(yī)學(xué)/治療肺癌檢測(cè)的進(jìn)步Li T, et al. J Clin Oncol,2013 Mar 10;31(8);1039-49病理基因診斷是基礎(chǔ) 組織活檢 vs 液體活檢標(biāo)本來(lái)源組織活檢液體

2、活檢（CfDNA/CTC)DNA含量充足少量獲取難易度難易身體創(chuàng)傷大小異質(zhì)性存在存在基因檢測(cè)靈敏度高差對(duì)于檢測(cè)設(shè)備要求低？高？動(dòng)態(tài)檢測(cè)難度大可行費(fèi)用較多？少？Crowley, E. et al. Nat. Rev. Clin. Oncol. 2013, 10: 472484Low concentration: average 17 ng/ml plasma in advanced-stage cancersLow proportion: tumor DNA can range between 0.01% and 93%手工染色效果巴氏染色HE染色瑞氏-姬姆薩染色Diff染色總覽腫瘤細(xì)胞粒細(xì)胞傳

3、統(tǒng)染色方法進(jìn)行CTCs形態(tài)學(xué)觀察有關(guān)圖片及標(biāo)準(zhǔn)由細(xì)胞學(xué)王征教授提供條件1：細(xì)胞核異型性，閱片中可對(duì)比圍周其他白細(xì)胞作為一個(gè)重要方法，判斷其是否異型。條件2：核質(zhì)比大于0.8條件3：細(xì)胞直徑（長(zhǎng)端）大于15um 條件4：核深染且著色不均勻（由于癌細(xì)胞染色質(zhì)增多，顆粒變粗，核深染） 條件5：核膜增厚，出現(xiàn)凹陷或皺褶，使核膜呈鋸齒狀條件6：細(xì)胞核染色質(zhì)邊移（核偏位），或巨大核仁，或異常核分裂。 CTC判讀標(biāo)準(zhǔn) CTC：符合4個(gè)或4個(gè)以上，判讀為CTC，如滿足條件6，外加符合其它兩個(gè)條件也可判讀為CTC；疑似CTC：滿足條件6之外的任意3個(gè)條件；或單獨(dú)滿足條件6，判讀為疑似CTC；CTC cluste

4、rs:3個(gè)及3個(gè)以上的細(xì)胞成團(tuán)，且能鑒定為CTC；或因相互連接重疊無(wú)法準(zhǔn)確判讀為CTC的細(xì)胞團(tuán)，但能判斷為非血液來(lái)源的具有核異形特征，且不是圍繞濾膜孔呈花瓣?duì)罘植嫉募?xì)胞團(tuán)，判讀為CTC clusters；疑似CTC clusters： 3個(gè)及3個(gè)以上的細(xì)胞成團(tuán)，但不足以判定為CTC的細(xì)胞團(tuán)，且核異形不明顯，判讀為疑似CTC clusters。 評(píng) 判 標(biāo) 準(zhǔn)首先具有惡性特征的細(xì)胞團(tuán)；CTC clusters成團(tuán)；CTC clusters有胞漿；CTC clusters可能存在排列；CTC clusters可能出現(xiàn)立體結(jié)構(gòu)，核擁擠。CTCCTC clustersCK8/18/19CD45Vime

5、ntinHoechstMergedCK8/18/19CD45VimentinHoechstMergedCK8/18/19CD45VimentinHoechstMerged IF檢測(cè)：臨床樣本中CTC的異質(zhì)性CTC的檢測(cè)的應(yīng)用前景體外早期診斷指導(dǎo)個(gè)體化治療包括臨床藥物篩選耐藥性的檢測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)的監(jiān)測(cè)腫瘤新藥物的開(kāi)發(fā)相對(duì)全面的分子分型和靶向治療策略腺癌趨向更加精細(xì)鱗癌獲得更多分型小細(xì)胞肺癌的分型分型由單個(gè)biomarker向pathway發(fā)展多分子多平臺(tái)分型技術(shù)的挑戰(zhàn)TCGA項(xiàng)目為代表二代測(cè)序等通量技術(shù)的應(yīng)用多個(gè)信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子變異頻率肺鱗癌 64%肺腺癌（62% to 78%)首創(chuàng)深度測(cè)序腫瘤

6、個(gè)體化建檔法更加經(jīng)濟(jì)、高敏感性的檢測(cè)ctDNA方法selector能識(shí)別139個(gè)頻發(fā)突變基因中的521個(gè)外顯子和12個(gè)內(nèi)含子II-IV期的NSCLC中檢測(cè)敏感性100%，I期的NSCLC中敏感性為50%，而且在各期的肺癌中的特異性均在96% published online 6 April 2014診斷技術(shù)的進(jìn)步對(duì)臨床有何指導(dǎo)意義使用新一代測(cè)序(NGS)對(duì)小細(xì)胞肺癌(SCLC)進(jìn)行前瞻性分子分析病理診斷SCLC病理醫(yī)生在MSK中心對(duì)福爾馬林固定石蠟包埋標(biāo)本進(jìn)行評(píng)估NGSFISH:FGFR1及MET擴(kuò)增IHCMGMT,PTENMSK-IMPACT：靶向NGS，能分辨常規(guī)一套222種腫瘤相關(guān)基因的

7、單核苷酸變異、插入和缺失以及拷貝數(shù)變化FGFR1：使用Zytolight SPEC FGFR1/CEN8雙色探針MET：使用Cytocell探針基于預(yù)先制定的定義來(lái)判斷擴(kuò)增每種需要2份未著色切片MGMT：英杰公司MGMT鼠單克隆抗體陰性=無(wú)表達(dá)陽(yáng)性=任何表達(dá)PTEN：Dako PTEN鼠單克隆抗體H評(píng)分=細(xì)胞%強(qiáng)度(2份未著色切片)，評(píng)分范圍0-300研究檢測(cè)收集人口統(tǒng)計(jì)學(xué)及臨床數(shù)據(jù)；根據(jù)吸煙狀態(tài)、分期及對(duì)治療緩解情況對(duì)基因型分析數(shù)據(jù)進(jìn)行分層；臨床研究選擇Pietanza MC, et al. 2015 ASCO Abstract 7518. MSK-IMPACT結(jié)果Pietanza MC,

8、et al. 2015 ASCO Abstract 7518. 平均覆蓋深度420X中位突變數(shù)量(每腫瘤) 配對(duì)(N=35)/未配對(duì)(N=15)7/16 局限性疾病(N=21)9 廣泛性疾病(N=29)5 難治(N=15)4 敏感(N=31)7觀察了222個(gè)癌癥相關(guān)基因，發(fā)現(xiàn)202個(gè)基因突變發(fā)現(xiàn)526個(gè)非同義突變，其中25%為功能缺失突變主要突變?yōu)镚T顛換(46.8%)，反映了煙草煙霧致癌物質(zhì)對(duì)DNA的影響最常見(jiàn)突變基因Pietanza MC, et al. 2015 ASCO Abstract 7518. 90%90%40%36%30%32%32%26%26%12%10%RB1TP53SOX

9、2CDKN2CEPHA5KMT2CNKX2-1PIK3CAMYCLFGFR1PTEN擴(kuò)增純合子缺失錯(cuò)義突變截?cái)嗤蛔兎且拼a突變吸煙與突變：吸煙對(duì)DNA的影響Pietanza MC, et al. 2015 ASCO Abstract 7518. 突變率(根據(jù)年吸煙包數(shù))GT顛換率(根據(jù)年吸煙包數(shù))年吸煙包數(shù)平均非同義突變數(shù)年吸煙包數(shù)GT顛換率吸煙與突變：從未吸煙患者突變情況Pietanza MC, et al. 2015 ASCO Abstract 7518. 樣本突變基因突變表現(xiàn)突變蛋白質(zhì)突變堿基對(duì)患者1 PHOX2BNOTCH1RB1TP53TP53TET6錯(cuò)義突變移碼插入剪接位點(diǎn)移碼缺失移

10、碼缺失擴(kuò)增P82LP2485fsR500_剪接V218fsV73fsGAGA患者2CBLGNASMYCL錯(cuò)義突變錯(cuò)義突變擴(kuò)增C401SM102VGCAG患者3TP53RB1CDKN2CMYCL無(wú)義突變移碼插入擴(kuò)增擴(kuò)增R342T197fsGA患者4(難治性疾病)RB1ETV1無(wú)義突變擴(kuò)增C666顯著突變基因 (根據(jù)對(duì)一線治療療效)Pietanza MC, et al. 2015 ASCO Abstract 7518. 基因敏感(N=31)難治(N=15)P值MITFMLH1SHQ1PBRM1SETD2RAF1 VHLCDH1CDK8IDH2TET1FGFR34432211000007665553

11、222220.0120.0370.0150.0170.0170.0040.0070.0380.0380.0380.0380.038ASXL1MCL1MYCCSF1RFGFR4DDDRPIK3R11087777700000000.0130.0300.0460.0460.0460.0460.046難治敏感富集于難治性疾病患者的突變傾向于缺失(chr 3p)富集于敏感性疾病的突變包括擴(kuò)增、缺失及突變顯著突變基因 (根據(jù)對(duì)一線治療療效)121064082敏感DualGainLOFLOSSMISS/IFASXL1MCL1DDR2PIK3R1MYCCSF1RFGFR4MLH1MITFSHQ1SETD2PB

12、RM1RAF1VHL敏感腫瘤數(shù)86420難治DualGainLOFLOSSMISS/IFMITFMLH1SHQ1SETD2RAF1PBRM1VHLCDH1CDK8IDH2TET1FGFR3難治腫瘤數(shù)常見(jiàn)突變常見(jiàn)突變Pietanza MC, et al. 2015 ASCO Abstract 7518. 顯著突變基因(根據(jù)疾病分期)與廣泛性疾病相比，局限性疾病在更多數(shù)量的基因上存在更多突變Pietanza MC, et al. 2015 ASCO Abstract 7518. 1009080706050403020100突變患者%VHLASXL1EPHB1NOTCH1PIK3R1FLT4CDKN

13、2BAURKAPDGFRAFGFR4TMPRSS2ESR1KDRFAM123BNOTCH4FAM46CHRASKEAP1局限性疾病(n=21)廣泛性疾病(n=29)新一代測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證Pietanza MC, et al. 2015 ASCO Abstract 7518. 1234567891011121314151617181920212201234012345腫瘤/正常比例腫瘤/正常比例FGFR1擴(kuò)增PTEN丟失12345678910111213141516171819202122基因位置基因位置SCLC突變能否成為治療靶點(diǎn)？Pietanza MC, et al. 2015 ASCO Abs

14、tract 7518. 1009080706050403020100TP53RB1SOX2CDKN2CMLL3EPHASNKX2-1PIK3CATGFBR2BC16EPHA3MITFFAT1MYCL1TOP1BRCA2MLH1APCASXL1EPHB1FLT3IL7RJUNPTPRTRICTORSHQ1TERTTP63PTEN突變患者(%)最常見(jiàn)突變基因%配對(duì)(N=35)%未配對(duì)(N=15)GFGR1MYCL1擴(kuò)增alisertib+紫杉醇NCT02038647FGFR1擴(kuò)增BYL719+BGJ398NCT01928459Debio1347NCT01948297PTEN丟失BYL719+依維莫

15、斯NCT02077933PIK3CA突變BYL719+BGJ398NCT01928459BYL719+依維莫斯NCT02077933VS-5584NCT01991938研究結(jié)論在可獲得的腫瘤樣本對(duì)SCLC進(jìn)行全面分子分析是可行的此研究發(fā)現(xiàn)驗(yàn)證了既往的回顧性研究的結(jié)果TP53及RB1失活常見(jiàn)SOX2擴(kuò)增、FGFR1擴(kuò)增及PTEN丟失突變發(fā)生率相當(dāng)4例不吸煙者被納入本研究隊(duì)列他們的腫瘤突變更少，且無(wú)一存在GT顛換純合子缺失在難治性疾病中更常見(jiàn)相較局限期疾病，廣泛期疾病與突變數(shù)量增加不相關(guān)對(duì)于SCLC基因突變與臨床結(jié)局相關(guān)性，以及將這些患者與合適的靶向治療聯(lián)系起來(lái)的分析正在進(jìn)行中Pietanza M

16、C, et al. 2015 ASCO Abstract 7518. 前瞻性評(píng)價(jià)接受厄洛替尼治療的EGFR突變NSCLC患者的游離循環(huán)DNA(cfDNA)基因型分析及循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)目的：量化CTC及cfDNA分析對(duì)EGFR突變的NSCLC接受一線厄洛替尼治療的預(yù)測(cè)價(jià)值Yanagita M, et al. 2015 ASCO Abstract 11068.II期厄洛替尼研究進(jìn)展時(shí)，如可行則重復(fù)活檢未接受過(guò)TKI治療的EGFR突變NSCLC在基線(治療前)及隨訪期間每2月：收集cfDNA及CTC分析配對(duì)血樣本應(yīng)用ddPCR進(jìn)行血漿基因型分析：EGFR19缺失、L858R,T790M通過(guò)Ce

17、llSearch分離CTC運(yùn)用IF和MET-FISH對(duì)其進(jìn)行分析研究結(jié)果：患者情況Yanagita M, et al. 2015 ASCO Abstract 11068.患者情況例數(shù)N(%)EGFR突變60(100)L858R17(28.3)19缺失38(63.4)其他5(8.3)終止厄洛替尼治療44(73.3)因進(jìn)展39(65)因不良事件5(8.3)研究結(jié)果：cfDNA分析Yanagita M, et al. 2015 ASCO Abstract 11068.基線分析：共53例 EGFR突變47.1%(n=25) 每mL血漿拷貝數(shù)：中位：57, 范圍: 2-1649進(jìn)展時(shí)分析：共33例 EG

18、FR突變30.3%(n=10) 每mL血漿拷貝數(shù)：中位：71, 范圍: 5-2530研究結(jié)果：CTC分析Yanagita M, et al. 2015 ASCO Abstract 11068.2例患者CTCs中檢測(cè)出MET擴(kuò)增基線分析：共47例進(jìn)展時(shí)分析：共33例CTCs36.9%(n=17) CTCs45.4%(n=15) 每7.5mL血CTCs：中位：3, 范圍: 1-1145每7.5mL血CTCs：中位：6, 范圍: 1-328療效預(yù)測(cè)：cfDNA對(duì)比CTCs基線及隨訪3個(gè)月以上可檢測(cè)cfDNA的患者(n=18)至未能檢測(cè)出cfDNA(治療降低cfDNA,4個(gè)月)83.8%(n=15)Y

19、anagita M, et al. 2015 ASCO Abstract 11068.基線可檢測(cè)到CTCs的患者(n=17)始終未檢測(cè)到CTCs的患者*41.1%(n=7)始終不間斷檢測(cè)到CTCs的患者為58.9%(n=10)研究結(jié)論游離循環(huán)DNA(cfDNA)基因型分析及循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)均為非侵入性的NSCLC患者EGFR突變檢測(cè)方法相較CTCs，連續(xù)的cfDNA監(jiān)控可能是更好的療效預(yù)測(cè)方法Yanagita M, et al. 2015 ASCO Abstract 11068.IMPRESS研究中ctDNA EGFR突變的回顧性分析主要終點(diǎn)：PFS次要終點(diǎn)：OS， ORR， DCR，

20、安全性及耐受性， 健康相關(guān)的生活質(zhì)量探索性終點(diǎn)：生物標(biāo)記物年齡18歲PS 0-1組織學(xué)證實(shí)IIIB/IV期EGFR突變陽(yáng)性晚期NSCLC未接受化療治療達(dá)到CR/PR4月或者SD6月一線使用吉非替尼入組疾病進(jìn)展(RECIST)4周順鉑 75mg/m2培美曲塞 500mg/m2( 6周)+吉非替尼 250mg順鉑 75mg/m2培美曲塞 500mg/m2( 6周)+安慰劑250mgRKim SW, et al. 2015 WCLC Abstract ORAL16.05.BEAMing方法檢測(cè) EGFR突變ctDNA(腫瘤標(biāo)本與基線血漿水平對(duì)比)相對(duì)于腫瘤組織，BEAMing dPCR血漿檢測(cè)的良好

21、性能有利于EGFR敏感突變檢測(cè)Kim SW, et al. 2015 WCLC Abstract ORAL16.05.血漿 dPCR 測(cè)定外顯子19缺失，%(n/N)L858R突變，%(n/N)敏感性73.8(124/168)81.6(62/76)特異性96.7(89/92)95.3(161/169)一致性81.9(213/260)91.0(223/245)BEAMing方法檢測(cè) EGFR突變亞組ctDNA(261例腫瘤標(biāo)本與基線血漿水平對(duì)比)IMPRESS患者人群總體T790M檢測(cè)率：54.4%(142/261)與其他關(guān)于EGFR TKI難治人群報(bào)告結(jié)果一致T790M+患者中，吉非替尼組與安

22、慰劑組有輕微不平衡Kim SW, et al. 2015 WCLC Abstract ORAL16.05.吉非替尼，%(n/N)安慰劑，%(n/N)總體，%(n/N)T790M(+)61.8(81/131)46.9(61/130)54.4(142/261)T790M(-)35.1(46/131)45.4(59/130)40.2(105/261)外顯子19缺失(+)47.3(62/131)50.0(65/130)48.7(127/261)L858R(+)28.2(37/131)25.4(33/130)26.8(70/261)ctDNA分析：BEAMing 對(duì)比 QIAGEN therascreen EGFR RGQ PCR Kit檢測(cè)方法BEAMing:T790M檢測(cè)率較QIAGEN therascreen高QIAGEN therascreen檢測(cè)能力與所取血漿中ctDNA量相關(guān) (與BEAMing類(lèi)似，但數(shù)據(jù)未顯示)Kim SW, et al. 2015 WCLC Abstract ORAL16.05.突變外顯子19缺失(n=260)L858R(n=253)T790M(n=246)血漿+檢測(cè)率BEAMing48%28%57%QIAGEN therascreen37%20%15%P值0.00010.000199.9999%研究結(jié)果：EGFR突變EGF