高效液相色譜法原理及其應(yīng)用課件

1、高效液相色譜法（HPLC）第一節(jié) 高效液相色譜法基本原理色譜分析法是分析化學(xué)中獲得廣泛應(yīng)用的一個重要分支，是一個具有強大生命力的分離分析技術(shù)。采用高壓輸液泵將規(guī)定的流動相泵入裝有填充劑的色譜柱，對供試品進行分離測定的色譜方法。注入的供試品由流動相帶入色譜柱內(nèi)，各組分在柱內(nèi)被分離，并依次進入檢測器，由積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄和處理色譜信號，最終得到各組分的色譜峰。（一）高效液相色譜法的特點一、與經(jīng)典液相色譜法比較 現(xiàn)代液相色譜法是在經(jīng)典色譜理論的基礎(chǔ)上，采用了高壓泵、化學(xué)鍵合固定相高效分離柱、高靈敏專用檢測器等新實驗技術(shù)建立的一種液相色譜分析法。二、與氣相色譜法比較1分析對象的區(qū)別 GC：適于能

2、氣化、熱穩(wěn)定性好、且沸點較 低的樣品；但對高沸點、揮發(fā)性差、 熱穩(wěn)定性差、離子型及高聚物的樣 品，尤其對大多數(shù)生化樣品不可檢測 占有機物的20% HPLC：適于溶解后能制成溶液的樣品（包 括有機介質(zhì)溶液），不受樣品揮發(fā)性 和熱穩(wěn)定性的限制，對分子量大、難 氣化、熱穩(wěn)定性差的生化樣品及高分 子和離子型樣品均可檢測 用途廣泛，占有機物的80%2流動相的區(qū)別GC：流動相為惰性氣體，組分與流動相無親合作 用力，只與固定相有相互作用。 HPLC：流動相為液體，流動相與組分間有親合作 用力，能提高柱的選擇性、改善分離度，對 分離起正向作用。且流動相種類較多，選擇余 地廣，改變流動相極性和pH值也對分離起到

3、 調(diào)控作用，當(dāng)選用不同比例的兩種或兩種以 上液體作為流動相也可以增大分離選擇性。3操作條件區(qū)別GC：加溫操作（對氣相色譜分離效率最有影響的因素）HPLC：室溫；高壓三、高效液相色譜法的特點1 分離效能高2 選擇性高3 檢測靈敏度高4 分析速度快（二）高效液相色譜法的分類及分離機制 按固定相的聚集狀態(tài)分類： 液液色譜法、液固色譜法 按分離機制分類： 分配色譜法、吸附色譜法、離子交換色譜法、空間排阻色譜法及親合色譜法 按流動相與固定相極性的相對強弱分類： 正相色譜法、反相色譜法一、液固吸附色譜法（LSC）流動相為液體，固定相為固體吸附劑分離機制：利用溶質(zhì)分子占據(jù)固定相表面吸附活性中心能力的差異 調(diào)

4、節(jié)溶劑極性，可以控制組分的保留時間出柱順序：強極性組分后出柱，弱極性組分先出柱二、液液分配色譜法（LLC）分離機制：利用組分在兩相中溶解度的差異正相色譜固定相極性 流動相極性極性小的組分先出柱，極性大的組分后柱，適用于分離溶于有機溶劑的極性及中等極性的分子型物質(zhì)，用于含有不同官能團物質(zhì)的分離。反相色譜固定相極性 固定相極性按分離過程物理化學(xué)原理分類的各種液相色譜法的比較吸附色譜分配色譜離子色譜空間排阻色譜親和色譜固定相 全多孔固體吸附劑 固定液載帶在固相基體上 高效微粒離子交換劑 具有不同孔徑的多孔性凝膠 多種不同性能的配位體鍵聯(lián)在固相基體上 流動相 不同極性有機溶劑 不同極性有機溶劑和水 不

5、同pH值的緩沖溶液 有機溶劑或一定pH值的緩沖溶液 不同pH值的緩沖溶液，可加入改性劑 分離原理 吸附與解吸 溶解與揮發(fā) 可逆性的離子交換 多孔凝膠的滲透或過濾 具有鎖匙結(jié)構(gòu)絡(luò)合物的可逆性離解 （四）高效液相色譜法的定性定量分析方法與氣相色譜法的分析方法基本相同定性分析方法： 色譜鑒定法 化學(xué)鑒定法 兩譜聯(lián)用鑒定法定量分析方法： 外標(biāo)法 內(nèi)標(biāo)法 面積歸一化法（要求每一個組分都出峰）第二節(jié) 高效液相色譜儀 1貯液瓶（濾芯，可濾 去顆粒狀物質(zhì)）2高壓泵（輸液泵、梯 洗脫度）3進樣裝置4色譜柱分離5檢測器分析6廢液出口或組分收集器 7記錄裝置（一）輸液系統(tǒng) 一、儲液裝置：過濾器二、脫氣裝置：脫氣機流

6、動相脫氣：（1）吹氦脫氣法 （2）加熱回流法 （3）抽真空脫氣法 （4）超聲波脫氣法 （5）在線真空脫氣法流動相（淋洗劑、洗脫劑）是影響液相色譜分離的一個非常重要的實驗因素。改變流動相的性質(zhì)和組成將改變?nèi)苜|(zhì)組分的保留值、分離選擇性和柱效。在實際工作中，流動相的可選擇范圍較大是液相色譜的一個顯著特點。液相色譜中,組分的保留值大小決定于組分與流動相和固定相分子間作用力：比如吸附、分配、離子交換、親和力等。（二）高壓輸液泵及梯度洗脫裝置一、高壓輸液泵的種類 高壓輸液泵可以分為以下兩類：1恒流泵：可輸出恒定體積流量的流動相。（1）注射式泵（又稱螺桿注射泵） （2）往復(fù)型泵 （又稱往復(fù)柱塞泵）往復(fù)柱塞泵

7、，柱塞向前運動，液體輸出，流向色譜柱；向后運動，將貯液瓶中液體吸入缸體。如此往復(fù)運動，保證將流動相以穩(wěn)定的速度流過色譜柱的部件。二、高壓輸液泵的原理2恒壓泵：恒壓泵又稱氣動放大泵，是輸出恒定壓力的泵。避免使用對不銹鋼有腐蝕性的溶劑。例：硝酸、硫酸、鹽酸、鹵化物，四氯化碳與異丙醇或四氫呋喃的混合物等。過濾用濾膜過濾或垂熔漏斗過濾脫氣采用超聲或過濾的方法注意流動相使用前沖洗使用含酸、堿、緩沖液的流動相后，必須用不含鹽的有機溶劑-水沖洗！二、高壓輸液泵的基本要求：1. 流量范圍寬2. 重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度好3. 輸出的流動相無脈沖影響4. 輸出壓力高且耐壓5. 密封性能好6. 具備壓力檢測和保護功能三、高

8、壓輸液泵的性能參數(shù)用于分析型輸液泵的流量相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.075%0.3%流量范圍是0.01010ml/min流動相流速是13ml/min最高工作壓力可達34.4741.36MPa(300500bar,50006000psi)四、梯度洗脫裝置梯度洗脫：又稱為梯度淋洗或程序洗脫。在同一個分析周期中，按一定程度不斷改變流動相的濃度配比，梯度性地改變洗脫液的組成。從而可以使一個復(fù)雜樣品中的性質(zhì)差異較大的組分能按各自適宜的容量因子k達到良好的分離目的。梯度洗脫的原理：流動相由幾種不同極性的溶劑組成，通過改變流動相中各溶劑組成的比例改變流動相的極性，使每個流出的組分都有合適的容量因子k，并使樣品中的所有

9、組分可在最短時間內(nèi)實現(xiàn)最佳分離。梯度洗脫的優(yōu)點：1.縮短分析周期；2.提高分離能力；3.峰型得到改善，減少拖尾；4.增加靈敏度。但有時引起基線漂移。（三）進樣裝置 一、手動注射進樣器二、六通閥進樣裝置 三、自動進樣器 進樣閥的基本要求：1. 耐高壓2. 進樣量準(zhǔn)確3. 進樣重復(fù)性好4. 無流量和壓力波動影響進樣閥的保護措施：1. 在泵和進樣閥之間安裝在線過濾器，防止機械雜質(zhì)進入進樣閥。2. 以緩沖液作流動相時，定期用水清洗進樣閥，尤其是在色譜儀關(guān)機前。自動進樣器的組成部分：1. 進樣閥2. 樣品環(huán)管3. 進樣針頭4. 樣品瓶5. 支架（四） 色譜柱 色譜柱是液相色譜系統(tǒng)進行分離的核心部分，試樣

10、中各組分在色譜柱中被分離。色譜柱的要求：柱效高：通過減小填料粒度來提高柱效選擇性好：可通過改變固定相的種類和流動相的種類來改變色譜柱的選擇性。分析速度快一、柱材料及規(guī)格 1柱材料：色譜柱由柱管和固定相組成，柱管用不銹鋼制成。HPLC柱的填料材料有硅膠、以硅膠為基質(zhì)的鍵合相、氧化鋁和有機聚合物微球等。2柱規(guī)格：粒度通常為3m、5m、7m、10m，柱長1030cm，內(nèi)徑26mm，以4.6mm的內(nèi)徑最常用。 目前以反相鍵合相色譜柱應(yīng)用最多，尤其是C18、C8柱二、色譜柱的性能評價1. 理論塔板數(shù)2. 不對稱因子3. 保留值的重現(xiàn)性三、色譜柱的維護與保養(yǎng)1. 加流路過濾器和保護預(yù)柱2. 避免高壓沖擊3

11、. 采用適合柱的分離條件：PH、柱溫和流動相4. 過濾流動相和樣品5. 用強溶劑定期沖洗柱1.色譜柱的保養(yǎng)色譜柱使用與保存：所有色譜柱使用緩沖液后必須用柱體積20-30倍的水沖洗色譜柱色譜柱 柱體積 沖洗體積150 4.6mm 2.5ml 50ml200 4.6mm 3.3ml 65ml250 4.6mm 4.2ml 80ml（1）反相譜柱用后的保存：使用緩沖液或含鹽溶液作為流動相，每天實驗結(jié)束后，應(yīng)用20倍柱體積的甲醇/乙腈水溶液（5%）沖洗，使色譜柱內(nèi)的鹽完全溶解洗脫出，再用高濃度的甲醇/乙腈水溶液（80%100 % ）沖洗，使色譜柱中的強吸附物質(zhì)沖洗出來。（2）反相色譜柱長期保存：反相柱

12、可以儲存于甲醇或乙腈中，正相柱可以儲存于經(jīng)脫水處理的正己烷中，離子交換柱可以貯存于5%甲醇水的溶液中，并將色譜柱兩端的堵頭擰緊，以免干枯，室溫保存。3.色譜柱的維修（1）如果柱壓實然增大，可將色譜柱出、入口端顛倒過來，用1020倍柱體積的流動相沖洗。（2）如果峰形變壞，表明柱入口柱床可能有塌陷，可用同型號填料和乙醇配成勻漿，將塌陷處填平，壓緊。2.色譜柱的再生（1）反相色譜柱的再生步驟：甲醇二氯甲烷正己烷二氯甲烷甲醇（2）正相色譜柱的再生步驟：無苯正己烷二氯甲烷異丙醇二氯甲烷無苯正己烷（3）離子交換柱的再生步驟：用稀酸緩沖液沖洗可使陽離子交換柱再生，用稀堿緩沖液沖洗可使陰離子柱再生。（五） 檢

13、測器 一、定義檢測器是將色譜洗脫液中組分的量轉(zhuǎn)變成電信號的傳感器，并由數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄，根據(jù)所得色譜圖上峰的位置、形狀和大小，進行定性、定量分析。二、分類通用型：示差折光檢測器（DRID）、安培檢測器（AD）、蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）專屬型：紫外檢測器（UVD）、可變紫外可見光檢測器（DAD）、熒光檢測器（FD）三、檢測器的性能指標(biāo) （1）噪聲 （2）基線漂移 （3）靈敏度 （4）線性范圍 （5）重復(fù)性四、紫外檢測器 1固定波長紫外吸收檢測器 2可變波長紫外吸收檢測器 3光二極管陣列檢測器 只能檢測有紫外吸收的物質(zhì)，工作原理基于Lambert-Beer定律。五、可變波長紫外檢測器是目前配置

14、最多的檢測器，可根據(jù)組分的最大吸收波長來設(shè)定檢測波長。高效液相色譜儀的使用及維護使用HPLC級試劑和流動相清潔的儀器、流動相和樣品，如果必要，進行過濾保證溶劑的相溶性如果必要，沖洗整個系統(tǒng)，去掉鹽，防止污染在規(guī)定的pH范圍內(nèi)選用流動相對儀器的使用、維護和保養(yǎng)進行記錄建立高效液相色譜分析方法的一般步驟 通常在確定被分析的樣品以后，要建立一種高效液相色譜分析方法必須解決以下問題：根據(jù)被分析樣品的特性選擇適用于樣品分析的一種高效液相色譜分析方法。選擇一根適用的色譜柱，確定柱的規(guī)格（柱內(nèi)徑及柱長）和所選用固定相（粒徑及孔徑）。選擇適當(dāng)?shù)幕騼?yōu)化的分離操作條件，確定流動相的組成、流速及洗脫方式。由獲得的色

15、譜圖進行定性分析和定量分析。 第三節(jié) 高效液相色譜法應(yīng)用示例鹽酸左氧氟沙星滴眼液（5ml:15mg）含量測定測定方法：色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以醋酸銨高氯酸鈉溶液（取醋酸銨4.0g和高氯酸鈉7.0g，加水1300ml使溶解，用磷酸調(diào)節(jié)PH值至2.2）乙腈（85:15）為流動相；檢測波長為294nm。稱取左氧氟沙星對照品、環(huán)丙沙星對照品和雜質(zhì)E對照品各適量，加0.1mol/L鹽酸溶液溶解并稀釋制成每1ml中約含左氧氟沙星0.12mg、環(huán)丙沙星和雜質(zhì)E各6g的混合溶液，取10l注入液相色譜儀，記錄色譜圖，左氧氟沙星峰的保留時間約為15分鐘。左氧氟沙星峰與雜質(zhì)E峰和

16、左氧氟沙星峰與環(huán)丙沙星峰的分離度應(yīng)分別大于2.0與2.5。供試品溶液的制備與測定 精密量取本品1.0ml，置25ml量瓶中，加0.1mol/L鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。另精密稱左氧氟沙星對照品適量，加0.1mol/L鹽酸溶液溶解并定量稀釋成每1ml中約含左氧氟沙星0.12mg的溶液，作為對照品溶液。取供試品溶液與對照品溶液各10ul，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計算出供試品中C18H20FN3O4的含量，即得。本品含鹽酸左氧氟沙星以左氧氟沙星（C18H20FN3O4）計，應(yīng)為標(biāo)示量的92.0%108.0%。（1）配制系統(tǒng)適用性溶液，通過圖譜得到相應(yīng)峰之間的分離度。左氧氟沙星峰的保留時間 左氧氟沙星峰與雜質(zhì)E峰的分離度左氧氟沙星峰與環(huán)丙沙星峰的分離度 （2）配制供試品溶液，進樣，通過圖譜得到主