細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的公開課

1、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的公開課主要內(nèi)容 1.細(xì)胞原代傳代培養(yǎng)概念及培養(yǎng)細(xì)胞的應(yīng)用 2.細(xì)胞培養(yǎng)的條件及環(huán)境 3.體外培養(yǎng)細(xì)胞類型及形態(tài) 4.細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù) 5.細(xì)胞原代培養(yǎng)方法 6.培養(yǎng)細(xì)胞活性測定 7.細(xì)胞傳代培養(yǎng)方法、細(xì)胞保存細(xì)胞原代傳代培養(yǎng)概念及培養(yǎng)細(xì)胞的應(yīng)用 Wilhelm Roux (1850-1924 ) 1885年Roux最早嘗試使組織離體培養(yǎng)，材料是雞胚神經(jīng)板，采用生理鹽水為培養(yǎng)液，并首次采用組織培養(yǎng)這個(gè)術(shù)語。前 言 Alexis CarrelFranceRockefeller Institute for Medical Research New York, NY, USAb. 187

2、3d. 1944 1907年Harrison 和1912年Carrel開始把組織培養(yǎng)作為一種方法，用于研究離體動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)。 他建立的雞胚胎成纖維細(xì)胞持續(xù)了34年之久(1912-1946) One of Carrels D-flasks which were manufactured from PYREX glass 細(xì)胞培養(yǎng)的條件及環(huán)境 - 營養(yǎng)條件- 無菌環(huán)境- 恒定溫度- 氣體- PH值 無菌條件：凈化工作室，風(fēng)淋室，傳遞窗，高效過濾器，潔凈層流罩，生物安全柜，超凈工作臺，紫外燈，電熱干燥箱，濾器，高壓滅菌器，抗生素細(xì)胞生長條件：純水蒸餾器，純水儀，培養(yǎng)板，培養(yǎng)瓶，CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)基

3、，血清細(xì)胞檢測條件：倒置顯微鏡，酶標(biāo)儀，微孔板震蕩器，高速離心機(jī)，移液器細(xì)胞保存條件：液氮罐實(shí)驗(yàn)室安全： 超凈工作臺 超凈工作臺的工作原理是利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動(dòng)空氣通過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺面，使工作臺內(nèi)構(gòu)成無菌環(huán)境。紫外燈：紫外線消毒。主要用于培養(yǎng)室空氣、操作臺、塑料培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等表面消毒紫外燈大約分為3種，分別是UVA、UVB和UVC。UVC是目前工業(yè)上所應(yīng)用的紫外線殺菌燈(253.7nm)，是最常見的一種。高功率紫外線燈經(jīng)8000小時(shí)，一般紫外線燈則在3000小時(shí)後功率會(huì)降至原來70，這時(shí)就應(yīng)該更換。國內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)是：30W新燈管的輻射強(qiáng)度90uw/

4、cm2為合格；使用中輻射強(qiáng)度應(yīng)70uw/cm2。少于此標(biāo)準(zhǔn)就要更換。大容量高壓滅菌器手提式高壓滅菌器濾菌器培養(yǎng)器材CO2培養(yǎng)箱自動(dòng)雙重純水蒸餾器 純水儀液氮罐培養(yǎng)細(xì)胞的生長條件細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制水：新鮮的三蒸水或去離子水培養(yǎng)基：合成培養(yǎng)基： 合成培養(yǎng)基是根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。目前已設(shè)計(jì)出許多種培養(yǎng)基，如M199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。 合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機(jī)鹽和其它一些輔助物質(zhì)。 優(yōu)點(diǎn)：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對固定。成本低。缺點(diǎn)：缺少某些成分，不能完全滿足體外細(xì)胞生長需要?？咕氐氖褂茫涸谂囵B(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內(nèi)

5、常加適量抗菌素，以抑制可能存在的細(xì)菌的生長。通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用。培養(yǎng)基內(nèi)青霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升100單位。慶大霉素：每毫升100單位方便、廣譜、穩(wěn)定。完全培養(yǎng)基的組成培養(yǎng)基的配制平衡鹽溶液 主要用于作為稀釋和灌注的液體，維持細(xì)胞滲透壓，提供緩沖系統(tǒng)，使培養(yǎng)液的酸堿度維持在培養(yǎng)細(xì)胞生理范圍內(nèi)，提供細(xì)胞正常代謝所需的水分和無機(jī)離子等。常用的有PBS，Hanks等。其它添加成分 緩沖系統(tǒng)，常用為HEPES（N-2-hydroxy-ethylpiperazine-N-ethanesulfonic acid），緩沖效能(pKa)在20時(shí)為7.55，37為7.31； HEPES不是起

6、維持pH恒定的作用，而是起恒定和抵抗快速pH變化的，所以調(diào)整pH常常用NaHCO3溶液。有機(jī)補(bǔ)充物，如丙酮酸鈉， 谷胺酰氨等。促細(xì)胞分裂因子，如生長因子類的FGF(成纖維細(xì)胞生長因子)，EGF(表皮生長因子)。貼壁和鋪展因子，如膠原蛋白，纖粘蛋白等?？筛鶕?jù)培養(yǎng)細(xì)胞的特殊要求進(jìn)行添加。 （一）貼壁型：大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞貼附生長，屬于貼壁依賴性細(xì)胞，判斷細(xì)胞形態(tài)時(shí)不能按照體內(nèi)組織學(xué)標(biāo)推判定，僅大致分成以下四型： -成纖維細(xì)胞型 -上皮型細(xì)胞 -游走細(xì)胞型 -多型細(xì)胞型體外培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài) 名稱：凡在培養(yǎng)中形態(tài)與成纖維細(xì)胞類似的來源：由中胚層間充質(zhì)組織起源的組織如：真正的成纖維細(xì)胞，心肌，平滑肌，成骨細(xì)胞

7、，血管內(nèi)皮 形態(tài)：似體內(nèi)成纖維細(xì)胞的形態(tài)，胞體梭形或不規(guī)則三角形，胞質(zhì)向外伸出23個(gè)長短不等的突起，中有卵圓形核 生長特點(diǎn)：排列成放射狀，漩渦狀，并不緊靠連成片，細(xì)胞細(xì)胞接觸易斷開而單獨(dú)行動(dòng)，游離的單獨(dú)的成纖維樣細(xì)胞，常有幾個(gè)伸長的細(xì)胞突起成纖維細(xì)胞型成纖維細(xì)胞 心肌細(xì)胞 2、上皮型細(xì)胞： 細(xì)胞呈扁平不規(guī)則多角形，中央有圓形核，細(xì)胞彼此緊密相連成單層膜。生長時(shí)呈膜狀移動(dòng)，處于膜邊緣的細(xì)胞總與膜相連，很少單獨(dú)行動(dòng)。起源于內(nèi)、外胚層的細(xì)胞如皮膚表皮及其衍生物、消化管上皮、肝、胰、肺泡上皮等皆成上皮型形態(tài)。 名稱：僅形態(tài)上似體內(nèi)，實(shí)際上不完全相同 來源：來源于外胚層、內(nèi)胚層細(xì)胞, 如：皮膚及其衍生物

8、,消化道，乳腺，肺泡, 上皮性腫瘤 形態(tài)：類似體內(nèi)的上皮細(xì)胞扁平，不規(guī)則多角形，中有圓形核 生長特點(diǎn)：易相連成片，相靠緊密相連成薄層鋪石狀生長時(shí)呈膜狀移動(dòng)，很少脫離細(xì)胞群而單個(gè)活動(dòng)上皮型細(xì)胞 3、游走細(xì)胞型： 呈散在生長，一般不連成片，胞質(zhì)常突起，呈活躍游走或變形運(yùn)動(dòng)，方向不規(guī)則。此型細(xì)胞不穩(wěn)定，有時(shí)難以和其他細(xì)胞相區(qū)別。 4、多型細(xì)胞型： 有一些細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài)，可統(tǒng)歸于此類。多型細(xì)胞型游走細(xì)胞型 （二）懸浮型： 見于少數(shù)特殊的細(xì)胞，如某些類型的癌細(xì)胞及白血病細(xì)胞。胞體圓形，不貼于支持物上，呈懸浮生長。這類細(xì)胞容易大量繁殖。 概念：培養(yǎng)時(shí)不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長

9、 或以機(jī)械方法使保持懸浮狀態(tài)下生長 來源：自血，脾或骨髓，尤以血中白細(xì)胞癌腫 細(xì)胞也可能 特點(diǎn)： 在懸浮中生長良好細(xì)胞圓形，單個(gè)或小 細(xì)胞團(tuán) 優(yōu)點(diǎn)： 生存空間大，提供數(shù)量大，傳代方便(不 需消化)，易于收獲，可獲得穩(wěn)定狀態(tài)缺 點(diǎn)：觀察不方便，很多細(xì)胞不能懸浮生 長(尤以正常細(xì)胞)細(xì)胞培養(yǎng)條件 細(xì)胞潔凈間實(shí)驗(yàn)設(shè)備手術(shù)器械玻璃器材細(xì)胞原代培養(yǎng)方法- 組織塊消化法- 直接貼壁法 培養(yǎng)細(xì)胞活性測定 臺盼藍(lán)排斥法FDA-PI雙色熒光檢測法 MTT法方法： 1、將細(xì)胞懸液以0.5ml加入試管中； 2、加入0.5ml 0.4%臺盼蘭染液，染色2一3分 鐘； 3、吸取少許懸液涂于載玻片上，加上蓋片； 4、鏡下

10、取幾個(gè)任意視野分別計(jì)死細(xì)胞和活細(xì)胞數(shù)，計(jì)細(xì)胞活力；死細(xì)胞能被臺盼蘭染上色，鏡下可見深蘭色的細(xì)胞，活細(xì)胞不被染色，鏡下呈無色透明狀。活力測定可以和細(xì)胞計(jì)數(shù)合起來進(jìn)行，但要考慮到染液對原細(xì)胞懸液的加倍稀釋作用。臺盼藍(lán)法臺盼藍(lán)法FDA-PI雙色熒光檢測法 在藍(lán)色光激發(fā)下( 495nm ), 活細(xì)胞被雙醋酸熒光素FDA 染成亮綠色, 死亡細(xì)胞被碘化丙錠PI染成紅色。四唑鹽（MTT）商品名為噻唑藍(lán)；MTT比色法的原理：活細(xì)胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶干水的藍(lán)紫色產(chǎn)物(formazan, 甲攢)，并沉淀在細(xì)胞中，而死細(xì)胞沒有這種功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細(xì)胞中藍(lán)紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含

11、的formazan量成正比。再用酶標(biāo)儀測定OD值； MTT法簡單快速、準(zhǔn)確，廣泛應(yīng)用于新藥篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)、腫瘤放射敏感性實(shí)驗(yàn)等。四唑鹽（MTT）比色法細(xì)胞傳代培養(yǎng)方法 細(xì)胞消化細(xì)胞傳代方法 細(xì)胞保存 細(xì)胞凍存和復(fù)蘇 細(xì)胞低溫冷凍貯存是細(xì)胞室的常規(guī)工作。細(xì)胞凍存與細(xì)胞傳代保存相比可以減少入力、經(jīng)費(fèi)，減少污染，減少細(xì)胞生物學(xué)特性變化。凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融 當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。 如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反，冰晶很大，大冰晶會(huì)造成細(xì)胞膜、細(xì)胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止

12、小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。慢凍程序 標(biāo)準(zhǔn)程序： 當(dāng)溫度在-25以上時(shí)，12/min 當(dāng)溫度達(dá)-25以下時(shí)，510/min 當(dāng)溫度達(dá)-100時(shí)，可迅速放入液氮中 簡易程序： 將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內(nèi)，紗布袋系以線繩，通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降12的速度，在40分鐘內(nèi)降至液氮表面，停30分鐘后，直接投人液氮中。低溫保護(hù)劑的應(yīng)用 在細(xì)胞凍存時(shí)加入低溫保護(hù)劑，能大大提高凍存細(xì)胞存活率。 常用的低溫保護(hù)劑是DMSO，它是一種滲透性保護(hù)劑，可迅速透入細(xì)胞，提高胞膜對水的通透性，降低冰點(diǎn)，延緩凍結(jié)過程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對細(xì)胞的損傷。細(xì)胞凍存方法1.預(yù)先配制凍存液：含20%血清培養(yǎng)基，10% DMSO，DMSO液用培養(yǎng)液配好，避免因臨時(shí)配制產(chǎn)熱而傷害細(xì)胞；2.取對數(shù)生長期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，加入適量凍存液,用吸管吹打制成細(xì)胞懸液（1106 5 106細(xì)胞/ml)；3.加入1ml細(xì)胞于凍存管中，密封后標(biāo)記冷凍細(xì)胞名稱和冷凍日期。Mr Fros