單抗系列培訓(xùn)完整版ppt課件

1、單克隆抗體 分享人：李 行2021.08.單抗根本概念單抗開(kāi)展歷程單抗制備原理單抗實(shí)踐運(yùn)用實(shí)驗(yàn)存在的問(wèn)題報(bào)告內(nèi)容單抗簡(jiǎn)介. 單抗簡(jiǎn)介1975年Kohler和Milstein建立了淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，使經(jīng)綿羊紅細(xì)胞SRBC免疫的小鼠脾細(xì)胞和小鼠的骨髓瘤細(xì)胞交融，創(chuàng)建了第一個(gè)B細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞株，獲得了抗SRBC的單克隆抗體。單抗技術(shù)的問(wèn)世，不僅帶來(lái)了免疫學(xué)領(lǐng)域里的一次革命，而且它在生物醫(yī)學(xué)科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域獲得極廣泛的運(yùn)用，促進(jìn)了眾多學(xué)科的開(kāi)展。因此說(shuō)單抗技術(shù)是免疫學(xué)，乃至醫(yī)學(xué)史上的一個(gè)里程碑。 .抗體消費(fèi)技術(shù)的三個(gè)時(shí)代：多克隆抗體 單克隆抗體 基因工程抗體. 根本概念1.抗原 1.1 傳統(tǒng)抗原根本概

2、念：能啟動(dòng)機(jī)體的免疫應(yīng)對(duì)，且能與其免疫應(yīng)對(duì)產(chǎn)物(抗體或免疫效應(yīng)細(xì)胞)特異性結(jié)合，并產(chǎn)生一系列生物學(xué)效應(yīng)的物質(zhì)。1.2 現(xiàn)代抗原概念：能被B細(xì)胞免疫球蛋白受體識(shí)別或與主要組織相容性復(fù)合體MHC結(jié)合后能被T細(xì)胞受體識(shí)別的物質(zhì)統(tǒng)稱(chēng)為抗原。.1.3 抗原的兩種根本特性：1免疫原性：指抗原分子可以刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)對(duì)產(chǎn)生特異性抗體及免疫效應(yīng)細(xì)胞的性質(zhì)。.2反響原性：指抗原分子與免疫應(yīng)對(duì)產(chǎn)物抗體或免疫效應(yīng)細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合的性質(zhì)。.1.4 完全抗原與半抗原1完全抗原：具有免疫原性和反響原性的物質(zhì)。2半抗原又稱(chēng)不完全抗原：無(wú)免疫原性，只需抗原性的物質(zhì)。3載體carrier：與半抗原結(jié)合使其成為免疫原的物質(zhì)。

3、如BSA，OVA半抗原+ 載體完全抗原.1.5 抗原表位抗原決議簇：指抗原分子中決議抗原特異性的特殊化學(xué)基團(tuán)。即抗原上可以引起機(jī)體產(chǎn)生抗體的分子構(gòu)造。一個(gè)抗原可以有許多不同的抗原決議簇。. 抗體Antibody,Ab根本概念：機(jī)體免疫細(xì)胞被抗原激活后，由分化成熟的終末B細(xì)胞-漿細(xì)胞合成、分泌的一類(lèi)能與抗原特異性結(jié)合的具有免疫功能的免疫球蛋白。3.免疫球蛋白immunoglobulin, Ig： 具有抗體活性或化學(xué)構(gòu)造與抗體分子類(lèi)似的球蛋白。2 .抗體 備注：Ab= Ig, IgAb,Ab是功能描畫(huà)，Ig是化學(xué)構(gòu)造的描畫(huà)。.根本構(gòu)造： 重鏈heavy chain，H2條 輕鏈light chai

4、n，L2條 可變區(qū)variable region, V區(qū) 恒定區(qū)constant region, C區(qū) 超變區(qū)hyper-variable region, HVR),又稱(chēng)互補(bǔ)決議 區(qū)complementarydeterminingregion, CDR 骨架區(qū)framework region,FR 鉸鏈區(qū)hinge region3.1 免疫球蛋白的構(gòu)造可變區(qū).Ig的兩條長(zhǎng)鏈稱(chēng)為重鏈Heavy chain， H鏈，重鏈可分為： ，對(duì)應(yīng)的Ig的種類(lèi)： IgM, IgG, IgA, IgD, IgE.Ig的兩條短鏈稱(chēng)為輕鏈，可分為， ；每個(gè)Ig分子的兩條輕鏈完全一樣。.4. 多克隆抗體polyclo

5、nal antibody,PcAb：指由不同B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的針對(duì)抗原物質(zhì)中多種抗原決議簇的多種抗體混合物。如：免疫血清含多種特異性抗體。.5. 單克隆抗體monoclonal antibody，McAb：是由淋巴細(xì)胞雜交瘤產(chǎn)生的、只針對(duì)復(fù)合抗原分子上某一單個(gè)抗原決議簇的特異性抗體。6.細(xì)胞克?。河梢粋€(gè)細(xì)胞增殖而成的細(xì)胞群體。 克隆可以堅(jiān)持親本的絕大部分性狀。.8. 多克隆抗體和單克隆抗體的優(yōu)優(yōu)勢(shì)PcAbMcAb特異性低高均一性無(wú)有敏感性差強(qiáng)親和力親和力較強(qiáng)親和力不強(qiáng)成本、時(shí)間制備相對(duì)便宜，時(shí)間短成本高，時(shí)間長(zhǎng).雜交瘤技術(shù)根本原理. .制備流程交融在具有挑選作用的培育基中培育挑選出分泌抗體的細(xì)胞

6、，進(jìn)展克隆化SP2/0B細(xì)胞和SP2/0死亡.1. 抗原制備 不論是制備單抗還是多抗，抗原的設(shè)計(jì)與制備都是一個(gè)非常重要的問(wèn)題，設(shè)計(jì)或者制備得不好的抗原有能夠完全不能免疫出抗體來(lái)。 1.1 一個(gè)良好的抗原必需具備的條件：1 分子量：普通是分子量越大，免疫原性越強(qiáng)，對(duì)于多肽或蛋白質(zhì)類(lèi)的抗原來(lái)說(shuō)，一個(gè)抗原決議簇又叫表位，epitope，通常由6-8個(gè)氨基酸殘基組成。而平均每5-10kD 才有一個(gè)表位，因此分子太小的多肽或蛋白是很難有一個(gè)表位的?？贵w制備過(guò)程及影響要素.2化學(xué)構(gòu)造與組成：構(gòu)造盡量復(fù)雜。簡(jiǎn)單反復(fù)的物質(zhì)是不具有免疫原性的，拿明膠來(lái)說(shuō)，它的分子量非常大，而且外源性也很強(qiáng)，但是組成明膠的氨基酸

7、多為直鏈氨基酸，在體內(nèi)容易被降解，因此它的免疫原性很弱。蛋白質(zhì)：a.氨基酸組成：含芳香族氨基酸特別是酪氨酸，免疫源性強(qiáng)。b.構(gòu)造：環(huán)狀的免疫原性強(qiáng)；直鏈，免疫原性弱。多糖：具有免疫原性，較蛋白質(zhì)弱。核酸：多無(wú)免疫原性。.3 外源性強(qiáng)。在個(gè)體構(gòu)成的早期就對(duì)本身物質(zhì)構(gòu)成了免疫耐受，因此假設(shè)和機(jī)體內(nèi)的物質(zhì)完全一樣或者是類(lèi)似就很難引起機(jī)體的免疫應(yīng)對(duì)。4可降解性好。作為抗原，必需是可以降解的，塑料、不銹鋼等難降解的物質(zhì)免疫原也很弱。含L-氨基酸的蛋白質(zhì)易降解，具有免疫原性。但是由D-型氨基酸組成的物質(zhì)免疫原性很弱，同樣是由于機(jī)體不能降解D-氨基酸組成的蛋白或多肽。.2. 免疫方案2.1 動(dòng)物的選擇：常見(jiàn)

8、的可以用來(lái)制備抗體的動(dòng)物有：小鼠、大鼠、豚鼠、倉(cāng)鼠、兔、綿羊、山羊、馬、驢、奶牛，還有用雞或者鴨的。需思索的問(wèn)題：第一個(gè)問(wèn)題是能否具有較好的免疫效果.第二個(gè)問(wèn)題是抗血清產(chǎn)量的問(wèn)題.2.2 免疫佐劑：先于免疫原或同時(shí)與抗原混合注射機(jī)體可加強(qiáng)抗原的免疫原性的物質(zhì)。1顆?？乖庖咝詮?qiáng)，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果，如細(xì)胞類(lèi)抗原、電泳跑蛋白膠。2可溶性抗原免疫原性較弱，普通要加佐劑。油性佐劑：福氏完全佐劑、福氏不完全佐劑；無(wú)機(jī)化合物微生物及其產(chǎn)物脂質(zhì)體細(xì)胞因子.2.4 抗原與佐劑的乳化2.5 免疫途徑：1體內(nèi)免疫：皮下，腹腔，肌肉，靜脈等2體外免疫：較少。2.3 免疫劑量：根據(jù)免疫原、免疫途徑、免疫

9、動(dòng)物、免疫佐劑有關(guān)。 普通的免疫劑量是微克級(jí)別。2.6 免疫時(shí)間間隔：普通間隔2-3個(gè)星期。.抗體產(chǎn)生的普通規(guī)律初次應(yīng)對(duì)：抗原初次進(jìn)入機(jī)體產(chǎn)生的應(yīng)對(duì)。特點(diǎn)：埋伏期誘導(dǎo)期長(zhǎng)7-10天； 抗體的種類(lèi)以IgM為主； 抗體的親和力低； 維持時(shí)間短； 總抗體程度低。.再次應(yīng)對(duì)：抗原再次進(jìn)入機(jī)體所產(chǎn)生的應(yīng)對(duì)。特點(diǎn)：埋伏期短約2-3天； 抗體的種類(lèi)以IgG為主； 抗體的親和力比初期應(yīng)對(duì)明顯加強(qiáng)； 維持時(shí)間長(zhǎng)； 總抗體程度高。.3. 免疫鼠血清的采集和檢測(cè)小鼠第三次免疫1 周后，免疫組對(duì)小鼠進(jìn)展眼球靜脈采血，搜集血清，血清交由檢測(cè)擔(dān)任人，該擔(dān)任人對(duì)血清進(jìn)展檢測(cè)。1免疫酶技術(shù)：ELISA，IPMA2免疫熒光技術(shù)

10、：IFA3間接血凝實(shí)驗(yàn)4放射免疫檢測(cè) .4. 雜交瘤細(xì)胞株的建立 SP2/0的預(yù)備 豢養(yǎng)層細(xì)胞的制備 脾細(xì)胞B細(xì)胞的制備 脾細(xì)胞和SP2/0的交融 單克隆抗體的制備與鑒定雜交瘤的挑選 細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇 實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵！.4.1 試劑和耗材 4.1.1 試劑： DMEM 、 胎牛血清FBS、 HAT 、 HT 、 50%PEG ， 青、鏈霉素、生理鹽水;4.1.2 儀器：生物平安柜、二氧化碳培育箱、程度離心機(jī)、倒置顯微鏡； 工具：止血鉗，剪刀、直頭眼科鑷子、彎頭眼科鑷子.4.2 進(jìn)展細(xì)胞交融的前一天，預(yù)備豢養(yǎng)層細(xì)胞：8-10周齡BALB/c雌性小鼠;用注射器向腹腔內(nèi)注射DMEM，悄然揉壓小鼠腹膜，抽出

11、腹腔內(nèi)液體，搜集到一個(gè) 離心管中，反復(fù)操作3次左右;離心1000rpm ,5min ,棄上清，重懸細(xì)胞，鋪板密度2x105。實(shí)驗(yàn)流程4.2.2 預(yù)備豢養(yǎng)層細(xì)胞: 取靜止形狀的腹腔巨噬細(xì)胞4.2.1 骨髓瘤細(xì)胞SP2/0的培育：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期.4.2.3 脾細(xì)胞B細(xì)胞的制備：交融前3天加強(qiáng)免疫小鼠1注射器反復(fù)吹打法2研磨法1生物方法：病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞交融2化學(xué)誘導(dǎo)：PEG誘導(dǎo) 50%PEG(10004000)3物理誘導(dǎo)：電交融4.2.4 脾細(xì)胞和SP2/0的交融：交融方法主要有以下幾種方法.細(xì)胞交融.交融過(guò)程中的本卷須知：1 SP2/0細(xì)胞和免疫脾細(xì)胞的數(shù)量比例適當(dāng)，1:5-1:10；2兩種細(xì)胞形狀要

12、好，洗吹細(xì)胞一定要輕柔；3PEG交融之后，加培育基中和時(shí)要緩慢，以免破壞交融的細(xì)胞。.雜交瘤細(xì)胞的挑選第一次挑選.5、陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的挑選第二次挑選：挑選時(shí)機(jī)的把握1免疫酶技術(shù)：ELISA運(yùn)用最多。.2免疫熒光技術(shù)：IFA3間接血凝實(shí)驗(yàn)4放射免疫檢測(cè) 5免疫印跡分析6免疫沉淀7免疫組化和功能中和實(shí)驗(yàn) 重要思索：“他的抗體用于什么就用什么去篩，挑選戰(zhàn)略必需可以反映所需抗體隨后的用途。.選擇挑選戰(zhàn)略時(shí)，必需求思索下面的要素：1可以處置多達(dá)1000個(gè)樣品約120ul/樣品的才干；248h內(nèi)可以完成鑒定的才干；3能否具備必要的試劑/設(shè)備；4反響的特異性；5實(shí)驗(yàn)體系的靈敏度；6最重要的能否能得到結(jié)果。挑

13、選時(shí)交融前的免疫血清作為陽(yáng)性對(duì)照，這樣確保一切的技術(shù)、試劑、設(shè)備是最適宜的。同樣，用培育雜交瘤細(xì)胞的培育基作為陰性對(duì)照。.6、雜交瘤細(xì)胞的克隆化：指將抗體陽(yáng)性孔進(jìn)展克隆化。目的是將抗體分泌細(xì)胞、抗體非分泌細(xì)胞、特異性抗體分泌細(xì)胞和無(wú)關(guān)抗體分泌細(xì)胞分開(kāi)。6.1 克隆化的原那么：盡早進(jìn)展，普通要進(jìn)展2-3次克隆。6.3 克隆化的方法主要包括以下：克隆之前制備豢養(yǎng)細(xì)胞6.2.1有限稀釋法: 其原理是，將培育孔內(nèi)細(xì)胞用槍或吸管吹打使之懸浮，然后用計(jì)數(shù)板進(jìn)展計(jì)數(shù)，最后按每孔0.5-1個(gè)細(xì)胞的量將原孔細(xì)胞稀釋滴至新的培育板上事先制備好豢養(yǎng)層細(xì)胞，培育一段時(shí)間以后就可以看到部分孔有單個(gè)克隆構(gòu)成實(shí)際上講最終每

14、孔的細(xì)胞個(gè)數(shù)在整體上服從泊松分布 優(yōu)點(diǎn):a、最簡(jiǎn)單的克隆化方法；b、不需求太多的儀器設(shè)備，操作也不復(fù)雜。 缺陷：a、由于計(jì)數(shù)不準(zhǔn)確或者移液器的偏向，最終導(dǎo)致操作結(jié)果不理想； b、由于細(xì)胞經(jīng)過(guò)吹打的剪切力破壞，細(xì)胞也不一定可以按期望生長(zhǎng)。.2半固體培育法: 原理和做分子克隆時(shí)的菌落挑選有點(diǎn)類(lèi)似半固體培育原理和做分子克隆時(shí)的菌落挑選有點(diǎn)類(lèi)似;其方法是將雜交瘤細(xì)胞與液體低融點(diǎn)的瓊脂糖或甲基化纖維素溶液混合，然后將其倒入含有事先制備的豢養(yǎng)層的培育板上，冷后后培育基呈固態(tài)，在37培育一段時(shí)間后，單個(gè)雜交瘤細(xì)胞會(huì)構(gòu)成類(lèi)似菌落的小克隆，可以用槍頭將其挑出到培育板上在液體培育基里培育，這樣也可以實(shí)現(xiàn)克隆化。

15、優(yōu)點(diǎn)：a、操作比較直觀簡(jiǎn)單， 缺陷：對(duì)半固體培育基的要求比較高，容易出現(xiàn)細(xì)胞不生長(zhǎng)或者污染情況發(fā)生。3顯微操作法 把陽(yáng)性孔里的細(xì)胞稀釋到足夠稀，靜置半小時(shí)后細(xì)胞會(huì)沉淀到孔底，然后在顯微鏡下用槍直接汲取一個(gè)單細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有豢養(yǎng)層細(xì)胞的孔內(nèi)培育即可。優(yōu)點(diǎn)：最初級(jí)、最直觀、最省腦力和人力的方法，步驟簡(jiǎn)單。4熒光激活細(xì)胞分別法：流式細(xì)胞術(shù).7. 細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇及時(shí)對(duì)各階段陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)展凍存凍存步驟： 1吹下需凍存的細(xì)胞； 21000rpm 離心5 min，棄上清； 3用凍存液將細(xì)胞重懸，之后凍存； 4將細(xì)胞放入細(xì)胞凍存盒內(nèi)，然后將其直接放入-80冰箱 過(guò)夜不小于12h，之后將細(xì)胞轉(zhuǎn)入液氮中。.細(xì)

16、胞復(fù)蘇步驟：1從液氮中取出細(xì)胞，迅速置于37水浴鍋中融化細(xì)胞；-快！2直接將細(xì)胞參與瓶25cm2中，并參與含20% 胎牛血清的DMEM培育基貼壁培育,12小時(shí)后，充去上清，換入新穎培育基繼續(xù)培育。.8. 單克隆抗體的消費(fèi)8.1 在產(chǎn)生特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞分別、克隆并凍存建庫(kù)后，擴(kuò)增雜交瘤細(xì)胞可以消費(fèi)抗體。處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞培育上清可產(chǎn)生3-20ug/ml 的抗體。-抗體產(chǎn)量低8.2 目前單克隆抗體消費(fèi)包括腹水制備和細(xì)胞培育兩種方法。.8.2.1腹水制備流程：1提早7天，小鼠腹腔注射0.5ml石蠟油；2小心吹打細(xì)胞瓶底部，使細(xì)胞從瓶底零落，搜集細(xì)胞；3室溫1200r/min離心6 mi

17、n，棄上清；4用不完全培育液DMEM或生理鹽水按照0.5ml/只鼠懸浮細(xì)胞；5將細(xì)胞懸液注射到小鼠腹腔；67-10天后小鼠腹腔明顯鼓起后，采集腹水。.8.2.2 細(xì)胞培育消費(fèi)單抗：利用滾瓶、轉(zhuǎn)瓶和CELLine 瓶制備單抗。1在單克隆抗體的產(chǎn)量方面，滾瓶和轉(zhuǎn)瓶較普通的細(xì)胞培育瓶只需少許優(yōu)勢(shì)。2 CELLine ：膜式雙室技術(shù)的一種的體外細(xì)胞培育系統(tǒng)。 .9、單抗特性的檢測(cè)：9.1 抗體特異性：除用抗原進(jìn)展抗體檢測(cè)，還運(yùn)用與抗原成分相關(guān)的其他抗原進(jìn)展交叉實(shí)驗(yàn)，方法：ELISA等。9.2 單克隆抗體亞類(lèi)的鑒定 商品化試劑盒9.3 Western Blot 分析9.4 抗體的中和活性9.5 抗體的親

18、和力9.6 抗體對(duì)應(yīng)抗原的分子量9.7 抗體的識(shí)別表位.10. 抗體純化 1初步純化鹽析法有機(jī)沉淀法凝膠過(guò)濾法2精細(xì)純化親和層析法離子交換層析法疏水層析法反向?qū)游龇?生物平安柜II級(jí)A2型生物平安柜最常用.生物平安程度與實(shí)驗(yàn)室類(lèi)型世界通用生物平安程度規(guī)范是由美國(guó)疾病控制中心(CDC)和美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研討院(NIH)建立的。. 級(jí)生物平安柜是一種負(fù)壓過(guò)濾排風(fēng)柜。 防止操作者和環(huán)境暴露于實(shí)驗(yàn)過(guò)程中產(chǎn)生的生物氣溶膠。1維護(hù)實(shí)驗(yàn)操作者在操作時(shí)，室內(nèi)空氣被抽入前面的格柵，產(chǎn)生一個(gè)空氣屏障，防止有生物危險(xiǎn)的懸浮微粒散入室內(nèi)。2維護(hù)實(shí)驗(yàn)樣品層流的、HEPA過(guò)濾的空氣向下，經(jīng)過(guò)任務(wù)面，防止室內(nèi)空氣進(jìn)入，防止樣品

19、存在交叉污染。3維護(hù)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境在空氣分開(kāi)柜前，必需經(jīng)過(guò)一個(gè)排氣HEPA濾膜，確保排出柜體的氣流是干凈的，對(duì)環(huán)境無(wú)害。.細(xì)胞培育箱.倒置顯微鏡. 含血清的DMEM.96孔細(xì)胞板48孔細(xì)胞板24孔細(xì)胞板6孔細(xì)胞板.存在問(wèn)題及處理方案1. 為什么免疫后沒(méi)有效價(jià)或免疫后效價(jià)低？1 設(shè)計(jì)的抗原與被免疫的動(dòng)物內(nèi)源蛋白有極高的同源性或者抗原是免疫原性極差的小分子物質(zhì)。對(duì)于前一種情況應(yīng)該重新設(shè)計(jì)抗原，設(shè)計(jì)抗原時(shí)盡量選取目的蛋白特異性的序列，可以設(shè)計(jì)為短肽然后再與載體蛋白偶聯(lián)之后免疫；對(duì)于后一種情況，首先確認(rèn)抗原質(zhì)量能否良好，可改用其它廠家的產(chǎn)品或改用同一廠家的其它批號(hào)，也可思索改動(dòng)抗原分子的部分構(gòu)造，或改良提

20、取方法；制備的免疫原能否符合要求，可從偶聯(lián)劑、載體、抗原與載體的銜接比例、 反響時(shí)間等多方面去思索，并加以改良；假設(shè)偶聯(lián)沒(méi)有問(wèn)題，可以改換其它的載體蛋白，如 KLH 。.2 免疫的周期不正確。免疫周期過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短，各免疫步驟之間的間隔過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短都有能夠影響免疫效果。3免疫佐劑不適宜。弗氏佐劑也不能保證完全有效，TiterMax 等佐劑在免疫時(shí)，對(duì)于某些抗原能夠效果不佳，此時(shí)可以思索改換佐劑嘗試。4免疫劑量不合理。過(guò)大的免疫劑量能夠?qū)е旅庖吣褪?，過(guò)少的免疫劑量能夠無(wú)法激活免疫應(yīng)對(duì)。5免疫途徑不合理。6 測(cè)效價(jià)的過(guò)程存在錯(cuò)誤操作，尤其思索包被能否勝利或二抗運(yùn)用能否正確。同時(shí)，一抗即血清稀釋梯度盡量放

21、寬，普通建議從1:500或1:1000開(kāi)場(chǎng)作梯度稀釋。對(duì)于多肽和小分子物質(zhì)，效價(jià)到達(dá)1:2000甚至更低仍可視為免疫勝利。.7動(dòng)物的豢養(yǎng)能否得當(dāng)，如營(yíng)養(yǎng)飼料、飲水、環(huán)境衛(wèi)生通風(fēng)、采光、溫度能否符合要求，動(dòng)物的安康情況能否良好等。 2. 為什么交融后細(xì)胞不長(zhǎng)或者交融后克隆很少？ 1免疫用的動(dòng)物品系不正確或者品系不純。免疫用的動(dòng)物普通應(yīng)該與骨髓瘤來(lái)源的動(dòng)物是一樣品系，例如運(yùn)用 SP2/0骨髓瘤細(xì)胞時(shí)應(yīng)該選用 Balb/C 小鼠，同時(shí)必需運(yùn)用品系純粹的小鼠。2培育基中參與了過(guò)高濃度的 HAT，或者僅 A 的濃度過(guò)高或 HT 的濃度過(guò)低，建議用純的骨髓瘤和已有的雜交瘤作 HAT 濃度挑選。3培育基不正

22、確或血清濃度不正確或運(yùn)用了劣質(zhì)血清。4未正確制備豢養(yǎng)細(xì)胞。5接種雜交瘤細(xì)胞的培育板過(guò)多。普通在5-20塊96孔板為宜。.6 細(xì)胞被污染。在顯微鏡下仔細(xì)察看能否有明顯的微生物污染。即使看不到有明顯的微生物，也應(yīng)該思索能否有支原體污染，有條件的可以做支原體檢測(cè)。7 細(xì)胞培育條件不正確。確保細(xì)胞培育在恒定的37較濕的環(huán)境，同時(shí)保證 CO2濃度在4-5%左右。8其它與交融條件相關(guān)的不恰當(dāng)?shù)囊亍?3. 為什么交融后得不到陽(yáng)性克??？ 1動(dòng)物不免疫勝利就進(jìn)展了交融。 2 交融后得到的克隆較少，故得到陽(yáng)性克隆的機(jī)率也較小。 3挑選克隆手段不正確。例如有些小分子物質(zhì)不可以直接包被到酶標(biāo)板上，再如運(yùn)用了不適當(dāng)?shù)?/p>

23、二抗等諸多要素，也有人直接不運(yùn)用 ELISA 作為挑選方法的，勝利率也有待商榷。4抗原成份與細(xì)胞培育條件中的物質(zhì)一樣或類(lèi)似，或者與挑選過(guò)程中有同抗 原構(gòu)造一樣或類(lèi)似的物質(zhì)產(chǎn)生了競(jìng)爭(zhēng)反響。假設(shè)需求制備抗 BSA 的單抗，那么養(yǎng)雜交瘤的培育基中不可以運(yùn)用牛血清，否那么牛血清中的 BSA 直接與抗體相結(jié)合，最后做 ELISA 挑選的時(shí)候無(wú)法得到陽(yáng)性結(jié)果。處理的方法只需運(yùn)用其它的動(dòng)物的血清或者運(yùn)用無(wú)血清培育基。再如，假設(shè)需求制備酪蛋白的單抗，那么做 ELISA 挑選時(shí)，二抗的稀釋液不可以運(yùn)用脫脂奶粉。5 其它一切能影響 ELISA 等相關(guān)挑選手段的要素。.4 . 為什么細(xì)胞生長(zhǎng)很慢？1運(yùn)用了劣質(zhì)的培育

24、耗材、培育基、血清、HAT 或 HT。建議新手運(yùn)用知名廠商的試劑或耗材。對(duì)于血清，能夠需求從多個(gè)廠家選用多個(gè)批次試用，選擇出比較好的批次進(jìn)展實(shí)驗(yàn)。在試用血清的時(shí)候，普通可以運(yùn)用相對(duì)較低濃度的血清進(jìn)展骨髓瘤細(xì)胞培育實(shí)驗(yàn)，根據(jù)骨髓瘤細(xì)胞的倍增速度確實(shí)血清質(zhì)量。2運(yùn)用的血清或培育基濃度不正確。仔細(xì)檢查配方能否正確。3制備豢養(yǎng)細(xì)胞的方法不正確。.5. 克隆原來(lái)檢測(cè)是陽(yáng)性的，為什么后來(lái)轉(zhuǎn)為陰性了？ 首先要留意的是，正常情況下，雜交瘤也不是絕對(duì)穩(wěn)定的，確實(shí)容易發(fā)生染色體喪失的情況，尤其是當(dāng)細(xì)胞移到新環(huán)境中生長(zhǎng)，如從小孔擴(kuò)展到大孔，或者復(fù)蘇操作時(shí)，更容易發(fā)生陽(yáng)性變?yōu)殛幮?。但是也有一些方法盡量減少陽(yáng)性變?yōu)殛幮?/p>

25、，普通可以從這幾個(gè)方面加以留意：1永遠(yuǎn)保證細(xì)胞處在最正確的生長(zhǎng)環(huán)境中。尤其是培育基不能長(zhǎng)期不換，普通來(lái)說(shuō)，當(dāng)細(xì)胞增長(zhǎng)到一定密度的時(shí)候，培育基就開(kāi)場(chǎng)變顏色，這個(gè)時(shí)候就要預(yù)備換培育基了。除了換培育基，同時(shí)應(yīng)該控制好細(xì)胞的密度，可以吹走過(guò)多的細(xì)胞，使新參與的培育基不至于很快被耗費(fèi)。2對(duì)于重要的細(xì)胞株，每一步都把陽(yáng)性的細(xì)胞保種。3不要過(guò)于頻繁操作細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)密度不是很大的時(shí)候，不要頻繁操作，否那么細(xì)胞容易出現(xiàn)死亡或者生長(zhǎng)形狀發(fā)生明顯變化。.4 對(duì)于傳代次數(shù)較多的細(xì)胞株需求經(jīng)常進(jìn)展亞克隆，并將每一次的亞克隆株也作凍存。5當(dāng)細(xì)胞被支原體等微生物污染，也會(huì)發(fā)生由陽(yáng)性轉(zhuǎn)為陰性的情況。6. 為什么亞克隆后長(zhǎng)

26、不出克隆來(lái)？1亞克隆時(shí)，原始孔里的細(xì)胞形狀不好，經(jīng)過(guò)有限稀釋或其它手段亞克隆的細(xì)胞活性很差，以致于長(zhǎng)不出克隆。2亞克隆時(shí)，沒(méi)有按照正確的數(shù)量取出細(xì)胞，亞克隆的過(guò)程服從泊松分布，假設(shè)取出的細(xì)胞遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于平均每孔一個(gè)細(xì)胞，或有效細(xì)胞遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于平均每孔一個(gè)細(xì)胞，那么也能夠出現(xiàn)長(zhǎng)不出克隆的結(jié)果。3未添加豢養(yǎng)細(xì)胞。單個(gè)細(xì)胞在完全培育基中極難培育，假設(shè)不添加豢養(yǎng)細(xì)胞，那么它們很能夠很快就死亡，最終就長(zhǎng)不出克隆。.4 運(yùn)用的 HAT 中 HT 失效或 A 的濃度過(guò)高，或者未添加 HT。 雖然 HT 對(duì)雜交瘤的生長(zhǎng)并不是必需的，但是 HT 確實(shí)可以加快細(xì)胞生長(zhǎng)，改善細(xì)胞生長(zhǎng)形狀。 5運(yùn)用無(wú)血清培育基。這一點(diǎn)是很冷

27、僻的一個(gè)要素。雖然很少有人運(yùn)用無(wú)血清培育基制備單抗，但是在某些血清能夠干涉挑選步驟的實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，能夠會(huì)選用無(wú)血清培育基來(lái)培育雜交瘤，但是需求留意的是，在很多種無(wú)血清培育基中，單個(gè)細(xì)胞是很難長(zhǎng)成克隆的。最好的處理方法就是先用含有血清的培育基培育它們，等克隆長(zhǎng)出后再把培育基徹底改換為無(wú)血清培育基。.7. 為什么凍存的細(xì)胞很難復(fù)蘇或者復(fù)蘇不活？這個(gè)問(wèn)題要從兩個(gè)方面來(lái)回答，一是凍存方面，二是復(fù)蘇問(wèn)題。7.1 對(duì)于凍存過(guò)程，需求留意：1 凍存液的配方。這個(gè)問(wèn)題很關(guān)鍵，一個(gè)良好的凍存液配方可以使細(xì)胞保管得非常好，而一個(gè)不好的凍存液配方能夠會(huì)讓細(xì)胞傾刻死亡。凍存維護(hù)劑 DMSO的含量非常重要，假設(shè)這個(gè)濃度過(guò)

28、低，那么起不到維護(hù)作用，凍存的細(xì)胞最終會(huì)死于冰晶構(gòu)成時(shí)的張力，假設(shè)濃度過(guò)高，那么細(xì)胞中毒而亡。2凍存過(guò)程中，不可用力過(guò)大，在凍存液中重懸細(xì)胞的時(shí)候更是要輕柔，由于在 DMSO 存在的條件下，細(xì)胞膜變得非常脆弱，假設(shè)用力過(guò)猛，那么細(xì)胞膜很容易破，復(fù)蘇成活的時(shí)機(jī)就明顯會(huì)下降。3凍存的程序也非常重要。實(shí)際闡明，以每分鐘1的速度下降凍存細(xì)胞是最理想的。.5 保證被凍存的細(xì)胞處于良好的生長(zhǎng)形狀，并且沒(méi)有被污染。4假設(shè)條件簡(jiǎn)易，可以把細(xì)胞放在4半小時(shí)左右，然后再在-20放置1小時(shí)，最后轉(zhuǎn)入-80放置過(guò)夜，最終轉(zhuǎn)入液氮保管。需求短期保管的，直接放-80也行。如今有細(xì)胞凍存盒，把需求存放的細(xì)胞放進(jìn)去，然后直接

29、放-80就行，等時(shí)間夠長(zhǎng)后直接轉(zhuǎn)至液氮中即可。.7.2 對(duì)于復(fù)蘇過(guò)程，需求留意：1快速融化。為了防止升溫中細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生冰晶，劇烈建議加快融化過(guò)程。普通都要用足夠體積的 37熱水復(fù)蘇，并不斷晃動(dòng)凍存管。2 復(fù)蘇過(guò)程不要把凍存管全部泡入水中，也不要把蓋子弄濕，否那么熱水有能夠污染管口，呵斥復(fù)蘇的細(xì)胞被污染。3 假設(shè)復(fù)蘇細(xì)胞時(shí)，沒(méi)有去掉凍存液，這樣就把凍存液里的DMSO 帶到了新的培育體系里，容易對(duì)細(xì)胞呵斥毒害，所以對(duì)于貼壁細(xì)胞貼壁后換液或者細(xì)胞離心后去掉凍存液，然后用新的完全培育基重懸，再接種到新的容器內(nèi)培育。.8. 單克隆抗體制備細(xì)胞實(shí)驗(yàn)最棘手的問(wèn)題-細(xì)胞污染細(xì)胞培育污染是指培育環(huán)境中侵入了對(duì)細(xì)胞

30、生存有害的成分和呵斥細(xì)胞變異的異物。細(xì)胞培育污染可分為以下三類(lèi): 物理性、化學(xué)性及生物性。 8.1 物理性污染的來(lái)源、危害及預(yù)防 物理性污染經(jīng)過(guò)影響細(xì)胞培育體系中的生化成分, 從而影響細(xì)胞的代謝。1培育環(huán)境中的物理要素，如溫度、放射線、振動(dòng)、輻射( 紫外線或熒光) 會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生影響。2細(xì)胞、培育液或其它培育試劑暴露于放射線、輻射或過(guò)冷過(guò)熱的溫度中， 可以引起細(xì)胞代謝發(fā)生改動(dòng), 如細(xì)胞同步化、細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制甚至細(xì)胞死亡。.3防備措施：經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)室的合理設(shè)計(jì)及建立規(guī)范的操作規(guī)程， 可以減少環(huán)境中物理要素對(duì)細(xì)胞的影響。培育箱應(yīng)放在溫度較恒定的環(huán)境中，周?chē)荒芊胖媚芤饳C(jī)械振動(dòng)的設(shè)備，如離心機(jī)。培育液及

31、培育試劑應(yīng)放在固定的位置，為防止光照試劑不能放在玻璃門(mén)的冰箱中，試劑周?chē)荒芊磐凰?。培育液從冰箱中取出后?yīng)在室溫中放置一段時(shí)間后再進(jìn)展實(shí)驗(yàn)，以防止過(guò)冷的溫度對(duì)細(xì)胞的影響。.8.2 化學(xué)性污染的來(lái)源、危害及預(yù)防 培育環(huán)境中許多化學(xué)物質(zhì)都可以引起細(xì)胞的污染。化學(xué)物質(zhì)并不總是抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)， 某些化學(xué)物質(zhì)如激素就可促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)。不同細(xì)胞對(duì)化學(xué)物質(zhì)污染的反響是不一樣的。 未純化的物質(zhì)、試劑、水、血清、生長(zhǎng)輔助因子及儲(chǔ)存試劑的容器都能夠成為化學(xué)性污染的來(lái)源。 細(xì)胞培育的必需營(yíng)養(yǎng)，如氨基酸，假設(shè)濃度超越了適宜的范圍，也會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性。同樣，不同細(xì)胞系其最正確培育條件下對(duì)血清和緩沖液的要求是不一樣的，

32、在培育中應(yīng)嚴(yán)厲控制。 玻璃制品清洗過(guò)程中殘留的變性劑或肥皂( 通常殘留在瓶蓋的內(nèi)外表) 是最常見(jiàn)的化學(xué)性污染。.8.2.1 水 水是獨(dú)一一種在凝固時(shí)膨脹的化合物。因此在選擇凍存細(xì)胞的容器時(shí)應(yīng)思索到這個(gè)要素。容器因水的膨脹而發(fā)生破裂是引起試劑污染的重要緣由。為了防止金屬離子、有機(jī)分子、細(xì)胞內(nèi)毒素等物質(zhì)對(duì)水的污染，在配制液體，清洗容器時(shí)必需運(yùn)用不含雜質(zhì)的超純水。需求留意的是, 超純水放置過(guò)久其純度會(huì)下降。 在高壓蒸氣滅菌及蒸餾水時(shí)水經(jīng)常被污染， 由于高壓蒸氣鍋及純水機(jī)的常規(guī)維護(hù)后能夠有少量的化學(xué)物質(zhì)殘留。為了保證水的純度, 我們應(yīng)采取措施盡量防止化學(xué)物質(zhì)的殘留。.8.2.2 血清 動(dòng)物血清是細(xì)胞培

33、育中常用的天然培育基, 但血清又是潛在的生物及化學(xué)污染的來(lái)源。 由于血清采集于多個(gè)動(dòng)物, 而且不同廠商的消費(fèi)工藝及質(zhì)量各不一樣, 因此血清中許多成分的濃度存在很大的變異。血清對(duì)不同細(xì)胞的促生長(zhǎng)才干及毒副作用取決于這些細(xì)胞的分化功能、組織來(lái)源及培養(yǎng)基的成分等要素。在進(jìn)展一系列實(shí)驗(yàn)時(shí), 為了保證明驗(yàn)的可反復(fù)性, 最好選用同一批次的血清。.8.3.3 培育液、培育附加成分、試劑 培育液、培育附加成分、試劑都能夠成為化學(xué)性污染的來(lái)源。細(xì)胞培育運(yùn)用的一切物質(zhì)都應(yīng)是高純度的，并經(jīng)過(guò)權(quán)威機(jī)構(gòu)的鑒定，實(shí)驗(yàn)者本人也應(yīng)對(duì)上述成分進(jìn)展純度鑒定。同時(shí), 正確配置和儲(chǔ)存培育液及試劑也非常重要的, 應(yīng)該采取規(guī)范的操作步驟

34、，防止液體體積計(jì)算錯(cuò)誤, 混用類(lèi)似化合物等錯(cuò)誤。.8.3.4 培育器皿及容器 細(xì)胞培育過(guò)程中會(huì)運(yùn)用到各種不同的培育器皿及容器。培育器皿的大小,構(gòu)形設(shè)計(jì)能夠會(huì)影響到培育中氣體交換、濕度、培育液的 pH 值和細(xì)胞生長(zhǎng)密度。培育器皿的工藝及滅菌過(guò)程中的差別能夠?qū)ε嘤w系產(chǎn)生影響。塑料制品在消費(fèi)過(guò)程中能夠殘留一些有毒成形劑，消費(fèi)工藝的不同能夠引起器皿外表附著才干的不同。儲(chǔ)存不同物質(zhì)時(shí)應(yīng)選用適宜的塑料或玻璃容器，由于酒精、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿可以溶解塑料或玻璃的某些成分。.8.3 生物性污染的來(lái)源、危害及預(yù)防 外界的微生物如昆蟲(chóng)、節(jié)肢動(dòng)物、原蟲(chóng)、霉菌、病毒、細(xì)菌、無(wú)細(xì)胞壁的微生物( 通常指支原體) 和其它類(lèi)型的細(xì)

35、胞都能夠侵入培育環(huán)境引起污染。只需在一個(gè)開(kāi)放的環(huán)境中進(jìn)展培育, 都難以防止發(fā)生污染。.8.3.1 細(xì)菌污染細(xì)菌污染是實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞培育中常見(jiàn)的污染，即使在細(xì)胞培育液中參與了抗菌素(普通為預(yù)防劑量)，也能夠由于操作不慎而引起污染。最常見(jiàn)的有革蘭氏陽(yáng)性菌，如枯草桿菌以及大腸桿菌、假單胞菌等革蘭氏陰性菌，其中又以白色葡萄球菌較常見(jiàn)。培育細(xì)胞受細(xì)菌污染后，會(huì)出現(xiàn)培育液變混濁，pH改動(dòng)。也有的培育液肉眼察看無(wú)多少改動(dòng)，只能在鏡下發(fā)現(xiàn)菌體才知污染。所以，每天應(yīng)仔細(xì)察看。污染后細(xì)胞發(fā)生病理改動(dòng)，胞內(nèi)顆粒增多、增粗，最后變圓零落死亡，呵斥實(shí)驗(yàn)失敗和細(xì)胞株(系)喪失。.8.3.2 真菌污染真菌污染是細(xì)胞培育過(guò)程中最

36、常見(jiàn)的一種，尤其在霉雨季節(jié)進(jìn)展細(xì)胞培育更易污染。最常見(jiàn)的真菌有煙曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。培育細(xì)胞受真菌污染后，可見(jiàn)培育液中漂浮著白色或淺黃色的小點(diǎn)，有的散在生長(zhǎng)，培育液普通不發(fā)生混濁；倒置顯微鏡下可見(jiàn)絲狀、管狀或樹(shù)枝狀的菌絲縱橫交錯(cuò)在細(xì)胞之間或培育基中，有的呈鏈狀陳列。念珠菌和酵母菌呈卵圓形散在細(xì)胞周邊和細(xì)胞之間。個(gè)體細(xì)小，有增多趨勢(shì)。鏡下看時(shí)，要將培育瓶用酒精棉球擦干凈，以防止與瓶外尤其瓶底外面生長(zhǎng)的菌絲相混淆。真菌污染后，細(xì)胞生長(zhǎng)變慢，但最后由于營(yíng)養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細(xì)胞零落死亡。.8.3.3 支原體污染支原體是介于細(xì)菌與病毒之間能獨(dú)立生活的最小微生物，最小直徑0

37、.2m，普經(jīng)過(guò)濾除菌無(wú)法去除它，光鏡下難以看清它的形狀構(gòu)造。開(kāi)場(chǎng)不易發(fā)現(xiàn)，能在偏堿條件(pH7.68.0)下生存，對(duì)青霉素有抗藥性，多吸附于細(xì)胞外表或散在于細(xì)胞之間。電鏡下可見(jiàn)其有三層構(gòu)造，無(wú)細(xì)胞壁，中央有電子密度大的密集顆?；蚪z狀的中心囊。培育細(xì)胞受支原體污染后，部分敏感細(xì)胞可見(jiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖變慢，部分細(xì)胞變圓，從瓶壁零落。但多數(shù)細(xì)胞污染后無(wú)明顯變化，或略有變化，假設(shè)不及時(shí)處置，還會(huì)產(chǎn)生交叉污染。.8.3.4 病毒污染采用組織細(xì)胞培育法消費(fèi)疫苗，假設(shè)沒(méi)有除去潛在病毒的組織培育物，會(huì)產(chǎn)生病毒污染。目前，從原代猴腎細(xì)胞的培育中已發(fā)現(xiàn)不少于20種血清性病毒。雖然病毒污染的細(xì)胞不影響原代培育，但消費(fèi)疫

38、苗是不平安的。假設(shè)二倍體細(xì)胞系有SV40或多發(fā)瘤病毒，B淋巴細(xì)胞含EB病毒，細(xì)胞和會(huì)發(fā)生變異、轉(zhuǎn)化，構(gòu)成異倍體的細(xì)胞系。因此潛在病毒是細(xì)胞大量消費(fèi)和疫苗、干擾素等生物制品制造中的難題。.8.3.5 非同種細(xì)胞污染由于細(xì)胞培育操作時(shí)各細(xì)胞株所需的器材和溶液沒(méi)有嚴(yán)厲分開(kāi)，操作不當(dāng)，往往會(huì)使一種細(xì)胞被另一種細(xì)胞污染。如“靈長(zhǎng)類(lèi)細(xì)胞系發(fā)現(xiàn)猴和鼠類(lèi)細(xì)胞的混合物，ERK/KD細(xì)胞是從兔腎中分別出來(lái)的，而如今句卻以為是HeLa細(xì)胞。目前，世界上已有幾十種細(xì)胞都被HeLa細(xì)胞所污染，致使許多實(shí)驗(yàn)宣告無(wú)效。非細(xì)胞培育物所呵斥的化學(xué)成分的污染也偶有發(fā)生，大多是由于細(xì)胞培育所需物品清洗消毒不徹底而帶入一些有毒化學(xué)物

39、質(zhì)所致。.預(yù)防措施：1在進(jìn)展多種細(xì)胞培育操作時(shí)，所用器具要嚴(yán)厲區(qū)分，最好做上標(biāo)志便 于區(qū)分。并按順序進(jìn)展操作，防止一同進(jìn)展時(shí)易發(fā)生混亂。2在進(jìn)展換液或傳代操作時(shí)，注射器和滴管不要觸及細(xì)胞培育瓶瓶口，以 免把細(xì)胞帶到培育液中污染其他細(xì)胞。3一切細(xì)胞一旦購(gòu)置，或從別處引入，或本人建立，均應(yīng)及早留種凍存，一 旦發(fā)生污染可棄之復(fù)蘇，重新培育。.9.單克隆抗面子臨的問(wèn)題9.1 如何進(jìn)一步縮短單抗研發(fā)周期,降低消費(fèi)本錢(qián) 傳統(tǒng)方法制備單克隆抗體包括抗原制備、動(dòng)物免疫、抗體檢測(cè)方法的建立、細(xì)胞交融、雜交瘤細(xì)胞的挑選、亞克隆、凍存復(fù)蘇、雜交瘤細(xì)胞及單克隆抗體特性的鑒定及單克隆抗體的大量消費(fèi)等一系列復(fù)雜步驟，普通

40、要破費(fèi)6個(gè)月以上的時(shí)間，研發(fā)周期較長(zhǎng)。同時(shí)每只小鼠自始自終只能免疫一種純化抗原，將這種免疫小鼠的脾臟B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)展交融后，構(gòu)成的雜交瘤細(xì)胞也只能分泌針對(duì)這一種純化抗原的單一單克隆抗體，任務(wù)效率低,消費(fèi)本錢(qián)高。因此，如何利用分子生物學(xué)技術(shù)，抑制現(xiàn)有消費(fèi)技術(shù)的局限性,縮短單抗研發(fā)周期，降低消費(fèi)本錢(qián)，建立消費(fèi)雜交瘤細(xì)胞株的高效方法，是當(dāng)前需 處理的問(wèn)題。.9.2 如何進(jìn)一步提高體外用單抗的質(zhì)量 研制高親和性單抗是免疫化學(xué)技術(shù)的重要開(kāi)展方向之一，將會(huì)進(jìn)一步提高單克隆抗體在微量分析領(lǐng)域內(nèi)的運(yùn)用。同時(shí)，隨著單抗在診斷與治療中運(yùn)用的快速開(kāi)展，對(duì)單抗種類(lèi)及數(shù)量的需求越來(lái)越多,如何進(jìn)展大規(guī)模的消費(fèi)也

41、已成為抗體純化的主要問(wèn)題。另外，單克隆抗體對(duì)抗原的識(shí)別,與多克隆抗體有很大的不同。不同試劑盒因運(yùn)用的單克隆抗體不同,識(shí)別抗原的位點(diǎn)不同，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果有一定差別。因此,體外用單抗規(guī)范化問(wèn)題還需求進(jìn)一步研討。.9.3 如何進(jìn)一步提高治療用單抗的質(zhì)量 如何進(jìn)一步降低單抗藥物的免疫原性，提高單抗藥物在腫瘤組織的濃度是研制治療用單抗的開(kāi)展方向。.一、鼠源性單克隆抗體開(kāi)展歷程.二、人源化抗體1. 概念：是指抗體的可變區(qū)部分即Vh和Vl區(qū)或抗體一切全部由人類(lèi)抗體基因所編碼。 2. 人源化抗體包括嵌合抗體、改型抗體、外表重塑 抗體和全人源化抗體等。.2.1 嵌合抗體1概念：是利用DNA重組技術(shù)，將異源單抗的輕

42、、重鏈可變區(qū)基因插入含有人抗體恒定區(qū)的表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)出嵌合抗體，這樣表達(dá)的抗體分子中輕重鏈的V區(qū)是異源的，而C區(qū)是人源的，這樣整個(gè)抗體分子的近2/3部分都是人源的。2特點(diǎn)：減少了鼠源性抗體的免疫原性；保管了親本抗體特異性結(jié)合抗原的才干。.2.2 改型抗體1概念：改型抗體也稱(chēng)CDR植入抗體(CDR grafting antibody)，抗體可變區(qū)的CDR是抗體識(shí)別和結(jié)合抗原的區(qū)域，直接決議抗體的特異性。將鼠源單抗的CDR移植至人源抗體可變區(qū)，替代人源抗體CDR，使人源抗體獲得鼠源單抗的抗原結(jié)合特異性，同時(shí)減少其異源性。.2.3 外表重塑抗體 1概念：外表重塑抗體是指對(duì)異源抗體外

43、表氨基酸殘基進(jìn)展人源化改造。該方法的原那么是僅交換與人抗體SAR差別明顯的區(qū)域，在維持抗體活性并兼顧減少異源性根底上選用與人抗體外表殘基類(lèi)似的氨基酸交換。.2.4 全人源化抗體 1概念：是指將人類(lèi)抗體基因經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體技術(shù)，將人類(lèi)編碼抗體的基因全部轉(zhuǎn)移至基因工程改造的抗體基因缺失動(dòng)物中，使動(dòng)物表達(dá)人類(lèi)抗體，到達(dá)抗體全人源化的目的。 .三 、小分子抗體 完好抗體分子具有體積大相對(duì)分子質(zhì)量約為150103、組織穿透才干差等缺乏，促進(jìn)了抗體分子的小型化。小分子抗體具有組織穿透才干強(qiáng)、免疫原性弱、構(gòu)造穩(wěn)定、制備簡(jiǎn)單和表達(dá)效率高等優(yōu)點(diǎn)，是基因工程中制備人源單抗的主要產(chǎn)物，目前小分子抗體主要用于放射免疫顯像或治療等方面。其缺陷是與抗原的結(jié)合力弱、半衰期短等。 小分子抗體主要包括：?jiǎn)蝺r(jià)小分子抗體，如Fab 片段、Fv 片段最小識(shí)別單位等；多價(jià)小分子抗體，如雙鏈、三鏈抗體等；納米抗體，即只需一個(gè)重鏈可變區(qū)組成的單域抗體，其相對(duì)分子質(zhì)量只需單克隆