REACH法規(guī)第四卷譯稿-13說(shuō)課材料

1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。REACH法規(guī)第四卷譯稿-13-B.10.誘變(性)體外哺乳動(dòng)物染色體變異測(cè)定1.方法這種方法是對(duì)1997年進(jìn)行的試管中哺乳動(dòng)物染色體異常測(cè)定的（theOECDTG）的復(fù)制。1.1.引言體外哺乳動(dòng)物染色體異常實(shí)驗(yàn)的目的是證實(shí)在人工培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞（1）（2）（3）中能誘發(fā)染色體結(jié)構(gòu)異常的媒質(zhì)的存在。結(jié)構(gòu)性異常存在兩種方式：染色體異常，或者染色單體異常。大多數(shù)誘導(dǎo)有機(jī)體突變的物質(zhì)會(huì)引起染色單體異常，但是染色體異常也會(huì)發(fā)生。多倍體的增加也可以證明一種化學(xué)物質(zhì)有誘發(fā)染色體數(shù)目異常的潛力。然而，這種方法不是為

2、了測(cè)定數(shù)目異常而設(shè)計(jì)的，也不常用于此目的。染色體變異以及相關(guān)變化是很多人類遺傳病的起因，并且有確實(shí)的現(xiàn)象證明染色體變異及其相關(guān)變化導(dǎo)致的體細(xì)胞中治癌基因和腫瘤抑制基因的變化與人類和動(dòng)物樣品的癌癥反應(yīng)有關(guān)。體外哺乳動(dòng)物染色體異常實(shí)驗(yàn)要進(jìn)行移植的細(xì)胞層，細(xì)胞株和初級(jí)細(xì)胞群的培養(yǎng)。所選用的細(xì)胞應(yīng)從培養(yǎng)中的生長(zhǎng)能力，染色體組型平衡能力，染色體數(shù)目，染色體多樣性，和染色體異常的自發(fā)頻率幾方面進(jìn)行挑選。在體外進(jìn)行的測(cè)定通常需要借助于外加的代謝活化系統(tǒng)。在體外的測(cè)定條件下，不可能完全模擬出哺乳動(dòng)物樣品的新陳代謝系統(tǒng)。要小心控制條件，以避免無(wú)法表現(xiàn)內(nèi)在誘變的陽(yáng)性的結(jié)果出現(xiàn)，及PH值、同滲重摩、細(xì)胞內(nèi)高毒素量（

3、）（）的增長(zhǎng)。這個(gè)實(shí)驗(yàn)是用來(lái)辨認(rèn)可誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物內(nèi)有機(jī)體突變的物質(zhì)和致癌物質(zhì)。哺乳動(dòng)物體內(nèi)的致癌物質(zhì)多數(shù)在這個(gè)測(cè)定中起正反應(yīng)；但是此測(cè)定并不能完全測(cè)定出體內(nèi)的致癌物。聯(lián)系是建立在化學(xué)物質(zhì)的種類之上的。不斷的事實(shí)證明，那些用此測(cè)定未被測(cè)定出的致癌物是通過(guò)機(jī)械機(jī)制作用，而不是通過(guò)直接的DNA破壞來(lái)作用的?？蓞⒖淳C合引言B.1.2.定義染色單體變異：通過(guò)單個(gè)的染色單體分解和染色單體的重組表現(xiàn)的結(jié)構(gòu)性染色體損傷。染色體變異：表現(xiàn)為同一位置的兩條染色單體的分解，或者分解后又重組染色體結(jié)構(gòu)損傷。核內(nèi)復(fù)制：在DNA復(fù)制的一個(gè)S時(shí)期后，核沒有進(jìn)入有絲分裂，卻開始另一個(gè)S時(shí)期的過(guò)程。結(jié)果是帶有4，8，16，染色單

4、體的染色體的出現(xiàn)?？p隙：在一個(gè)染色單體范圍內(nèi)的最小程度的染色單體未對(duì)準(zhǔn)錯(cuò)誤。有絲分裂指數(shù)：細(xì)胞轉(zhuǎn)位期在一個(gè)細(xì)胞群中被總的細(xì)胞數(shù)目所分隔開的比率；是對(duì)該細(xì)胞群的增生擴(kuò)散程度的反映。數(shù)目異常：染色體數(shù)目相對(duì)于細(xì)胞正常數(shù)目的變化。染色多體：?jiǎn)伪度旧w（n）的復(fù)制而不是雙倍數(shù)染色體的復(fù)制（例如3n，4n等等）；結(jié)構(gòu)性異常：可由顯微鏡觀測(cè)到的有絲分裂細(xì)胞分化過(guò)程中的染色體結(jié)構(gòu)變化，能觀察到碎片，及內(nèi)在改變或交換。1.3.實(shí)驗(yàn)原理細(xì)胞株要在有代謝活化作用和無(wú)代謝活化作用下與測(cè)定物接觸。在細(xì)胞株與測(cè)定物接觸后的一定預(yù)定時(shí)間間隔后，用中間體捕獲物質(zhì)（如Colemid或秋水仙素）處理，來(lái)捕獲過(guò)渡期的細(xì)胞。過(guò)渡期

5、的細(xì)胞要在顯微鏡下分析其染色體異常表現(xiàn)。1.4.實(shí)驗(yàn)步驟1.4.1.準(zhǔn)備1.4.1.1.細(xì)胞可選用各種細(xì)胞列，細(xì)胞株和細(xì)胞群包括人的體細(xì)胞（如中國(guó)鼠類的纖維原細(xì)胞、人類或其他哺乳動(dòng)物淋巴中的淋巴細(xì)胞）。1.4.1.2.介質(zhì)和培養(yǎng)條件應(yīng)采用合適的培養(yǎng)媒介及培養(yǎng)條件（培養(yǎng)皿，CO2濃度，溫度及濕度）來(lái)保存細(xì)胞群。需在染色單體數(shù)目的穩(wěn)定性和是否存在支原體污染兩方面對(duì)選定的細(xì)胞列和細(xì)胞株進(jìn)行定期測(cè)定。如已被支原體污染，應(yīng)不再選用。應(yīng)該知道正常的細(xì)胞存活周期及存活條件。1.4.1.3.培養(yǎng)準(zhǔn)備選定細(xì)胞列和細(xì)胞株：從普通的細(xì)胞群繁殖細(xì)胞，在培養(yǎng)媒介中，以一種在采樣前不會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞群混合的濃度和370C的條件

6、下進(jìn)行培育。淋巴球:血液用抗凝結(jié)劑（如肝磷脂）進(jìn)行處理，后將從建康體中分離出的淋巴球中加入含有分裂素（如植物血球凝集素）的培養(yǎng)基，并在37下培育。1.4.1.4.新陳代謝活性細(xì)胞應(yīng)在存在代謝活性和不存在代謝活性的條件下與測(cè)定藥物接觸。最常用的活化系統(tǒng)是經(jīng)誘導(dǎo)酶介質(zhì)處理的，從嚙齒類動(dòng)物肝臟制備的cofactor-supplementedpost-motochondrialfraction。所用的誘導(dǎo)酶介質(zhì)如Aroclor1254（6）（7）（8）（9）獲苯巴比酮與萘黃酮（10）（11）（12）的混合物。在最終的測(cè)定媒介中，末段線粒體片段常被應(yīng)用于濃度范圍110%v/v之間。代謝活化系統(tǒng)的條件決定

7、于被測(cè)定的化學(xué)物質(zhì)。在某些情況下，可以不止一種末段線粒體濃度被選用。數(shù)目的增長(zhǎng)，包括能表達(dá)特殊活化作用的酶的經(jīng)遺傳得到的功能性細(xì)胞的構(gòu)造，可以提供潛在的內(nèi)部活化作用。應(yīng)按科學(xué)的方法調(diào)整對(duì)細(xì)胞列的選擇（如根據(jù)細(xì)胞色素P450同功能酶對(duì)測(cè)定物的新陳代謝的適應(yīng)度）。1.4.1.5.測(cè)定物質(zhì)/準(zhǔn)備固體測(cè)定物質(zhì)應(yīng)該在合適的溶劑或媒介物中被溶解或形成懸濁液，如果高于細(xì)胞處理濃度應(yīng)進(jìn)行稀釋。液體測(cè)定物可直接加入測(cè)定體系或稀釋到高于處理濃度。測(cè)定物應(yīng)是新鮮制成的，除非有確切的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明儲(chǔ)存物的可用性。1.4.2.測(cè)定條件1.4.2.1.溶劑/媒介物溶劑/媒介物不應(yīng)該與待測(cè)物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，并與細(xì)胞的存活和S9

8、的活動(dòng)相協(xié)調(diào)。若選用的不是常用的溶劑或媒介物，其成分要有具體的數(shù)字表明其的可用性。能用水作溶劑或媒介物的，應(yīng)首先考慮水。當(dāng)測(cè)定的是對(duì)水不穩(wěn)定的物質(zhì)時(shí)，應(yīng)首先考慮有機(jī)溶劑或媒介物?？捎梅肿雍Y除去水。1.4.2.2.暴漏濃度在決定最高濃度時(shí)，應(yīng)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)中的細(xì)胞毒素，在測(cè)定系統(tǒng)中的溶解度，PH值的改變或同滲重摩效應(yīng)進(jìn)行考慮。在用細(xì)胞完整性和成長(zhǎng)程度作為表征的主要實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞的毒性，需要由在代謝活化作用和無(wú)代謝活化作用下的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)共同確定。如細(xì)胞合并的程度，成活細(xì)胞數(shù)，或有絲分裂指數(shù)。它對(duì)于初步實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞毒性和溶解性的確定是非常有用的。至少應(yīng)選用三種測(cè)定濃度。在產(chǎn)生細(xì)胞毒素的地方，濃度范圍應(yīng)從產(chǎn)生最大毒

9、性到產(chǎn)生最小或不產(chǎn)生毒性。這常意味著各濃度間相差從2到間的一個(gè)值。在收集觀測(cè)細(xì)胞時(shí)，最高濃度的測(cè)定條件在細(xì)胞的合并程度、細(xì)胞數(shù)、有絲分裂指數(shù)上表現(xiàn)出明顯的降低（降低幅度大于50%）。有絲分裂指數(shù)是對(duì)細(xì)胞毒素效應(yīng)/細(xì)胞抑制效應(yīng)的間接測(cè)量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，它決定于處理后的時(shí)間。但是，對(duì)于其它毒性測(cè)定方法較麻煩或不可行的懸濁液體系，有絲分裂指數(shù)是適用的。有關(guān)細(xì)胞循環(huán)動(dòng)力學(xué)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，如平均產(chǎn)生時(shí)間（AGT），能夠被用作補(bǔ)充信息。但AGT僅僅是總體的平均值，不能揭示延遲產(chǎn)生的細(xì)胞的存在，并且其微小的變化不能與細(xì)胞最佳異變時(shí)間的延遲相聯(lián)系。對(duì)于相關(guān)的無(wú)毒性物質(zhì)，最大測(cè)定濃度是5l/ml，最低測(cè)定濃度是5mg/m

10、l，或0.01M。對(duì)于相關(guān)的不溶物，比不溶濃度低的濃度無(wú)毒性，所選用的最高級(jí)量應(yīng)比處理末期其在最后媒介物中的溶解度高。在某些情況下（如僅僅在比最低不溶濃度高時(shí)產(chǎn)生毒性），應(yīng)該在不止一種濃度下進(jìn)行測(cè)定。在處理之初和結(jié)束時(shí)估計(jì)溶解度是有用的，因?yàn)橛捎诩?xì)胞，S9，血清等的存在會(huì)使?jié)舛仍跍y(cè)定系統(tǒng)接觸于空氣的過(guò)程中發(fā)生改變。肉眼即可觀測(cè)到不溶現(xiàn)象。沉淀物不應(yīng)干擾實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。1.4.2.3.陰性和陽(yáng)性對(duì)照并發(fā)的陽(yáng)性和陰性（溶劑或媒質(zhì)）對(duì)照，既要在存在代謝活性又要在不存在代謝活性的條件下進(jìn)行，每一次實(shí)驗(yàn)都要采用。當(dāng)代謝活性系統(tǒng)被運(yùn)用時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照化學(xué)物質(zhì)應(yīng)該是要求活化才能產(chǎn)生誘導(dǎo)有機(jī)體突變物質(zhì)的。陽(yáng)性對(duì)照應(yīng)借助

11、于已知的斷裂劑，再接觸的水平上有望在支配測(cè)定系統(tǒng)靈敏度的背景下產(chǎn)生明顯的增長(zhǎng)。應(yīng)選擇陽(yáng)性對(duì)照濃度，從而得到清晰的效果又不直接向讀者揭示編碼變化的特性。陽(yáng)性對(duì)照物的例子包括：新陳代謝活化條件物質(zhì)CASNO.EINECSNO.無(wú)外部代謝活化系統(tǒng)甲基磺酸鹽66-27-3200-625-0乙基磺酸鹽62-50-0200-536-7乙基亞硝基脲759-73-9212-072-2絲裂霉素C50-07-7200-008-6N-氧化物-4-硝基喹啉56-57-5200-281-1存在外加代謝活化系統(tǒng)苯并芘50-32-8200-028-5環(huán)磷酰胺環(huán)磷酰胺一水化物50-18-06055-19-2200-015-4

12、環(huán)其他適合的陽(yáng)性對(duì)照物也可使用?；瘜W(xué)等級(jí)的陽(yáng)性對(duì)照物如果有效，也可考慮。陰性對(duì)照，由單獨(dú)的溶劑和媒介物形成的實(shí)驗(yàn)介質(zhì)，要和實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基一樣處理，每次收集時(shí)都應(yīng)包括在內(nèi)。此外，未處理對(duì)照也應(yīng)當(dāng)被使用，除非控制過(guò)程的歷史實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明所選溶劑無(wú)毒副作用，也不會(huì)發(fā)生任何突變。1.4.3.實(shí)驗(yàn)步驟1.4.3.1.測(cè)定物處理在新陳代謝活化系統(tǒng)存在和不存在情況下，分別以測(cè)定物對(duì)增殖細(xì)胞作用。刺激有絲分裂后約48小時(shí)開始淋巴細(xì)胞測(cè)定。1.4.3.2.在不同濃度培養(yǎng)基下重復(fù)培養(yǎng)。強(qiáng)烈建議使用逆向溶劑控制。能證實(shí)兩次重復(fù)培養(yǎng)之間的歷史實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的變化最小變化（13）（14），其他的適當(dāng)陽(yáng)性的對(duì)照物質(zhì)可能被用?；瘜W(xué)藥品

13、應(yīng)該被考慮的陽(yáng)性對(duì)照,當(dāng)可得的.此實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)即可用于各濃度的單次培養(yǎng)。氣態(tài)或揮發(fā)性物質(zhì)應(yīng)采用適當(dāng)方式測(cè)定，如在密封的培養(yǎng)皿中進(jìn)行（15）（16）。1.4.3.3.培養(yǎng)物收集時(shí)間在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，無(wú)論有無(wú)新陳代謝活性，細(xì)胞均應(yīng)接觸在測(cè)定物中36小時(shí)。實(shí)驗(yàn)開始后（12），每個(gè)約1.5個(gè)正常細(xì)胞周期取一次樣。如果在有無(wú)活化劑的情況下，取樣結(jié)果都是逆向的，就需要在無(wú)活化的條件下再做一次。連續(xù)處理直至取樣周期等于1.5個(gè)正常細(xì)胞周期。某些物質(zhì)更容易在處理/取樣周期長(zhǎng)于1.5個(gè)細(xì)胞周期是被測(cè)定出來(lái)。新陳代謝活化條件下的逆向結(jié)果應(yīng)在各次測(cè)定結(jié)果上加以證實(shí)。在無(wú)必要進(jìn)行逆向測(cè)定結(jié)果確定的情況下，應(yīng)給出正當(dāng)?shù)睦碛伞?/p>

14、1.4.3.4.染色體的準(zhǔn)備有秋水仙素或秋水酰胺處理的細(xì)胞培養(yǎng)物一般在13小時(shí)即可收集。為了準(zhǔn)備染色體，每份細(xì)胞培養(yǎng)物應(yīng)單獨(dú)收集、處理。染色體的處理包括細(xì)胞低滲處理、固定、染色。1.4.3.5.分析所有的固定切片包括陽(yáng)性和陰性對(duì)照，都應(yīng)該在顯微鏡分析前進(jìn)行獨(dú)立的分析。因?yàn)楣潭ǖ倪^(guò)程，經(jīng)常帶來(lái)一定量的中期細(xì)胞的分裂和染色體的喪失。標(biāo)記的細(xì)胞因包含很多中心小體，數(shù)目幾乎與所有細(xì)胞類型樣式數(shù)相當(dāng)。至少每單位濃度和對(duì)照的200個(gè)好的細(xì)胞經(jīng)過(guò)中期是應(yīng)被標(biāo)記；如果正確的話，能被所有復(fù)制品均勻的分開。當(dāng)更多的異變發(fā)生時(shí)，這個(gè)數(shù)目會(huì)下降。盡管測(cè)定目的是測(cè)定結(jié)構(gòu)性染色體變異，如果細(xì)胞內(nèi)發(fā)生多倍體復(fù)制現(xiàn)象，進(jìn)行記

15、錄也是很重要的。2.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)2.1.結(jié)果的處理測(cè)定的單位是細(xì)胞，因而應(yīng)該評(píng)估發(fā)生結(jié)構(gòu)性染色體變異的細(xì)胞的比率。不同類型的結(jié)構(gòu)性染色體變異應(yīng)同時(shí)列出數(shù)目、實(shí)驗(yàn)頻率、對(duì)照培養(yǎng)品。裂縫應(yīng)單獨(dú)記錄，一般不包括在總的變異頻率中。還應(yīng)記錄所有陽(yáng)性和陰性對(duì)照中的培養(yǎng)物的細(xì)胞毒素量。應(yīng)提供單個(gè)培養(yǎng)物的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。此外，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)以表格的形式總結(jié)。沒有必要對(duì)一個(gè)清晰的陽(yáng)性反應(yīng)進(jìn)行證明。不確定的結(jié)果將在以后的實(shí)驗(yàn)中通過(guò)精確的改善實(shí)驗(yàn)條件而被證實(shí)。陰性結(jié)果證明的必要性已經(jīng)在1.4.3.3中討論過(guò)了。擴(kuò)大確定條件的分類而對(duì)研究參數(shù)的糾正應(yīng)該在隨后的實(shí)驗(yàn)中考慮。應(yīng)該糾正的研究參數(shù)包括濃度、時(shí)間間隔、新陳代謝活化條件。

16、2.2.結(jié)果評(píng)價(jià)與分析這里有許多確定的陽(yáng)性結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)，向相關(guān)的濃度增加或帶有染色體變異的細(xì)胞數(shù)目的復(fù)制性增加。應(yīng)首先考慮生化關(guān)系。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法被用來(lái)評(píng)估測(cè)定結(jié)果（3）（B）。但統(tǒng)計(jì)學(xué)的意義不應(yīng)該作為判斷陽(yáng)性結(jié)果的唯一因素。多倍體細(xì)胞數(shù)目的增加可以表明測(cè)定物質(zhì)有抑制有絲分裂和引發(fā)級(jí)數(shù)式染色體變異的潛能。細(xì)胞內(nèi)染色體復(fù)制的細(xì)胞數(shù)目的增加，可以證明實(shí)驗(yàn)物質(zhì)有抑制細(xì)胞循環(huán)進(jìn)行的潛能（17）（18）。在這一個(gè)系統(tǒng)中，結(jié)果不符合上述的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定物質(zhì)被認(rèn)為是非誘導(dǎo)有機(jī)體突變的物質(zhì)。雖然大多數(shù)的實(shí)驗(yàn)將會(huì)給出清楚的陽(yáng)性的或陰性的結(jié)果,但在極少的情況下數(shù)據(jù)將不能對(duì)所測(cè)定物質(zhì)的活性做出明確的判斷。無(wú)論測(cè)定重復(fù)進(jìn)行了多少

17、次，結(jié)果仍保持意義不明確的或可疑的。染色體變異測(cè)定中陽(yáng)性的結(jié)果指出測(cè)定物質(zhì)導(dǎo)致人工培育的哺乳動(dòng)物的體細(xì)胞內(nèi)染色體結(jié)構(gòu)變異。陰性的結(jié)果指出,在測(cè)定情況之下，測(cè)定物質(zhì)不導(dǎo)致人工培育的哺乳動(dòng)物的體細(xì)胞內(nèi)的染色體變異。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)告測(cè)定結(jié)果報(bào)告測(cè)定結(jié)果報(bào)告必需包括下列各項(xiàng)信息:溶劑/媒介物:選擇媒介物的理有;測(cè)定物質(zhì)在溶劑或媒介物中的可溶性和穩(wěn)定性,如果已知;細(xì)胞:細(xì)胞的類型和來(lái)源;被用細(xì)胞的染色體類型特征和合適性;沒有支原體，如果適用;細(xì)胞的周期長(zhǎng)短的信息：被采血者的性別,全血或分開的淋巴細(xì)胞，使用的有絲分裂原各種方法的數(shù)量,如果使用;細(xì)胞培養(yǎng)基的保養(yǎng)方法,如果使用;染色體類型的數(shù)目。測(cè)定條件:中

18、期發(fā)現(xiàn)物質(zhì)的識(shí)別特征，它的密度和細(xì)胞接觸的忍耐力;選擇密度和所涉生物物種的數(shù)據(jù)，例如：細(xì)胞毒性的數(shù)據(jù)和可溶性限制,如果可得的;培養(yǎng)基的結(jié)構(gòu),二氧化碳的集中度，如果可得;測(cè)定物質(zhì)的集中度;媒介物和所加的測(cè)定物質(zhì)的量;孵化溫度;孵化時(shí)間;持續(xù)處理;在播物種的細(xì)胞密度,如果合適的;變化的活動(dòng)系統(tǒng)的類型和組成,包括可接受標(biāo)準(zhǔn);陽(yáng)性的和陰性的對(duì)照組;準(zhǔn)備膠片的方法;變異的標(biāo)準(zhǔn);數(shù)字分析;毒性測(cè)量的方法;判斷研究是陽(yáng)性的或陰性的標(biāo)準(zhǔn)；結(jié)果;毒性的標(biāo)志,例如交流匯合的程度，細(xì)胞周期的數(shù)據(jù),細(xì)胞計(jì)數(shù),有絲分裂;沉淀的標(biāo)志;在pH和處理介質(zhì)上的數(shù)據(jù),如果可決定的;變異的定義,包括縫隙;染色體變異的細(xì)胞的數(shù)目和染

19、色體變異的類型，這些根據(jù)對(duì)照組的物種類的不同分開來(lái)給出;倍性的變化，如果可以看到;劑量回應(yīng)的關(guān)系,在可能的地方;如果有，就進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析;并發(fā)事件陰性(溶劑/媒介物)和陽(yáng)性對(duì)照數(shù)據(jù);歷史上的陰性(溶劑/媒介物)和陽(yáng)性的對(duì)照組數(shù)據(jù),藉由范圍和方法和標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果的討論。結(jié)論。4.參考文獻(xiàn)Evans,H.J.(1976).CytologicalMethodsforDetectingChemicalMutagens.In:Chemicalmutagens,PrinciplesandMethodsfortheirDetection,Vol.4,Hollaender,A.(ed)PlenumPress,N

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