葉用銀杏種質(zhì)資源黃酮和萜內(nèi)酯類含量及AFLP遺傳多樣性分析(共10頁(yè))

1、園藝學(xué)報(bào)，（）： 2014411223732382 http: / www. ahs. ac. cn Acta Horticulturae Sinica E-mail: 收稿日期(rq)：20140805；修回日期：20141017 基金項(xiàng)目：國(guó)家(guji)科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD21B04）；山東省農(nóng)業(yè)良種工程重大課題（魯農(nóng)良字20117號(hào)）；國(guó)家植物種質(zhì)資源共享平臺(tái)(pngti)項(xiàng)目（2013-39） 葉用銀杏種質(zhì)資源黃酮和萜內(nèi)酯類含量及AFLP遺傳多樣性分析 吳岐奎，邢世巖*，王 萱，孫立民 （山東農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，山東泰安 271018） 摘 要：對(duì)葉用銀杏種質(zhì)資源進(jìn)行黃酮和萜

2、內(nèi)酯類含量及AFLP遺傳關(guān)系分析。結(jié)果表明，葉用銀杏種質(zhì)資源在黃酮和萜內(nèi)酯類含量水平和DNA分子水平上都存在較高的遺傳多樣性。68份葉用銀杏種質(zhì)葉片提取物成分中銀杏苦內(nèi)酯A、B、C、J和白果內(nèi)酯B，銀杏總內(nèi)酯，黃酮的平均含量分別為0.0371%、0.0185%、0.0280%、0.0133%、0.0243%、0.1216%、1.7103%。8對(duì)AFLP引物組合共擴(kuò)增出1 408條譜帶，其中多態(tài)帶為99.28%，Neis基因多樣性和Shannons指數(shù)分別為0.1939和0.3142；種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)在0.2924 0.7413之間，平均值為0.4888。種質(zhì)間基于黃酮和萜內(nèi)酯類含量分析的聚

3、類分析結(jié)果與基于遺傳相似系數(shù)的UPGMA聚類分析結(jié)果基本一致。利用黃酮和萜內(nèi)酯類含量和AFLP分析相結(jié)合的方法，篩選出高黃酮和萜內(nèi)酯類特異種質(zhì)，對(duì)葉用銀杏種質(zhì)資源的評(píng)價(jià)與保護(hù)有一定的積極意義。 關(guān)鍵詞：銀杏；種質(zhì)資源；葉用；黃酮；萜內(nèi)酯類；含量；AFLP；遺傳多樣性 中圖分類號(hào)：S 792.95 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：0513-353X（2014）12-2373-10 Genetic Diversity of Leaf-used Ginkgo biloba Germplasms Based on Flavonoids and Ginkgolides Contents and AFLP Ma

4、rkers WU Qi-kui，XING Shi-yan*，WANG Xuan，and SUN Li-min （College of Forestry，Shandong Agricultural University，Taian，Shandong 271018，China） Abstract：The genetic relationship of leaf-used Ginkgo biloba L. germplasms were evaluated by flavonoids and ginkgolides contents and AFLP markers. The results sho

5、wed that rich genetic diversity existed in both flavonoids and ginkgolides contents and AFLP markers. The average content of leaf extracts（Ga，Gb，Gc，Gj，Bb，Te，GF）in 68 leaf-used G. biloba L. germplasms are 0.0371%，0.0185%，0.0280%，0.0133%，0.0243%，0.1216% and 1.7103% respectively. Among the 1 408 bands

6、obtained from 8 selective primer pairs，99.28% of them were polymorphic. Neis genetic diversity was 0.1939，and Shannons index was 0.3142. The molecular genetic similarity coefficients range from 0.2924 to 0.7413，with an average of 0.4888. The results of hierarchical cluster analysis based the flavono

7、ids and ginkgolides contents of different populations and UPGMA exhibited a good consistency. By the hybrid method of flavonoids and ginkgolides contents and AFLP markers analysis，screen out the distinctive G. biloba germplasms of high-flavonoids and ginkgolides，would be valuable for germplasm manag

8、ement and * 通信作者 Author for correspondence（E-mail：xingsy） 2374 園 藝 學(xué) 報(bào) 41卷 utilization of leaf-used G. biloba L. germplasm. Key words：Ginkgo biloba；germplasm；leaf-used；flavonoids；ginkgolides；content；AFLP；genetic diversity 銀杏(ynxng)（Ginkgo biloba L.）是銀杏科單屬種植物(zhw)，是第四紀(jì)冰川之后唯一保存下來(lái)的孑遺植物。銀杏果、葉、材等用途廣泛，具有(

9、jyu)較高的經(jīng)濟(jì)效益、生態(tài)效益和社會(huì)效益（邢世巖，2013）。自1965年德國(guó)的Schwabe首次將銀杏葉提取物（Ginkgo biloba extract，EGb）引入醫(yī)學(xué)實(shí)踐后，葉用銀杏的栽培、生理活性物質(zhì)的提取和加工等一系列的研究逐步開(kāi)展，目前法國(guó)、德國(guó)、新西蘭、美國(guó)等對(duì)葉用銀杏藥物成分的研究處于領(lǐng)先水平（Dipak et al.，2014）。葉用銀杏以葉大、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)為主要選種目標(biāo)，優(yōu)先選擇葉內(nèi)有效成分含量高的種質(zhì)。中國(guó)是銀杏資源的起源、進(jìn)化及分布中心，擁有大量的銀杏資源，積極開(kāi)展葉用銀杏種質(zhì)資源研究具有重要意義（邢世巖，1997）。 近年銀杏成為藥用研究開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)植物之一，其生理活

10、性物質(zhì)的含量水平是評(píng)價(jià)銀杏藥物制劑最常用的指標(biāo)（Del Tredici，1991）。目前從銀杏葉片中分離出來(lái)的成分較為復(fù)雜，主要有黃酮類、萜內(nèi)酯類、聚戊烯醇等化合物，此外還有酚類、生物堿、有機(jī)酸、碳水化合物和礦質(zhì)元素等藥用成分（史清文 等，1995）。有關(guān)銀杏葉提取物的研究大多集中在其主要成分的生理生化水平（陳佳 等，2010；Chen et al.，2012）及藥用效果（Sandra et al.，2010；Zhou et al.，2011）方面。黃酮類和萜內(nèi)酯類化合物（銀杏苦內(nèi)酯A、銀杏苦內(nèi)酯B、銀杏苦內(nèi)酯C、銀杏苦內(nèi)酯J、白果內(nèi)酯B）是其中最主要的兩大類生理活性物質(zhì)，具有改善血液循環(huán)抑制

11、血栓形成、拮抗支氣管收縮、改善腦細(xì)胞代謝水平及清除自由基等多種作用（Wang et al.，2006a；Giedre et al.，2010）。 分子標(biāo)記技術(shù)在銀杏種質(zhì)遺傳多樣性（Tsumura & Ohaba，1997；王利 等，2009；Singh et al.，2010）、遺傳圖譜的構(gòu)建（劉叔倩 等，2001）、銀杏雌雄性別鑒定（Liao et al.，2009）、銀杏遺傳變異和特異種質(zhì)分析（Fan et al.，2004；Shen et al.，2005）等方面有較多的研究報(bào)道。AFLP標(biāo)記是目前較為常用的分子標(biāo)記方法，綜合了RFLP和RAPD技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，已用于觀賞銀杏（Wang et

12、 al.，2006b）、雄株銀杏（郭彥彥，2006）、雌株銀杏（王利 等，2008）等研究，但針對(duì)于葉用銀杏種質(zhì)資源遺傳多樣性和特異種質(zhì)分析的研究報(bào)道較少。 本研究中采用銀杏葉黃酮和萜內(nèi)酯類含量分析與AFLP遺傳多樣性分析相結(jié)合的方法，篩選出黃酮和萜內(nèi)酯類含量較高、遺傳特異性較強(qiáng)的葉用銀杏種質(zhì)，為葉用銀杏種質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)、利用及特異種質(zhì)的鑒定、保護(hù)提供理論依據(jù)。 1 材料與方法 1.1 試驗(yàn)材料 68份葉用銀杏種質(zhì)資源材料（表1）來(lái)自山東農(nóng)業(yè)大學(xué)銀杏種質(zhì)資源苗圃。于2013年4月，每份材料采集幼嫩葉片3 4片，硅膠干燥保存?zhèn)溆?，用于DNA的提取。于2013年8月，每份材料采集成熟葉片10片，用于

13、葉片黃酮和萜內(nèi)酯類含量測(cè)定。 1.2 葉片黃酮和萜內(nèi)酯類含量測(cè)定 銀杏葉片提取物中的主要測(cè)定成分包括：銀杏苦內(nèi)酯A（Ga）、銀杏苦內(nèi)酯B（Gb）、銀杏苦內(nèi)酯C（Gc）、銀杏苦內(nèi)酯J（Gj）、白果內(nèi)酯B（Bb）、銀杏萜內(nèi)酯（Te）和黃酮（GF）。 黃酮含量采用Rutin分光光度法（邢世巖 等，1998）測(cè)定。按GF（%，干樣）= Rutin（g L-1）/樣品質(zhì)量（g） 稀釋倍數(shù) 10-3 100計(jì)算。 12期 吳岐奎等：葉用銀杏種質(zhì)資源黃酮和萜內(nèi)酯類含量(hnling)及AFLP遺傳多樣性分析 2375 萜內(nèi)酯類含量采用HPLC國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)（van Beek et al.，1990）測(cè)定(cdng

14、)。色譜條件：儀器島津（Shimadzu）LC-10AD HPLC，視差折光(zhgung)檢測(cè)器（RP-HPLC RI），色譜柱C18（Shimadzu），柱箱CTO-10A，柱溫36 ，流動(dòng)相為甲醇（CH3OH）水（H2O）= 13，流速0.8 1.0 mL min-1。銀杏葉萜內(nèi)酯類組分含量及總量按下式計(jì)算：銀杏萜內(nèi)酯（%）= A酯/A標(biāo) 100/R 1.045/M。其中，R為內(nèi)酯的響應(yīng)因子（RGa = 1.12，RGb =1.16，RGc =1.26，RGj =1.21，RBb = 1.11）；M為葉片樣品質(zhì)量（mg）；A酯為萜內(nèi)酯類組分的峰面積，A標(biāo)為內(nèi)標(biāo)峰面積。 根據(jù)銀杏葉各萜內(nèi)酯

15、含量計(jì)算內(nèi)酯總量，銀杏葉內(nèi)酯總量（Te，%）= Ga（%）+ Gb（%）+ Gc（%）+ Gj（%）+ Bb（%）= Gi（%）+ Bb（%）。 表1 葉用銀杏種質(zhì)來(lái)源、代號(hào)及性別 Table 1 Plant geographical origin，coed and sexuality of leaf-used G. biloba germplasm 來(lái)源 Origin 代號(hào) Accession 性別 Sexuality 來(lái)源 Origin 代號(hào) Accession 性別 Sexuality 安徽寧國(guó)Ningguo，Anhui Y1 雌Female 山東泰安Taian，Shandong Y35

16、 雌Female Y2 雄Male Y36 雌Female Y3 雌Female Y37 雌Female 福建蘆山Lushan，F(xiàn)ujian Y4 雄Male Y38 雌Female 福建尤溪Youxi，F(xiàn)ujian Y5 雌Female Y39 雌Female 廣西桂林Guilin，Guangxi Y6 雄Male Y40 雌Female 貴州印江Yinjiang，Guizhou Y7 雄Male 山東郯城Tancheng，Shandong Y41 雄Male Y8 雌Female Y42 雄Male Y9 雌Female Y43 雄Male 湖北安陸Anlu，Hubei Y10 雄Male

17、 Y44 雄Male 湖南東安Dongan，Hunan Y11 雄Male Y45 雄Male Y12 雌Female Y46 雄Male 江蘇泰興Taixing，Jiangsu Y13 雌Female Y47 雌Female 江西信豐Xinfeng，Jiangxi Y14 雌Female Y48 雌Female 山東海陽(yáng)Haiyang，Shandong Y15 雄Male Y49 雌Female Y16 雌Female Y50 雌Female Y17 雌Female 山東棗莊Zaozhuang，Shandong Y51 雌Female Y18 雌Female 陜西延安Yanan，Shaanx

18、i Y52 雌Female 山東濟(jì)寧Jining，Shandong Y19 雌Female 陜西楊陵Yangling，Shaanxi Y53 雌Female 山東蒙陰Mengyin，Shandong Y20 雄Male 陜西長(zhǎng)安Changan，Shaanxi Y54 雄Male Y21 雌Female 陜西周至Zhouzhi，Shaanxi Y55 雄Male 山東青島Qingdao，Shandong Y22 雌Female 四川萬(wàn)源Wanyuan，Sichuan Y56 雌Female 山東日照Rizhao，Shandong Y23 雄Male Y57 雌Female Y24 雄Male 云

19、南騰沖Tengchong，Yunnan Y58 雄Male Y25 雌Female Y59 雌Female Y26 雌Female Y60 雌Female 山東榮城Rongcheng，ShandongY27 雄Male 浙江富陽(yáng)Fuyang，Zhejiang Y61 雌Female Y28 雌Female 浙江麗水Lishui，Zheijiang Y62 雄Male Y29 雌Female Y63 雄Male 山東泰安Taian，Shandong Y30 雄Male 浙江諸暨Zhuji，Zhejiang Y64 雌Female Y31 雄Male Y65 雌Female Y32 雄Male Y

20、66 雌Female Y33 雄Male Y67 雌Female Y34 雌Female Y68 雌Female 1.3 AFLP分析 用改良CTAB法（Doyle & Doule，1987）提取葉用銀杏種質(zhì)基因組總DNA，在CTAB提取緩沖液中加入巰基乙醇和PVP以除去酚和多糖物質(zhì)，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定提取的總DNA。AFLP分析參照Vos等（1995）的方法修改后進(jìn)行，用Pst+ Mse內(nèi)切酶組合對(duì)基因組DNA進(jìn)行限制性酶切，并篩選出8對(duì)多態(tài)性高且穩(wěn)定的引物組合進(jìn)行擴(kuò)增分析，擴(kuò)增產(chǎn)物采用ABI 3730XL自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行熒光檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果用GeneScan3.1軟件進(jìn)行分析，并將結(jié)果轉(zhuǎn)化為

21、0/1數(shù)據(jù)矩陣用于統(tǒng)計(jì)分析。 2376 園 藝 學(xué) 報(bào) 41卷 表2 用于AFLP分析(fnx)的接頭與引物 Table 2 Adaptors and primers used for AFLP analysis 引物Primer 序列(xli)Sequence 接頭(ji tu)引物 Adaptor Pst 5-CTC GTA GAC TGC GTA CAT GCA-3；3-CA TCT GAC GCA-5 Mse 5- GA CGA TGA GTC CTG A G -3；3-TA CTC AGG ACT CAT-5 預(yù)擴(kuò)引物 Primer for the pre-PCR amplifica

22、tion P0 5-GAC TGC GTA CAT GCA G-3 M0 5-GAT GAG TCC TGA GTA AC-3 選擇性擴(kuò)增引物 Primer for AFLP amplification P1 5-GAC TGC GTA CAT GCA GAA-3 P2 5-GAC TGC GTA CAT GCA GAC-3 P3 5-GAC TGC GTA CAT GCA GAG-3 P4 5-GAC TGC GTA CAT GCA GAT-3 P5 5-GAC TGC GTA CAT GCA GTA-3 P6 5-GAC TGC GTA CAT GCA GTC-3 P7 5-GAC TGC

23、 GTA CAT GCA GTG-3 P8 5-GAC TGC GTA CAT GCA GTT-3 M1 5-GAT GAG TCC TGA GTA ACA A-3 M2 5-GAT GAG TCC TGA GTA ACA C-3 M3 5-GAT GAG TCC TGA GTA ACA G-3 M4 5-GAT GAG TCC TGA GTA ACA T-3 M5 5-GAT GAG TCC TGA GTA ACT A-3 M6 5-GAT GAG TCC TGA GTA ACT C-3 M7 5-GAT GAG TCC TGA GTA ACT G-3 M8 5-GAT GAG TCC TG

24、A GTA ACT T-3 1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 利用Excel 2007對(duì)葉片黃酮和萜內(nèi)酯類含量進(jìn)行整理分析及相關(guān)計(jì)算，并采用SAS9.0軟件對(duì)葉用銀杏種質(zhì)資源進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析。利用Excel 2007對(duì)AFLP擴(kuò)增結(jié)果0/1數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行分析，依據(jù)每對(duì)引物擴(kuò)增出來(lái)的總條帶及多態(tài)性條帶數(shù)，計(jì)算多態(tài)帶百分率。利用POPGENE version 1.31軟件計(jì)算遺傳多樣性指標(biāo)：等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Neis基因多樣性（H）、Shannons信息指數(shù)（I）。采用NTSYSpc version2.10e軟件計(jì)算各種質(zhì)間的遺傳相似性矩陣，并進(jìn)行UPGMA聚類分析以了解葉用銀杏種質(zhì)

25、資源間的遺傳關(guān)系。 2 結(jié)果與分析 2.1 黃酮和萜內(nèi)酯類含量分析 根據(jù)色譜圖計(jì)算68份葉用銀杏的黃酮和萜內(nèi)酯類含量，圖1為Y52種質(zhì)的色譜圖。統(tǒng)計(jì)分析68份葉用銀杏種質(zhì)資源葉片銀杏的黃酮和萜內(nèi)酯類含量，記錄其最大值和最小值，并計(jì)算各種成分的平均含量（表3），68份葉用銀杏種質(zhì)中Ga平均含量為0.0371%，其中Y16含量最多（0.1348%）；Gb平均含量為0.0185%，其中Y64含量最多（0.0472%）；Gc平均含量為0.0280%，其中Y16含量最多（0.0690%）；Gj平均含量為0.0133%，其中Y64含量最多（0.0372%）；Bb平均含量為0.0243%，其中Y52含量最多

26、（0.0582%）；Te平均含量為0.1216%，其中Y64含量最多（0.2813%）；GF平均 含量為1.7103%，其中Y64含量最多（2.4779%）。雌雄銀杏之間的黃酮和萜內(nèi)酯類含量雖有所不同，但其含量差別不大，差異并不顯著。 圖1 Y52種質(zhì)的黃酮和萜內(nèi)酯類（A）和標(biāo)準(zhǔn)EGb（B）的HPLC色譜圖 Fig. 1 HPLC chromatogram of flavonoids and ginkgolides（A）and EGb（B）in the Y52 germplasm 12期 吳岐奎等：葉用銀杏種質(zhì)資源黃酮和萜內(nèi)酯類含量及AFLP遺傳(ychun)多樣性分析 2377 表3 葉用銀

27、杏(ynxng)68份種質(zhì)資源的黃酮和萜內(nèi)酯類含量 Table 3 The analysis of flavonoids and ginkgolides contents for 68 leaf-used G. biloba germplasms % 代號(hào)(diho) Code 黃酮和萜內(nèi)酯類 Flavonoids and ginkgolides 最大值 Maximum 最小值 Minimum 平均值 Average 雌株平均值 Average of female 雄株平均值 Average of maleGa 銀杏苦內(nèi)酯A Ginkgolide A 0.1348（Y16）0.0083（Y3）

28、0.0371 0.02330.0389 0.0280 0.0343 0.0127Gb 銀杏苦內(nèi)酯B Ginkgolide B 0.0472（Y64）0.0060（Y3）0.0185 0.00880.0181 0.0093 0.0190 0.0080 Gc 銀杏苦內(nèi)酯C Ginkgolide C 0.0690（Y16）0.0119（Y3）0.0280 0.01180.0284 0.0116 0.0276 0.0123Gj 銀杏苦內(nèi)酯J Ginkgolide J 0.0372（Y64）0.0028（Y46）0.0133 0.00780.0135 0.0078 0.0131 0.0078Bb 白果內(nèi)

29、酯B Bilobalide B 0.0582（Y52）0.0057（Y54）0.0243 0.01210.0248 0.0126 0.0236 0.0114Te 銀杏萜內(nèi)酯 Ginkgolides 0.2813（Y64）0.0028（Y6）0.1216 0.05020.1247 0.0569 0.1166 0.0373GF 黃酮Flavonoids 2.4779（Y64）1.2697（Y4）1.7103 0.25131.7195 0.2467 1.6954 0.2629注：括號(hào)內(nèi)為材料代號(hào)。Note：Plant coed is in bracket. 根據(jù)葉片黃酮和萜內(nèi)酯類含量對(duì)68份種質(zhì)資源

30、進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析（圖2），在歐式距離為0.9 圖2 葉用銀杏種質(zhì)資源黃酮和萜內(nèi)酯類含量系統(tǒng)聚類圖 Fig. 2 Dendrogram of leaf-used of G. biloba L. germplasms based on flavonoids and ginkgolides contents 2378 園 藝 學(xué) 報(bào) 41卷 處，將其劃分(hu fn)為6大類。第類包含(bohn)48份種質(zhì)，第類包含(bohn)12份種質(zhì)，第類包含兩份種質(zhì)，第類包含3份種質(zhì)，第類包含2份種質(zhì)，第類包含1份種質(zhì)。 2.2 遺傳多樣性分析 從64對(duì)引物中篩選出8對(duì)多態(tài)性高且表現(xiàn)穩(wěn)定的引物組合對(duì)68份葉用

31、銀杏種質(zhì)材料進(jìn)行擴(kuò)增（部分結(jié)果見(jiàn)圖3），每對(duì)引物的鑒別效率為100%。8對(duì)引物組合共擴(kuò)增出1 408條譜帶，擴(kuò)增片段大小范圍在70 500 bp之間，其中多態(tài)性條帶為1 398條，平均每對(duì)引物組合擴(kuò)增多態(tài)性條帶174條，每對(duì)引物組合多態(tài)性條帶百分率（PPB）為99.28%。8對(duì)引物組合共產(chǎn)生181條特異性條帶（包括3條缺失帶），不同引物組合產(chǎn)生的特異性條帶數(shù)量有所不同，P-GAC/M-CTC產(chǎn)生的特異性條帶最多，為30條，包括兩條特異性條帶，P-GAG/M-CTG產(chǎn)生的特異性條帶最少（11條）。不同種質(zhì)產(chǎn)生的特異性條帶也有所不同，其中Y64產(chǎn)生的特異性條帶最多（11條），Y33、Y44、Y46

32、未產(chǎn)生特異性條帶。 圖3 引物組合P-GAC/M-CTG對(duì)68份葉用銀杏種質(zhì)資源的AFLP擴(kuò)增圖譜 Fig. 3 AFLP patterns of 68 leaf-used G. biloba L. germplasms by P-GAC/M-CTG 運(yùn)用POPGENE version 1.31軟件對(duì)各位點(diǎn)觀測(cè)的Na、Ne、H、I進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，68份葉用銀杏種質(zhì)觀測(cè)等位基因數(shù)（Na）平均值為1.9928，有效等位基因數(shù)（Ne）平均值為1.1608，Neis基因多樣性（H）平均值為0.1939，Shannons信息指數(shù)（I）平均值為0.3142（表4）。由此可見(jiàn)8對(duì)引物組合在所分析的68份葉用銀

33、杏種質(zhì)材料中多態(tài)性好，表明其遺傳多樣性處于一個(gè)較高的水平。 表4 基于不同引物組合的葉用銀杏種質(zhì)遺傳多樣性水平 Table 4 Genetic diversity level of leaf-used G. biloba L. germplasm based on different primer combination 引物組合 Primer 多態(tài)性條帶 Polymorphic bands 多態(tài)帶比例/% Parentage of polymorphic band Na Ne H I P-GAA/M-CAG 160 98.77 1.9877 0.1108 1.3243 0.3598 0.19

34、54 0.1852 0.3088 0.2498 P-GAA/M-CTG 183 98.92 1.9892 0.1037 1.2912 0.3099 0.1873 0.1626 0.3062 0.2195 P-GAC/M-CAC 180 100.00 2.0000 0.0000 1.2775 0.3080 0.1791 0.1614 0.2844 0.2189 P-GAC/M-CTA 172 98.85 1.9885 0.1069 1.3122 0.3458 0.1923 0.1759 0.3095 0.2341 P-GAC/M-CTC 165 99.40 1.9940 0.0776 1.313

35、5 0.3284 0.1967 0.1714 0.6158 0.2321 P-GAC/M-CTG 188 100.00 2.0000 0.0000 1.3166 0.2908 0.2071 0.1542 0.3372 0.2067 P-GAG/M-CTG 171 99.42 1.9942 0.0762 1.2903 0.2650 0.1962 0.1431 0.3251 0.1940 P-GAT/M-CAG 179 98.90 1.9890 0.1048 1.3105 0.3061 0.1971 0.1687 0.3168 0.2300 平均Mean 174 99.28 1.9928 0.07

36、25 1.1608 0.3155 0.1939 0.1653 0.3142 0.2231 12期 吳岐奎等：葉用銀杏種質(zhì)資源黃酮和萜內(nèi)酯類含量及AFLP遺傳(ychun)多樣性分析 2379 2.3 遺傳關(guān)系(gun x)分析 不同種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)在0.2924 0.7413之間，平均0.4888，表明(biomng)各葉用銀杏種質(zhì)間遺傳變異大，遺傳關(guān)系復(fù)雜。其中Y19與Y37之間的遺傳相似系數(shù)最大（0.7413），說(shuō)明二者的親緣關(guān)系最近，遺傳差異性最??；Y55和Y63之間的遺傳相似系數(shù)最?。?.2924），說(shuō)明二者的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，遺傳差異性最大。Y39與其他葉用銀杏種質(zhì)間的平均相似系數(shù)最

37、大（0.5450）；Y36與其他葉用銀杏種質(zhì)間的平均相似系數(shù)最?。?.4133），說(shuō)明Y36與其他葉用銀杏資源相似性低，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。 基于AFLP遺傳相似系數(shù)對(duì)68份葉用銀杏種質(zhì)資源進(jìn)行UPGMA聚類分析（圖4），在相似系數(shù)0.50處可將其劃分為4大類：A大類包含24份種質(zhì)，B大類包含25份種質(zhì)，C大類包含8份種質(zhì)，D大類包含11份種質(zhì)。地理距離較近的種質(zhì)并沒(méi)有聚在一起，這說(shuō)明種質(zhì)的聚類與地理距離并沒(méi)有明確的關(guān)系。 圖4 葉用銀杏種質(zhì)資源基于AFLP的UPGMA聚類圖 Fig. 4 UPGMA dendrogram of leaf-used of G. biloba L. germplasm

38、 based on AFLP markers 2380 園 藝 學(xué) 報(bào) 41卷 2.4 黃酮和萜內(nèi)酯類含量(hnling)與UPGMA聚類的比較分析 通過(guò)對(duì)68份葉用銀杏(ynxng)種質(zhì)資源分別進(jìn)行黃酮和萜內(nèi)酯類含量聚類分析及UPGMA聚類分析，含量(hnling)聚類結(jié)果中大類與UPGMA聚類中A、B大類對(duì)應(yīng)，大類與D大類對(duì)應(yīng)，、大類與D大類對(duì)應(yīng)，結(jié)果表明兩種聚類結(jié)果具有較高的一致性。 3 討論 3.1 葉用銀杏黃酮和萜內(nèi)酯類含量分析 本研究中依據(jù)邢世巖等（2002）的葉子藥物成分檢測(cè)方法，采用高效液相色譜（HPLC），對(duì)國(guó)際通用的歐洲van Beek等（1990）測(cè)定方法進(jìn)行了修改。 6

39、8份葉用銀杏種質(zhì)資源在葉片6種成分含量上都表現(xiàn)出差異性，通過(guò)系統(tǒng)聚類分析，將其劃分為6大類。其中有10份種質(zhì)（Y16、Y17、Y33、Y40、Y45、Y46、Y52、Y53、Y62和Y64）的黃酮和萜內(nèi)酯類含量較高，達(dá)到良種選育標(biāo)準(zhǔn)（邢世巖，2013）。其中Y64的GB、GJ、Te、GF含量最高，Y16的GA、GC含量最高，Y52的BB含量最高。這10份種質(zhì)可以作為葉用銀杏生產(chǎn)的主要種植資源。其他類型的種質(zhì)資源黃酮和萜內(nèi)酯類含量普遍較低，因此在生產(chǎn)實(shí)踐中如何通過(guò)人工選擇、雜交育種或基因工程等方式培育出高黃酮和萜內(nèi)酯類的葉用銀杏新品種，有待于進(jìn)一步研究。 本研究中銀杏黃酮和萜內(nèi)酯類含量在雌雄株中

40、并沒(méi)有明顯的差異表現(xiàn)。因此，在葉用銀杏品種選擇過(guò)程中雌雄性別可不作為重點(diǎn)指標(biāo)考慮。 3.2 葉用銀杏遺傳多樣性和遺傳關(guān)系 銀杏以中國(guó)為中心，廣泛種植于世界各地，不同種植區(qū)的氣候變化和地區(qū)間較多的引種雜交使銀杏表現(xiàn)出較豐富的多樣性。Singh等（2010）采用AFLP技術(shù)對(duì)印度西南地區(qū)的20株銀杏進(jìn)行分析，其多態(tài)帶比例為80.47%，聚類關(guān)系較為復(fù)雜，地理來(lái)源與遺傳距離之間沒(méi)有確定的關(guān)系，本研究中UPGMA聚類結(jié)果與之一致，可能與銀杏在不同區(qū)間內(nèi)的廣泛引種有關(guān)。王利等（2008）研究了49個(gè)銀杏雌株種質(zhì)的遺傳關(guān)系，其AFLP多態(tài)帶比例為98.44%，各品種間的相似系數(shù)為0.39 0.83，表明它

41、們存在不同程度的遺傳差異。本研究中8對(duì)多態(tài)性較好的AFLP引物組合對(duì)68份葉用銀杏種質(zhì)資源進(jìn)行擴(kuò)增，條帶清晰，且多態(tài)性較高（99.28%）。通過(guò)對(duì)各項(xiàng)遺傳多樣性指標(biāo)（Na、Ne、H、I）表明，葉用銀杏種質(zhì)具有較強(qiáng)的遺傳多樣性，這可能與銀杏為雌雄異株的特性有關(guān)。 UPGMA聚類分析結(jié)果與銀杏黃酮和萜內(nèi)酯類含量聚類分析結(jié)果具有較高的一致性。含量聚類分析將68份種質(zhì)分為6大類，UPGMA聚類將68份種質(zhì)分為4大類，各大類黃酮和萜內(nèi)酯類含量呈遞增趨勢(shì)。因此，AFLP分子標(biāo)記可以在一定程度上反映葉用銀杏種質(zhì)資源黃酮和萜內(nèi)酯類的含量情況，在葉用銀杏種質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)、利用的過(guò)程中，應(yīng)該結(jié)合黃酮和萜內(nèi)酯類含量分

42、析和AFLP分析數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析和評(píng)價(jià)。 3.3 葉用銀杏特異種質(zhì)的篩選 王利等（2008）研究了觀賞銀杏、雌株銀杏的特異種質(zhì)。郭彥彥（2006）研究了雄株銀杏的特異種質(zhì)。本研究中通過(guò)對(duì)68份葉用銀杏種質(zhì)的黃酮和萜內(nèi)酯類含量進(jìn)行分析，其中10份種質(zhì)表現(xiàn)出一定的特殊性，黃酮和萜內(nèi)酯類含量水平較高。10份特異種質(zhì)中來(lái)源相同的Y16與Y17、Y33與Y40、Y45與Y46、Y52與Y53之間的親緣關(guān)系較近，在UPGMA聚類分析中較為聚集，其中Y17、Y40、Y46、Y52多態(tài)性較好、特異性較高。 12期 吳岐奎等：葉用銀杏種質(zhì)資源黃酮和萜內(nèi)酯類含量(hnling)及AFLP遺傳多樣性分析 2381

43、本研究首次針對(duì)(zhndu)中國(guó)主要68份葉用銀杏種質(zhì)資源，采用植物生理學(xué)及遺傳學(xué)兩方面相結(jié)合的試驗(yàn)方法進(jìn)行研究和分析(fnx)驗(yàn)證，在葉片黃酮和萜內(nèi)酯類含量及AFLP分子層面上對(duì)葉用銀杏種質(zhì)資源的分析得到統(tǒng)一。結(jié)合黃酮和萜內(nèi)酯類含量、多態(tài)性、相似性、特異位點(diǎn)、聚類結(jié)果對(duì)所試材料進(jìn)行分析，山東海陽(yáng)的Y17（內(nèi)酯T-5號(hào)）、山東泰安的Y40（內(nèi)酯T-6號(hào)）、山東郯城的Y46（黃酮F-1號(hào)）、陜西延安的Y52、浙江麗水的Y62、浙江諸暨的Y64（黃酮F-2號(hào)）在系統(tǒng)聚類分析和UPGMA聚類分析中分別屬于不同的大類，具有較強(qiáng)的代表性，是極其重要的特異種質(zhì)，應(yīng)加以保護(hù)和利用。 References C

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