醫(yī)學(xué)資料動(dòng)物細(xì)胞與組織培養(yǎng)技術(shù)

1、第三章 動(dòng)物細(xì)胞與組織培養(yǎng)技術(shù)第一節(jié) 概述 一、動(dòng)物細(xì)胞與組織培養(yǎng)的基本概念 二、動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)的特點(diǎn) 三、發(fā)展歷史 四、動(dòng)物細(xì)胞的體外培養(yǎng)一般條件(掌握） 五、體外培養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)特性(掌握） 第二節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞、組織培養(yǎng)的基本方法(掌握） 第三節(jié) 培養(yǎng)細(xì)胞的檢測(cè)和特性鑒定 (掌握）第四節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)舉例 第五節(jié) 細(xì)胞同步化（了解）第六節(jié) 組織工程、器官培養(yǎng)（定義、培養(yǎng)方法及應(yīng)用（了解） 2021/7/16 星期五1第一節(jié) 概述 一、基本概念1動(dòng)物細(xì)胞與組織培養(yǎng)(Cell and Tissue Culture) ：指從用無(wú)菌方法將動(dòng)物體內(nèi)細(xì)胞或組織取出，模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，在體外進(jìn)行培養(yǎng)

2、，使離體細(xì)胞或組織生存、生長(zhǎng)并維持結(jié)構(gòu)和功能的一門(mén)技術(shù)。 是動(dòng)物細(xì)胞工程的基礎(chǔ)。 2021/7/16 星期五22021/7/16 星期五3 分類(lèi)： 細(xì)胞培養(yǎng) 組織培養(yǎng) 器官培養(yǎng)2021/7/16 星期五42、原代培養(yǎng)(Primary Culture)：亦稱(chēng)初代培養(yǎng)，指直接從機(jī)體取出的細(xì)胞或組織進(jìn)行培養(yǎng)的過(guò)程。3繼代培養(yǎng)（ Secondary Culture ）：亦稱(chēng)傳代培養(yǎng)，從原代培養(yǎng)的細(xì)胞繼續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)稱(chēng)繼代培養(yǎng).4、細(xì)胞系(cell line)：由原代細(xì)胞培養(yǎng)后經(jīng)初步純化，獲得的以一種細(xì)胞為主、能在體外長(zhǎng)期生存的不均一的細(xì)胞群體，一般為有限細(xì)胞系。5、細(xì)胞株(cell strain)：細(xì)胞系

3、經(jīng)過(guò)克隆或其他方法而得的單一類(lèi)型的細(xì)胞群體。2021/7/16 星期五5有限細(xì)胞系(infinited cell line)：不能連續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞株。無(wú)限細(xì)胞系(finited cell line)：能夠連續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞株，也稱(chēng)無(wú)限系。無(wú)限系細(xì)胞大多已發(fā)生異倍化，具異倍體核型，有的可能已成為惡性細(xì)胞。2021/7/16 星期五6細(xì)胞株、細(xì)胞系的命名：以組織來(lái)源定名，如BHK(幼地鼠腎細(xì)胞)以人名定名，如HeLa細(xì)胞以時(shí)間地點(diǎn)來(lái)定名，如S7811細(xì)胞系以臨床疾病類(lèi)型定名，如BALL-1細(xì)胞系(來(lái)自B淋巴細(xì)胞急性白血病人白細(xì)胞)2021/7/16 星期五7用于生產(chǎn)的動(dòng)物細(xì)胞株原代細(xì)胞二倍體細(xì)胞融合細(xì)胞

4、基因工程細(xì)胞轉(zhuǎn)化細(xì)胞常用細(xì)胞株：CHO細(xì)胞、Vero細(xì)胞、BHK-21細(xì)胞、WI-38細(xì)胞2021/7/16 星期五8二、動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)特點(diǎn)動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)。更易受微生物污染 （包括細(xì)菌、真菌、病毒、支原體）， 需要防治污染問(wèn)題。對(duì)培養(yǎng)環(huán)境的適應(yīng)性差，對(duì)環(huán)境極其敏感。包括PH值、溫度、剪切力對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求高，除了氨基酸、維生素、鹽類(lèi)、葡萄糖或半乳糖外，一般還需要血清。 原代細(xì)胞一般繁殖50代左右退化死亡。總之，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)各方面的要求更高，培養(yǎng)難度更大。2021/7/16 星期五92021/7/16 星期五10平滑肌細(xì)胞神經(jīng)元細(xì)胞血紅細(xì)胞形態(tài)上表現(xiàn)為多種多樣，如圓形、橢圓形、正方形

5、、柱形、扁平形、梭形、星形和多邊形等2021/7/16 星期五11三、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的發(fā)展歷史1885年，Wilhelm Roux （勞斯，德國(guó)）最先嘗試離體培養(yǎng)雞胚神經(jīng)存活了一段時(shí)間。并且，他首次采用了“組織培養(yǎng)”一詞。 1907年，美國(guó)胚胎學(xué)家Ross Harrison （哈里森）培養(yǎng)蛙胚神經(jīng)細(xì)胞長(zhǎng)出了軸突（蓋玻片覆蓋凹窩玻璃懸滴培養(yǎng)法）。他被公認(rèn)為動(dòng)物組織培養(yǎng)的開(kāi)山鼻祖。 1912年,法國(guó)學(xué)者Alexis Carrel（卡雷爾）采用雞胚勻漿組織液與血漿混合使用，培養(yǎng)了各種動(dòng)物組織的組織塊。在技術(shù)方面，卡雷爾把無(wú)菌操作技術(shù)引入組織培養(yǎng)中。1923年，他設(shè)計(jì)了卡氏培養(yǎng)瓶。2021/7/16 星

6、期五121913年，Steinhardt建立了單蓋片懸滴培養(yǎng)法。 1925年，Maximow采用雙蓋片法。 1934年，Gey和Lewis 用旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)了許多細(xì)胞系。相繼，人們?cè)O(shè)計(jì)了多種類(lèi)型的培養(yǎng)瓶。 1948年，Sanford創(chuàng)立了單層細(xì)胞培養(yǎng)法，建立了各種細(xì)胞系。他還創(chuàng)建了單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)方法。 1951年，Pomerat設(shè)計(jì)了細(xì)胞培養(yǎng)灌流小室技術(shù)，使細(xì)胞生活在不斷更新的培養(yǎng)液環(huán)境中，便于做細(xì)胞顯微攝影和代謝等研究1951年， 厄爾 （Earle） 發(fā)明了體外培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的人工合成培養(yǎng)基。2021/7/16 星期五131952年Gey建立了第一個(gè)人體細(xì)胞系，人體宮頸癌Hela細(xì)胞系。 1960

7、年，Barski等人在兩種不同類(lèi)型的細(xì)胞混合培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)有自發(fā)的融合細(xì)胞。 1962年，岡田善雄又發(fā)現(xiàn)了已滅活的仙臺(tái)病毒可以誘發(fā)體內(nèi)艾氏腹水瘤細(xì)胞和非惡性細(xì)胞融合。且融合細(xì)胞染色體丟失，惡性特征受到抑制。2021/7/16 星期五14四、動(dòng)物細(xì)胞的體外培養(yǎng)一般條件1、恒定的溫度:37 維持培養(yǎng)細(xì)胞旺盛生長(zhǎng)，必須有恒定適宜的溫度。人體細(xì)胞培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)溫度為36.50.5，偏離這一溫度范圍，細(xì)胞的正常代謝會(huì)受到影響，甚至死亡。 培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)低溫的耐受力較對(duì)高溫強(qiáng)，溫度上升不超過(guò)39時(shí)，細(xì)胞代謝與溫度成正比；人體細(xì)胞在39-401小時(shí)，即能受到一定損傷，但仍有可能恢復(fù)；在40-411小時(shí)，細(xì)胞會(huì)普遍受到

8、損傷，僅小半數(shù)有可能恢復(fù)；41-421小時(shí)，細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p傷，大部分細(xì)胞死亡，個(gè)別細(xì)胞仍有恢復(fù)可能；當(dāng)溫度在43以上1小時(shí)，細(xì)胞全部死亡。低溫下會(huì)使細(xì)胞代謝速率降低2021/7/16 星期五152、pH：最適為7.27.4 大多數(shù)細(xì)胞的適宜pH為7.2-7.4,偏離這一范圍對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)將產(chǎn)生有害的影響.但細(xì)胞耐酸性比耐堿性大一些,在偏酸環(huán)境中更利于細(xì)胞生長(zhǎng).但有一些細(xì)胞也喜歡偏堿環(huán)境中生長(zhǎng),如成纖維細(xì)胞最適合pH是7.4-7.6，每種細(xì)胞都有其最適pH值. 當(dāng)PH低于6或高于7.6時(shí)的生長(zhǎng)會(huì)受到影響，甚至死亡。2021/7/16 星期五163、 氣體氣體：需要O2、CO2 （95%空氣、5% C

9、O2）氣體是哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生存必需條件之一,所需氣體主要有氧氣和二氧化碳.氧氣參與三羧酸循環(huán),產(chǎn)生供給細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的能量和合成細(xì)胞生長(zhǎng)所需用的各種成分.開(kāi)放培養(yǎng)時(shí)一般把細(xì)胞置于95%空氣加5%二氧化碳混合氣體環(huán)境中.二氧化碳既是細(xì)胞代謝產(chǎn)物,也是細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖所需成分,它在細(xì)胞培養(yǎng)中的主要作用在于維持培養(yǎng)基的pH值. 2021/7/16 星期五174、營(yíng)養(yǎng)：要求高，需要氨基酸、維生素、輔酶、核酸、激素、生長(zhǎng)因子等。 2021/7/16 星期五185、無(wú)菌培養(yǎng)環(huán)境無(wú)毒和無(wú)菌是保證細(xì)胞生存的首要條件。當(dāng)細(xì)胞放置于體外培養(yǎng)時(shí)，與體內(nèi)相比細(xì)胞丟失了對(duì)微生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代謝物質(zhì)積

10、累等，可導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此在進(jìn)行培養(yǎng)中，保持細(xì)胞生存環(huán)境無(wú)污染、代謝物及時(shí)清除等，是維持細(xì)胞生存的基本條件。2021/7/16 星期五19（一）培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)方式及類(lèi)型 （二）培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)特點(diǎn)（三）培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖過(guò)程五、 動(dòng)物細(xì)胞的體外培養(yǎng)生物學(xué)特性2021/7/16 星期五20貼壁依賴(lài)型細(xì)胞 非貼壁依賴(lài)型成纖維細(xì)胞上皮型細(xì)胞游走型細(xì)胞多形型細(xì)胞（一）培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)方式及類(lèi)型 于懸浮狀態(tài)下即可生長(zhǎng) 貼附于支持物表面才能生長(zhǎng)的細(xì)胞 2021/7/16 星期五211、貼壁依賴(lài)型細(xì)胞含義：一是細(xì)胞之間相互接觸，二是細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合。 單層附壁培養(yǎng)：指動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中，大多細(xì)胞必須附著在固體

11、表面生長(zhǎng)，當(dāng)細(xì)胞布滿表面后即停止生長(zhǎng)。2021/7/16 星期五22在體外按照培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)不同，主要可分為以下幾類(lèi)：成纖維細(xì)胞型、上皮型細(xì)胞、游走型細(xì)胞、多形型細(xì)胞 （1）成纖維細(xì)胞型：本型細(xì)胞的形態(tài)似在體內(nèi)生長(zhǎng)的成纖維細(xì)胞； 長(zhǎng)梭形，細(xì)胞在支持物表面呈梭形或不規(guī)則三角形生長(zhǎng)，細(xì)胞核位于中央，胞質(zhì)向外伸出2-3個(gè)長(zhǎng)短不同的突起，生長(zhǎng)時(shí)呈放射狀、漩渦狀走向，細(xì)胞間間隙較大。其生長(zhǎng)特點(diǎn)為細(xì)胞一般并不緊靠相連；中胚層細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)一般表現(xiàn)為這一形式。如人胚肺細(xì)胞。 2021/7/16 星期五23人的成纖維細(xì)胞小鼠的成纖維細(xì)胞人骨髓間充質(zhì)細(xì)胞（MSC）2021/7/16 星期五242021/7/16

12、 星期五25大鼠血管平滑肌細(xì)胞成纖維細(xì)胞型2021/7/16 星期五26成纖維型細(xì)胞在培養(yǎng)中的細(xì)胞凡形態(tài)與成纖維細(xì)胞類(lèi)似時(shí)，皆可稱(chēng)之為成纖維細(xì)胞。本型細(xì)胞由形態(tài)與體內(nèi)成纖維細(xì)胞的形態(tài)相似而得名. 除真正的成纖維細(xì)胞外，凡由中胚層間質(zhì)起源的組織細(xì)胞常呈本類(lèi)形態(tài)生長(zhǎng)。人胚肺細(xì)胞在顯微鏡下呈現(xiàn)為典型的成纖維細(xì)胞型。2021/7/16 星期五27（2）上皮型細(xì)胞此類(lèi)型細(xì)胞在培養(yǎng)器皿支持物上生長(zhǎng)具有扁平狀，不規(guī)則。細(xì)胞貼壁后呈不規(guī)則多角形，中央有扁圓形核，細(xì)胞彼此緊密相連成單層細(xì)胞，呈現(xiàn)“鋪路石狀”。生長(zhǎng)時(shí)呈膜狀移動(dòng)，處于膜邊緣的細(xì)胞總與膜相連，很少單獨(dú)行動(dòng)。內(nèi)胚層和外胚層細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)都可能呈現(xiàn)上皮型

13、。如皮膚、消化道、呼吸道、肺泡、消化腺上皮細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞等。Hela細(xì)胞呈現(xiàn)為典型的上皮細(xì)胞型。2021/7/16 星期五28單層扁平上皮細(xì)胞人口腔皮樣癌細(xì)胞人宮頸癌上皮細(xì)胞（Hela）2021/7/16 星期五29成骨肉瘤細(xì)胞(多角形)上皮細(xì)胞型2021/7/16 星期五30奶牛腎臟上皮細(xì)胞(上皮細(xì)胞型)2021/7/16 星期五31體外培養(yǎng)時(shí)所謂的上皮細(xì)胞型細(xì)胞或成纖維細(xì)胞型細(xì)胞，僅是因?yàn)槠湫螒B(tài)與體內(nèi)的上皮細(xì)胞或成纖維細(xì)胞類(lèi)似，并不能將體外培養(yǎng)的這些細(xì)胞與體內(nèi)同名的細(xì)胞完全等同；而且，這種名詞系使用于描述細(xì)胞的外形而并非說(shuō)明細(xì)胞的起源。與這兩種形態(tài)類(lèi)似的細(xì)胞，可能來(lái)自不同性質(zhì)的細(xì)胞亞類(lèi)

14、。取自不同組織的上皮細(xì)胞，其生化特征及其原來(lái)的形態(tài)要有差異，而來(lái)自不同組織的形態(tài)相似的成纖維細(xì)胞，其發(fā)展的方向可能并不相同。2021/7/16 星期五32 （3）游走型細(xì)胞：不常見(jiàn)，具有類(lèi)似巨噬細(xì)胞樣的特征。本型細(xì)胞在支持物上散在生長(zhǎng)，一般不連成片。細(xì)胞質(zhì)經(jīng)常伸出偽足或突起，呈活躍的游走或變形運(yùn)動(dòng)，速度快且不規(guī)則。此型細(xì)胞不很穩(wěn)定，有時(shí)亦難和其它型細(xì)胞區(qū)別。在一定的條件下，由于細(xì)胞密度增大聯(lián)成片后，可呈類(lèi)似多角型或成纖維細(xì)胞形態(tài)。如單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的細(xì)胞中的顆粒型白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等。2021/7/16 星期五33體外培養(yǎng)的游走型細(xì)胞具有類(lèi)似巨噬細(xì)胞樣的特征。主要是：?jiǎn)魏司奘?/p>

15、細(xì)胞系統(tǒng)的細(xì)胞，淋巴細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞。2021/7/16 星期五34單 核 巨 噬 細(xì) 胞1、游走型細(xì)胞在支持物上分散生長(zhǎng)，一般不連接成片、形成群落；2、細(xì)胞胞質(zhì)常伸出偽足和突起。3、生長(zhǎng)位置不固定，呈游走和變形運(yùn)動(dòng)，速度快、方向不規(guī)則。4、細(xì)胞內(nèi)易出現(xiàn)色暗的吞噬性顆粒。2021/7/16 星期五35單核巨噬細(xì)胞（未刺激狀態(tài)）游走細(xì)胞型2021/7/16 星期五36單核巨噬細(xì)胞（活化劑刺激6h后）：向四周伸展偽足2021/7/16 星期五37需要注意的是：在實(shí)際細(xì)胞培養(yǎng)中，可能同時(shí)存在2種及其以上細(xì)胞形態(tài)；其影響因素包括（1）不同來(lái)源細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)學(xué)表現(xiàn)不同；（2）不同培養(yǎng)條件下同一細(xì)胞表現(xiàn)不同形

16、態(tài)；如血清成分，培養(yǎng)基，溫氣環(huán)境等2021/7/16 星期五38（4）多形型細(xì)胞：形態(tài)上不規(guī)則的細(xì)胞，不常見(jiàn)，一般分胞體和胞突兩部分，胞突細(xì)長(zhǎng)形類(lèi)似絲狀偽足；胞體略呈多角形，但較規(guī)則。如神經(jīng)組織細(xì)胞如神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等。2021/7/16 星期五39神經(jīng)細(xì)胞（DAB顯色）多形型細(xì)胞神經(jīng)細(xì)胞2021/7/16 星期五40大鼠 海馬神經(jīng)細(xì)胞2021/7/16 星期五412 非貼附型細(xì)胞 懸浮型細(xì)胞：指細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)不必貼壁，可在培養(yǎng)液中懸浮生長(zhǎng)。 見(jiàn)于少數(shù)特殊的細(xì)胞，如血液白細(xì)胞、淋巴組織細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化細(xì)胞系、某些類(lèi)型的癌細(xì)胞及白血病細(xì)胞。胞體圓形，不貼于支持物上，呈懸浮生長(zhǎng)。這種細(xì)胞

17、的形態(tài)特點(diǎn)：胞體始終為球形。優(yōu)點(diǎn)：生存空間大，培養(yǎng)效率高，利于大量生產(chǎn)，與培養(yǎng)基充分接觸無(wú)需消化傳代，易于收獲細(xì)胞。缺點(diǎn)是不如貼附生長(zhǎng)型觀察方便，而且并非所有的培養(yǎng)細(xì)胞都能懸浮生長(zhǎng)。貼壁細(xì)胞經(jīng)懸浮適應(yīng)后也可以長(zhǎng)期懸浮培養(yǎng)2021/7/16 星期五42實(shí)際情況下，所培養(yǎng)的細(xì)胞并不一定呈現(xiàn)某種典型的形態(tài)，能影響細(xì)胞形態(tài)的因素很多，細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征僅是對(duì)培養(yǎng)物判斷或識(shí)別的一種參考性指標(biāo)，如果想明確某一培養(yǎng)物的確切類(lèi)型，必須借助于更為特異的鑒定方法。2021/7/16 星期五43影響細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征的因素 血清成分、培養(yǎng)基成分、添加成分、培養(yǎng)基的酸堿度、氣相環(huán)境、溫度等。 如,Hela細(xì)胞原本是一種上皮型

18、癌細(xì)胞,但在過(guò)酸或過(guò)堿的條件下培養(yǎng),可以呈現(xiàn)梭形,當(dāng)酸堿度適中時(shí)又可以恢復(fù)上皮型特征。2021/7/16 星期五44(二）培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)特點(diǎn)貼附和伸展接觸抑制密度抑制2021/7/16 星期五451貼附 貼附并伸展，是多數(shù)體外培養(yǎng)細(xì)胞的基本生長(zhǎng)特點(diǎn)。貼附底物：其他細(xì)胞、膠原、玻璃或塑料等。一類(lèi)特殊的促細(xì)胞附著的物質(zhì)（如基膜素、纖維連接素、型膠原、血清擴(kuò)展因子等）可能參加細(xì)胞的貼附過(guò)程。培養(yǎng)細(xì)胞在未貼附于底物之前一般均似球體樣；當(dāng)與底物貼附后，細(xì)胞將逐漸伸展而形成一定的形態(tài)。細(xì)胞貼附和伸展過(guò)程：2021/7/16 星期五46貼附過(guò)程：促細(xì)胞附著因子吸附于底物上 懸浮的圓形細(xì)胞與底物附著 細(xì)胞將伸

19、展成其原來(lái)的形態(tài)。2021/7/16 星期五47貼附過(guò)程 2021/7/16 星期五48影響細(xì)胞的貼附和伸展的因素：細(xì)胞因素；生物因素（如促附著因子）； 機(jī)械、物理因素（如低溫或培養(yǎng)液的流動(dòng)過(guò)快)；其它一些因素的影響（例如：離子的作用).可采取的措施：包被；減少接種時(shí)細(xì)胞懸液的量；培養(yǎng)液中離子成分及濃度培養(yǎng)液的溫度2021/7/16 星期五492接觸抑制（Contact inhibition） 細(xì)胞從接種到長(zhǎng)滿底物表面后，由于細(xì)胞繁殖數(shù)量增多相互接觸后，不再增加。一般的正常細(xì)胞并不互相重疊于其上面而生長(zhǎng)；但是，轉(zhuǎn)化細(xì)胞或癌瘤細(xì)胞則接觸抑制下降，他們互相之間可在上面或下面經(jīng)過(guò)而重疊生長(zhǎng)。 202

20、1/7/16 星期五502021/7/16 星期五512021/7/16 星期五523、密度依賴(lài)性（Density inhibition）3T3細(xì)胞系，在細(xì)胞稀少狀態(tài)下培養(yǎng)時(shí)，其生長(zhǎng)迅速；但一旦細(xì)胞生長(zhǎng)匯合成一片時(shí)（每6cm培養(yǎng)皿約106個(gè)細(xì)胞），其分裂增殖停止。其確切的細(xì)胞密度常與培養(yǎng)液中的血清濃度有關(guān)。上述這種生長(zhǎng)特性即為密度依賴(lài)性調(diào)節(jié)（或密度抑制）。轉(zhuǎn)化細(xì)胞或惡性腫瘤細(xì)胞則與正常細(xì)胞不同，他們的密度依賴(lài)性調(diào)節(jié)常常降低，因而可以生長(zhǎng)至較高的終末細(xì)胞密度。2021/7/16 星期五53（四） 體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖過(guò)程 1、單個(gè)細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程：與體內(nèi)細(xì)胞周期相似，經(jīng)歷G1、S、G2、M期。

21、細(xì)胞的分裂周期長(zhǎng) 細(xì)胞分裂時(shí)間為1248h， 細(xì)胞的分裂 周期=間期+分裂期 間期（G1+S+G2） 分裂期（M）2021/7/16 星期五542021/7/16 星期五55體外培養(yǎng)細(xì)胞壽命的過(guò)程可分為三個(gè)階段 原代培養(yǎng)期 傳代期 衰退期 2、細(xì)胞系的生長(zhǎng)過(guò)程： 2021/7/16 星期五56(1)原代培養(yǎng)（初代培養(yǎng)）為新鮮組織自體內(nèi)取出接種培養(yǎng)至第一次傳代的階段,一般持續(xù)14周。特點(diǎn)：原代細(xì)胞培養(yǎng)通常為異質(zhì)性，細(xì)胞獨(dú)立生存性差，多呈二倍體核型，更能代表其來(lái)源組織的細(xì)胞類(lèi)型及組織特異性，是檢測(cè)藥物的很好實(shí)驗(yàn)工具。2021/7/16 星期五57(2)傳代期 當(dāng)細(xì)胞持續(xù)生長(zhǎng)增殖一段時(shí)間，達(dá)到一定的

22、細(xì)胞密度后，就應(yīng)當(dāng)將細(xì)胞分離成兩部分（或更多）至新的培養(yǎng)器皿中，并補(bǔ)充更新培養(yǎng)液，此即為傳代。 特點(diǎn):在細(xì)胞整個(gè)生命期中此期的持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)， 一般情況下，可傳代1050代。 細(xì)胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型，被稱(chēng)為二倍體核型。2021/7/16 星期五58 有限細(xì)胞系和永久細(xì)胞系 動(dòng)物細(xì)胞離體培養(yǎng)起始物，我們稱(chēng)之為原代培養(yǎng)（primary culture）。經(jīng)繼代培養(yǎng)后即成為有限細(xì)胞系(finite cell line)。有限細(xì)胞系：細(xì)胞自動(dòng)物體內(nèi)取出后，在培養(yǎng)中僅持續(xù)生長(zhǎng)有限時(shí)間，然后將自行停止生長(zhǎng)。即使提供生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（包括血清），最終也會(huì)死亡。這種壽命僅能維持一段時(shí)間的細(xì)胞系，稱(chēng)為

23、有限細(xì)胞系。 大多數(shù)細(xì)胞系在有限的代數(shù)內(nèi)以不變的形式增殖，當(dāng)超過(guò)有限世代后，它們可能有兩種情況，一是衰老死亡，二是發(fā)育成永久細(xì)胞系或稱(chēng)連續(xù)細(xì)胞系。 有限細(xì)胞系轉(zhuǎn)換成永久細(xì)胞系的過(guò)度期稱(chēng)為轉(zhuǎn)換期(crisis)，其轉(zhuǎn)換過(guò)程在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中稱(chēng)為體外轉(zhuǎn)化(in vitro transformation)。 永久細(xì)胞系有如下特征：細(xì)胞形態(tài)變化，如細(xì)胞變小，黏附性減少，具有較高的核質(zhì)比；生長(zhǎng)速率增加，倍增時(shí)間縮短；對(duì)血清的依賴(lài)性減??；貼壁依賴(lài)性降低；細(xì)胞異倍體和非整倍體增加，細(xì)胞接種到體內(nèi)后，生癌率上升。2021/7/16 星期五59熒光原位雜交顯示端粒2021/7/16 星期五60結(jié)果：細(xì)胞群體中具有

24、迅速增殖能力的細(xì)胞將漸占優(yōu)勢(shì)而非增殖的或增殖緩慢的細(xì)胞將被減弱。 2021/7/16 星期五612021/7/16 星期五62(3)衰退期，此期細(xì)胞雖仍存活，但增殖基本停止，細(xì)胞形態(tài)輪廓增強(qiáng)，進(jìn)而細(xì)胞發(fā)生衰退、死亡。細(xì)胞在第二期末或第三期初階段，通過(guò)所謂“危機(jī)期”(crisis)，獲得不死性而具有持久或無(wú)限增殖的能力。失去接觸抑制。2021/7/16 星期五633、每代細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程在細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程中，繁殖到一定密度后，將之分開(kāi)而移至新的培養(yǎng)皿中稱(chēng)為接種。 細(xì)胞”一代”：僅指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)的一段時(shí)間。2021/7/16 星期五64潛伏期每代細(xì)胞的生長(zhǎng)階段：指數(shù)生長(zhǎng)期 停止期2021/7

25、/16 星期五65培養(yǎng)細(xì)胞傳代的生存期：1)潛伏期(latent phase) 2)指數(shù)生長(zhǎng)期(logarithmic growth phase)又稱(chēng)對(duì)數(shù)期-試驗(yàn)用3)平臺(tái)期又稱(chēng)生長(zhǎng)停滯期(stagnate phase)。 - -傳代2021/7/16 星期五661）潛伏期2021/7/16 星期五672）指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞增殖旺盛，成倍增長(zhǎng)，活力最佳，適用于進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。持續(xù)35天。 細(xì)胞生長(zhǎng)增殖狀況可以細(xì)胞群體倍增時(shí)間及細(xì)胞分裂指數(shù)等來(lái)判斷。在此階段，若細(xì)胞處于理想的培養(yǎng)條件，將不斷生長(zhǎng)繁殖，細(xì)胞數(shù)量日漸增加。細(xì)胞將接觸而連成一片，漸次鋪滿培養(yǎng)器皿底物，提供細(xì)胞生長(zhǎng)的區(qū)域逐漸減少甚至消失。因接

26、觸抑制而細(xì)胞運(yùn)動(dòng)停止、密度抑制而細(xì)胞終止分裂。細(xì)胞不再繁殖而進(jìn)入平臺(tái)期。2021/7/16 星期五683 平臺(tái)期又稱(chēng)生長(zhǎng)停滯期。此期細(xì)胞生長(zhǎng)的底物面積已被生長(zhǎng)的細(xì)胞所占滿，細(xì)胞量和密度達(dá)到飽和，細(xì)胞停細(xì)胞雖尚有活力但已不再分裂增殖，細(xì)胞數(shù)量持平。特點(diǎn)細(xì)胞雖已停止生長(zhǎng)，但仍存在代謝活動(dòng)并可繼續(xù)存活一定的時(shí)間。若及時(shí)分離培養(yǎng)、進(jìn)行傳代，將細(xì)胞分開(kāi)接種至新的培養(yǎng)器皿并補(bǔ)充以新鮮培養(yǎng)液，細(xì)胞將于培養(yǎng)器皿中成為下一代的細(xì)胞而再次繁殖。否則細(xì)胞因中毒而發(fā)生死亡。2021/7/16 星期五692021/7/16 星期五70第二節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞、組織培養(yǎng)的方法 一、體外培養(yǎng)的一般過(guò)程二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法 三

27、、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù) 四、動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)舉例 五、動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)現(xiàn)狀與展望2021/7/16 星期五71一、體外培養(yǎng)的一般過(guò)程體外細(xì)胞培養(yǎng)一般過(guò)程： 組織獲得 組織消化 接種培養(yǎng)傳代及細(xì)胞凍存復(fù)蘇等2021/7/16 星期五72動(dòng)物胚胎或幼齡動(dòng)物的組織、器官細(xì)胞懸液胰蛋白酶1代細(xì)胞原代培養(yǎng)50代細(xì)胞傳代培養(yǎng)無(wú)限傳代單個(gè)細(xì)胞加培養(yǎng)液動(dòng)物組織細(xì)胞間隙中含有一定量的彈性纖維等蛋白質(zhì)，將細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)起來(lái)形成具有一定彈性和韌性的組織和器官。（分解彈性纖維）2021/7/16 星期五73 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本過(guò)程2021/7/16 星期五742021/7/16 星期五75過(guò)程 組織取材 組織細(xì)胞的分離

28、培養(yǎng) 機(jī)械法 消化法 2021/7/16 星期五76機(jī)械法分離胚胎 2021/7/16 星期五77（二）、 原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)技術(shù) 1、原代培養(yǎng)分為兩種：1） 組織塊培養(yǎng)法 2） 組織消化培養(yǎng)（單層培養(yǎng)法）：適用于細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織，如胚胎、羊膜、上皮、肝腎及傳代細(xì)胞等。一般而言幼體組織比老齡組織，分化低的比分化高，腫瘤組織比正常組織易于培養(yǎng)。2021/7/16 星期五78（一）取材 2021/7/16 星期五79基本步驟：無(wú)菌取出目的組織 用利刀無(wú)菌切割成12mm小塊 以Hanks液漂洗干凈,低速離心，棄上清 移入培養(yǎng)瓶，加入適當(dāng)培養(yǎng)基浸潤(rùn) 培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)1800，置1530分，使其貼壁 培養(yǎng)

29、瓶翻回，置于37培養(yǎng)（1）組織塊培養(yǎng) 2021/7/16 星期五80組織塊培養(yǎng)法 a：取材修剪沖洗b：剪切成1mm3左右的小塊c：移入培養(yǎng)瓶d：分布組織小塊間距5mme：翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶并加培養(yǎng)液37靜止1-2hf：翻正培養(yǎng)瓶進(jìn)行培養(yǎng)g：原代細(xì)胞生長(zhǎng)2021/7/16 星期五81 取材分離和組織消化 無(wú)菌取出目的組織 用利刀無(wú)菌切割成細(xì)塊 胰蛋白酶液消化 Hanks液漂洗兩次，低速離心棄上清 吸管吹打分散細(xì)胞 移入培養(yǎng)瓶薄層培養(yǎng)(2)組織消化培養(yǎng) 加入30-50倍體積0.25%濃度胰蛋白酶溶液37消化30-60min，每5-10min搖動(dòng)一次2021/7/16 星期五82相關(guān)酶類(lèi)包括：胰蛋白酶、膠原

30、酶、鏈霉蛋白酶、黏蛋白酶、蝸牛酶等，需根據(jù)酶及組織成分的特點(diǎn)選擇使用2021/7/16 星期五83原代培養(yǎng)與檢查 接種、培養(yǎng) 常規(guī)檢查（檢查細(xì)胞形態(tài)及活力、檢查營(yíng)養(yǎng)液pH及污染）2021/7/16 星期五842、傳代培養(yǎng)技術(shù)傳代：當(dāng)原代培養(yǎng)成功后，細(xì)胞分裂增殖成片時(shí)，需要對(duì)其分離重新培養(yǎng)，這一操作過(guò)程成為傳代。第一次傳代時(shí)間：有80-90%或剛剛?cè)繀R合的細(xì)胞是傳代的理想時(shí)期。過(guò)早產(chǎn)量不足，過(guò)晚細(xì)胞狀態(tài)不佳。 2021/7/16 星期五85基本步驟： 吸出培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)舊培養(yǎng)液 加入胰蛋白酶和EDTA混和液 (以能覆蓋整個(gè)瓶底為準(zhǔn)） 吸出消化液，加入培養(yǎng)液終止消化 吸管輕輕吹打使細(xì)胞分散成懸液，計(jì)數(shù)

31、 重新接種于新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)1）貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代 培養(yǎng)2021/7/16 星期五862021/7/16 星期五872）懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代離心法傳代 直接傳代法 離心法傳代：離心（1000轉(zhuǎn)/分-800g）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。直接傳代法：懸浮細(xì)胞沉淀在瓶壁時(shí)，將上清培養(yǎng)液去除l2一23，然后用吸管直接吹打形成細(xì)胞懸液再傳代。2021/7/16 星期五88（三）細(xì)胞純化2021/7/16 星期五89（四）細(xì)胞的凍存復(fù)蘇細(xì)胞低溫冷凍貯存是細(xì)胞室的常規(guī)工作。1、凍存意義：1）長(zhǎng)期保存細(xì)胞；2）防止細(xì)胞老化；3）減少人力、經(jīng)費(fèi)，減少污染。2021/7/16 星期五902、凍存和復(fù)蘇的原則：慢

32、凍快融當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。在細(xì)胞凍存時(shí)要盡可能均勻地減少細(xì)胞內(nèi)水分，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成是減少細(xì)胞損傷的關(guān)鍵。 如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反結(jié)晶就大，大結(jié)晶會(huì)造成細(xì)胞膜、細(xì)胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過(guò)程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。2021/7/16 星期五913、保存細(xì)胞三要素：營(yíng)養(yǎng)、保護(hù)劑和低溫低溫保護(hù)劑的應(yīng)用在細(xì)胞凍存時(shí)加入保護(hù)劑，能大大提高凍存效果。常用的低溫保護(hù)劑是甘油或DMSO，滲透性保護(hù)劑，可迅速透入細(xì)胞，提高胞膜對(duì)水的通透性，降低冰點(diǎn)，延緩凍結(jié)過(guò)程，能使

33、細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷。保護(hù)劑的濃度在515%之間，常用10%。2021/7/16 星期五924、慢凍程序標(biāo)準(zhǔn)程序： 當(dāng)溫度在-25 以上時(shí)， 12 /min 當(dāng)溫度達(dá)-25 以下時(shí)， 510 /min 當(dāng)溫度達(dá)-100時(shí)，可迅速放入液氮中簡(jiǎn)易程序： 將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內(nèi)，紗布袋系以線繩，通過(guò)線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降12 的速度，在40分鐘內(nèi)降至液氮表面，停30分鐘后，直接投人液氮中。2021/7/16 星期五93細(xì)胞凍存方法1預(yù)先配制凍存液： 含20%血清培養(yǎng)基 9份 DMSO 1份2 取對(duì)數(shù)生

34、長(zhǎng)期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，加入適量?jī)龃嬉? 用吸管吹打制成細(xì)胞懸液（1106 5 106細(xì)胞/ml)3 分裝：每瓶1ml，密封后標(biāo)記冷凍細(xì)胞名稱(chēng)和冷凍日期。4、凍存1)傳統(tǒng)方法：冷存管置于410分鐘 -2030分鐘 -801618小時(shí)(或隔夜)液氮槽長(zhǎng)期儲(chǔ)存。-20不可超過(guò)1小時(shí)，以防止冰晶過(guò)大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過(guò)此步驟直接放入-80冰箱中，惟存活率稍微降低一些。 (2)程序降溫：利用已設(shè)定程序的等速降溫機(jī)以-1-3/分鐘之速度由室溫降至(-80以下)-120，再放在液氮長(zhǎng)期儲(chǔ)存。適用于懸浮型細(xì)胞與hybridoma之保存。 2021/7/16 星期五94凍存要點(diǎn)：1）慢凍2）取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)

35、期細(xì)胞進(jìn)行凍存，無(wú)微生物污染；3）細(xì)胞濃度：達(dá)到10 6/毫升 4）合適的冷凍保護(hù)劑：DMSO,常用10%。5）使用高濃度血清 2021/7/16 星期五955、細(xì)胞復(fù)蘇方法與快速融化的手段，以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時(shí)間內(nèi)融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對(duì)細(xì)胞造成損害 。程序：（l）從液氮中取出冷凍管，迅速投入3738 水浴中，使其融化（1分鐘左右）。 （2）5分鐘內(nèi)用培養(yǎng)液稀釋至原體積的10倍以上。 （3）低速離心10分鐘。 （4）去上清，加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復(fù)蘇的細(xì)胞。2021/7/16 星期五962021/7/16 星期五97二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法 懸滴培養(yǎng)法 旋轉(zhuǎn)

36、管培養(yǎng)法 灌注小室培養(yǎng)法 培養(yǎng)瓶培養(yǎng)方法 培養(yǎng)板培養(yǎng)法 克隆培養(yǎng)法2021/7/16 星期五981、懸滴培養(yǎng)法 懸滴培養(yǎng)法：又稱(chēng)植塊懸滴培養(yǎng)法，1907年，哈里森首創(chuàng)。即將組織或器官植塊接種在一張蓋玻片上，滴上一滴培養(yǎng)液，然后翻轉(zhuǎn)蓋玻片使植塊及營(yíng)養(yǎng)液懸掛于蓋玻片下，再置于一凹形載玻片上，最后用熔蠟密封后放于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。優(yōu)點(diǎn)：1）容易換片。 2）培養(yǎng)物在培養(yǎng)過(guò)程中，不需移動(dòng)位置，有利于組織分化。2021/7/16 星期五992、旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法 蓋爾（Gey，1933年）、劉易斯（Lewis，1934年）建立該方法。 特點(diǎn)：是培養(yǎng)中組織塊或細(xì)胞交替地與培養(yǎng)液和空氣直接接觸。包括旋轉(zhuǎn)管、旋轉(zhuǎn)鼓、支架

37、等。 缺點(diǎn)：不易在顯微鏡下觀察。2021/7/16 星期五1002021/7/16 星期五1013、灌注小室培養(yǎng)法 在蓋玻片懸滴法基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)，可用于連續(xù)觀察細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化，研究各種因素影響作用及活細(xì)胞反應(yīng)。1912年由Burrows首創(chuàng)。2021/7/16 星期五1024、 培養(yǎng)瓶培養(yǎng)方法 培養(yǎng)瓶培養(yǎng)方法：指將培養(yǎng)對(duì)象直接接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)。 1923年，卡雷爾（Carrel）設(shè)計(jì)了卡氏瓶。Earle設(shè)計(jì)了T-培養(yǎng)瓶。采用的材料對(duì)細(xì)胞無(wú)毒，透明。2021/7/16 星期五103懸浮細(xì)胞培養(yǎng)瓶滾動(dòng)培養(yǎng)瓶2021/7/16 星期五104蓋玻片+培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法：先以蓋玻片為生長(zhǎng)表面，將擬培養(yǎng)細(xì)胞或組

38、織接種于蓋玻片上，然后放進(jìn)培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。優(yōu)點(diǎn)：1）可以避免培養(yǎng)瓶表面粗糙等原因?qū)ε囵B(yǎng)物的影響2）可以方便顯微觀察、染色等操作，以及永久保存；3）增加了培養(yǎng)瓶培養(yǎng)面積。2021/7/16 星期五1055、 培養(yǎng)板培養(yǎng)法 培養(yǎng)板培養(yǎng)法又稱(chēng)微量培養(yǎng)法。 一般是一次性使用2021/7/16 星期五1066、克隆培養(yǎng)法就是將細(xì)胞懸液中獲得的單個(gè)細(xì)胞用于培養(yǎng)，使之重新繁殖成一個(gè)新的細(xì)胞群體的培養(yǎng)技術(shù) 2021/7/16 星期五107過(guò)程:制細(xì)胞懸液連續(xù)稀釋獲得單細(xì)胞單細(xì)胞接種培養(yǎng)細(xì)胞株 :由細(xì)胞系進(jìn)一步克隆化，而獲得的由單一細(xì)胞形成的細(xì)胞群體。 2021/7/16 星期五108動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)

39、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)是建立在貼壁培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)法基礎(chǔ)上，再融合固定化細(xì)胞、流式細(xì)胞術(shù)、填充床、生物反應(yīng)器、人工灌流技術(shù)等發(fā)展起來(lái)的。（一）培養(yǎng)方法 轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng) 反應(yīng)器貼壁培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)技術(shù) 微載體培養(yǎng)技術(shù) 多孔載體培養(yǎng) 微囊化培養(yǎng)技術(shù) 中空纖維法固定化培養(yǎng)2021/7/16 星期五1091、反應(yīng)器貼壁培養(yǎng) 此種培養(yǎng)方式中，細(xì)胞貼附于固定的表面生長(zhǎng)，不因?yàn)閿嚢瓒S培養(yǎng)液一起流動(dòng)，因此比較容易更換培養(yǎng)液，不需要特殊的分離細(xì)胞和培養(yǎng)液的設(shè)備，可以采用灌流培養(yǎng)獲得高細(xì)胞密度，能有效地獲得一種產(chǎn)品；但擴(kuò)大規(guī)模較難，不能直接監(jiān)控細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，故多用于制備用量較小、價(jià)值高的生物藥品。 2021/7/16

40、星期五1102、懸浮培養(yǎng)技術(shù)適于少數(shù)懸浮生長(zhǎng)型細(xì)胞2021/7/16 星期五1113、微載體培養(yǎng)技術(shù)1967年，Van Wezel開(kāi)發(fā)了微載體系統(tǒng)培養(yǎng)貼壁細(xì)胞，以直徑60-250um微珠作為微載體。原理：其原理是將對(duì)細(xì)胞無(wú)害的顆粒-微載體加入到培養(yǎng)容器的培養(yǎng)液中，作為載體，使細(xì)胞在微載體表面附著生長(zhǎng)，同時(shí)通過(guò)持續(xù)攪動(dòng)使微載體始終保持懸浮狀態(tài)。 理想的細(xì)胞支持物特征：生物相容性；無(wú)毒害；好的傳質(zhì)特征；機(jī)械穩(wěn)定性好；比表面大，適于細(xì)胞生長(zhǎng)；顆粒均一；能高壓滅菌；可重復(fù)利用，易清洗；接種方便；能固定大部分細(xì)胞，能保護(hù)細(xì)胞，易使細(xì)胞、載體和培養(yǎng)基分離；適合貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞培養(yǎng)。2021/7/16 星

41、期五112微載體系統(tǒng)培養(yǎng)細(xì)胞具體步驟 p110選擇合適的微載體類(lèi)型浸泡水化及消毒接種培養(yǎng)觀察和細(xì)胞計(jì)數(shù)消化分離細(xì)胞傳代培養(yǎng)交聯(lián)葡萄糖DEAE-纖維素蛋白質(zhì)：變性膠原高分子材料：硅膠、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯無(wú)機(jī)玻璃基質(zhì)常用商品化微載體有三種：Cytodex1、2、3，Cytopore和Cytoline。 2021/7/16 星期五113多孔載體培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn)：易固定化、比表面大、細(xì)胞在載體內(nèi)生長(zhǎng)，免受機(jī)械損傷；可以提高通氣量，強(qiáng)化傳質(zhì)。適用于貼壁細(xì)胞培養(yǎng)、懸浮細(xì)胞固定化連續(xù)灌流培養(yǎng)和大規(guī)模高密度培養(yǎng)系統(tǒng)。多孔載體材料要求：生物相容性、機(jī)械穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性2021/7/16 星期五1144、微囊化培養(yǎng)技術(shù)

42、 人造的半透膜制成的多孔微球體，借鑒固定化技術(shù)將細(xì)胞包裹在微囊內(nèi)。適用于單克隆抗體、干擾素等的制備。微囊直徑控制在200-400m為宜。制備中應(yīng)注意： 溫和、快速、不損傷細(xì)胞，盡量在液體和生理?xiàng)l件下操作； 所用試劑和膜材料對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害； 膜的孔徑可控制，必須使?fàn)I養(yǎng)物和代謝物自由通過(guò)； 膜應(yīng)有足夠機(jī)械強(qiáng)度抵抗培養(yǎng)中攪拌。 2021/7/16 星期五1155、中空纖維法Richard Kncazek 1972年發(fā)明。最初使用醋酸纖維素和硝酸纖維素混合組成海綿狀多孔結(jié)構(gòu)?？梢阅M細(xì)胞體內(nèi)三維狀態(tài)。目前材料有：硅膠、聚丙烯等。優(yōu)點(diǎn)是： 占地空間少； 細(xì)胞產(chǎn)量高，細(xì)胞密度可達(dá)109數(shù)量級(jí)； 生產(chǎn)成本低，

43、且細(xì)胞培養(yǎng)維持時(shí)間長(zhǎng)，適用于長(zhǎng)期分泌的細(xì)胞 2021/7/16 星期五116動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的產(chǎn)物2021/7/16 星期五117（二）動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器培養(yǎng)（） 1、生物反應(yīng)器的特點(diǎn)分析 反應(yīng)器主要結(jié)構(gòu)形式： 攪拌式 氣升式 固定床式技術(shù)要求：能提供均勻溫和的混合狀態(tài)，剪切力小，傳質(zhì)效果好；反應(yīng)器空間利用率高，選用合適載體系統(tǒng)和材料；能保證嚴(yán)格無(wú)菌；能控溫、酸堿、溶氧和CO2濃度等；能方便快捷實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)液連續(xù)添加，樣品采集和觀察。2021/7/16 星期五1182、生物反應(yīng)器應(yīng)用概況 * 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)常用的生物反應(yīng)器： 柱狀中空纖維反應(yīng)器 板框式中空纖維反應(yīng)器 中心灌流式反應(yīng)器 灌流微載體生物反應(yīng)

44、器 旋轉(zhuǎn)壁式反應(yīng)器2021/7/16 星期五1192021/7/16 星期五1202021/7/16 星期五121（三）動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)操作方式 分批式操作 流加式操作 半連續(xù)式操作 連續(xù)式操作 灌流式操作 優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，培養(yǎng)周期短，污染和細(xì)胞突變的風(fēng)險(xiǎn)小。缺點(diǎn)：費(fèi)用高，每一次收液后，都要進(jìn)行一系列新的接種放大的準(zhǔn)備工作，此期間生產(chǎn)停工。而且收液率低.優(yōu)點(diǎn)：生產(chǎn)效率高，可反復(fù)長(zhǎng)期培養(yǎng)，反復(fù)收獲產(chǎn)品。優(yōu)點(diǎn)：反應(yīng)器的培養(yǎng)狀態(tài)可以達(dá)到恒定，細(xì)胞在穩(wěn)定的狀態(tài)下生長(zhǎng)。缺點(diǎn)：開(kāi)放式操作，容易造成污染。細(xì)胞容易發(fā)生變異，且對(duì)設(shè)備等要求高。優(yōu)點(diǎn)：培養(yǎng)狀態(tài)恒定，細(xì)胞在穩(wěn)定的狀態(tài)下生長(zhǎng)。產(chǎn)量高等.2021/7

45、/16 星期五122（四）、動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng) 產(chǎn)品1、應(yīng)用 病毒疫苗：乙肝、脊椎灰質(zhì)炎和狂犬疫苗等非抗體免疫調(diào)節(jié)劑：干擾素、白細(xì)胞介質(zhì)、B細(xì)胞生長(zhǎng)因子、巨噬細(xì)胞激活因子、T細(xì)胞替代因子等多態(tài)生長(zhǎng)因子：神經(jīng)、成纖維、表皮、血清生長(zhǎng)因子等酶類(lèi)：組織血纖維酶原激活劑激素：紅細(xì)胞、促黃體生成素、促濾胞素腫瘤特異性抗原：癌胚抗原單克隆抗體病毒殺蟲(chóng)劑：桿狀病毒2021/7/16 星期五1232、關(guān)鍵技術(shù) 細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境 ：氨離子、乳酸、二氧化碳、甲基乙二醛、滲透壓、載體細(xì)胞死亡與凋亡 ：基因工程的調(diào)控培養(yǎng)基與細(xì)胞系：無(wú)血清培養(yǎng)基的研發(fā)，基因工程的應(yīng)用 過(guò)程監(jiān)控：在線氧吸收速率、葡萄糖分析，親和層

46、析與在線取樣系統(tǒng)偶聯(lián)等2021/7/16 星期五124第三節(jié) 培養(yǎng)細(xì)胞的檢測(cè)和特性鑒定 一、培養(yǎng)細(xì)胞的常規(guī)檢查 細(xì)胞接種或傳代以后，在生存期間，實(shí)驗(yàn)者每天或至多間隔1-2天，要對(duì)細(xì)胞做常規(guī)性檢查. 觀察的結(jié)果是：污染與否，細(xì)胞生長(zhǎng)和pH等情況，隨時(shí)掌握細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化，以便做換液或傳代處理，如發(fā)現(xiàn)異常情況應(yīng)及時(shí)采取措施。2021/7/16 星期五1251、細(xì)胞形態(tài) 生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，在一般顯微鏡下觀察時(shí)透明度大，輪廓不清，只有用相差顯微鏡，才能看清細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu)。細(xì)胞機(jī)能不良時(shí)，輪廓增強(qiáng)，胞質(zhì)中常出現(xiàn)空泡、脂滴和其他顆粒狀物，細(xì)胞之間空隙加大，細(xì)胞形態(tài)可變得不規(guī)則甚至失去原有特點(diǎn)，如上皮細(xì)胞變成

47、類(lèi)纖維細(xì)胞等。只有狀態(tài)良好的細(xì)胞才宜利用進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在很多情況下，細(xì)胞雖機(jī)能狀態(tài)不良，但仍可生長(zhǎng)，如支原體輕度污染時(shí)即如此。因此生長(zhǎng)與否尚不能作為判定細(xì)胞好壞的唯一標(biāo)準(zhǔn)，必須做全面分析。2021/7/16 星期五1262、細(xì)胞生長(zhǎng)情況很多情況下，開(kāi)始從組織最先“長(zhǎng)”出的為游走細(xì)胞，它們單獨(dú)活動(dòng)，形態(tài)不規(guī)則，用縮時(shí)逐格顯微電泳法可揭示出它們極活躍的變形、游走和吞噬活動(dòng)。在游走細(xì)胞之后，接著出現(xiàn)的是成纖維細(xì)胞或上皮細(xì)胞。說(shuō)細(xì)胞“生長(zhǎng)”不如說(shuō)移動(dòng)更為恰當(dāng)，因這時(shí)尚很少見(jiàn)細(xì)胞分裂，僅有細(xì)胞運(yùn)動(dòng)而已。只有當(dāng)細(xì)胞分裂出現(xiàn)后，細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，形成較大的生長(zhǎng)暈或連接成片時(shí)，才真正進(jìn)入了生長(zhǎng)狀態(tài)。2021/7/

48、16 星期五1273、培養(yǎng)液 在正常情況下，培養(yǎng)液呈桃紅色。用一般溫箱培養(yǎng)時(shí)，隨細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，CO2積累增多，在超越緩沖范圍后，營(yíng)養(yǎng)液酸化變黃，如不及時(shí)調(diào)節(jié)PH，對(duì)細(xì)胞會(huì)發(fā)生不利影響，嚴(yán)重時(shí)細(xì)胞脫落死亡。培養(yǎng)液中加Hepes或用CO2溫箱培養(yǎng)可使PH維持穩(wěn)定。用磷酸鹽緩沖系統(tǒng)時(shí)，可因瓶口漏氣，CO2溢出，也可能由于培養(yǎng)瓶和瓶塞洗刷不潔殘留堿性物，使之變堿發(fā)紅。更換營(yíng)養(yǎng)液時(shí)間，可依營(yíng)養(yǎng)物的消耗而定，細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛時(shí)天換一次，生長(zhǎng)緩慢時(shí)，天亦可。2021/7/16 星期五1284、微生物污染 在長(zhǎng)時(shí)間多量培養(yǎng)工作中，即使用品消毒操作嚴(yán)密，亦難避免偶爾發(fā)生污染。2021/7/16 星期五129污

49、染的途徑污染途徑-空氣、器材、操作、血清、組織樣品污染對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的影響及檢測(cè)體外培養(yǎng)細(xì)胞自身沒(méi)有抵抗污染的能力，而且培養(yǎng)基中加入的抗生素的抗污染能力也是有限的，因而培養(yǎng)細(xì)胞一旦發(fā)生污染多數(shù)將無(wú)法挽救。2021/7/16 星期五1301）細(xì)菌的污染及檢測(cè)多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞在遭到細(xì)菌的污染后，培養(yǎng)液短期內(nèi)顏色變黃，產(chǎn)生大量酸性物質(zhì)，出現(xiàn)明顯混濁現(xiàn)象，可見(jiàn)培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒漂浮。培養(yǎng)檢測(cè)，可以取少量培養(yǎng)液涂布在無(wú)菌瓊脂培養(yǎng)基上，過(guò)夜查看。防止，通常在嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)操作之外，培養(yǎng)基中加入青霉素、鏈霉素能夠有效的防止細(xì)菌污染。2021/7/16 星期五1312）真菌的污染檢測(cè)真菌的污染物通常是培養(yǎng)基表面漂浮

50、的白色及黃色、黑色的小點(diǎn)。在顯微鏡下可見(jiàn)絲狀細(xì)胞的交叉。防止，酒精棉球擦洗清除瓶口污染，必要時(shí)加入抗真菌劑。2021/7/16 星期五1322021/7/16 星期五1333）支原體的污染和防止 支原體是一種介于細(xì)菌和病毒之間、能獨(dú)立生活的微生物，無(wú)細(xì)胞壁，直徑最小可以達(dá)到0.2 m，在0.22m的濾膜過(guò)濾仍然有1%左右的支原體可以通過(guò)。支原體污染后的培養(yǎng)細(xì)胞中沒(méi)有明顯可見(jiàn)的特征，所以很難發(fā)現(xiàn)。2021/7/16 星期五134 相差顯微鏡檢測(cè)：將細(xì)胞接種于事先放置于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的蓋玻片上，24h后取出，用相差油鏡觀察，支原體呈暗色微小顆粒位于細(xì)胞表面和細(xì)胞之間；熒光染色法：用能與DNA特異性結(jié)合的

51、熒光染料Hoechst33258，可使支原體內(nèi)含有的DNA著色，染色后用熒光顯微鏡觀察。具體方法如下：首先將細(xì)胞接種蓋玻片上，在細(xì)胞未長(zhǎng)滿前取出玻片，用不含酚紅的Hanks液漂洗一下，用1：3醋酸甲醇固定10min，然后用生理鹽水漂洗，置于用生理鹽水配置濃度為50g/ml的Hoechst33258中染色10min。染色后用蒸餾水洗1-2min，向細(xì)胞面滴加pH5.5磷酸緩沖液數(shù)滴，然后置熒光顯微鏡下觀察。鏡下支原體為散在于細(xì)胞周?chē)蚋接诩?xì)胞膜表面的亮綠色小點(diǎn)。2021/7/16 星期五135電鏡檢查：用掃描電鏡方法簡(jiǎn)便快速，也可以利用透射電鏡。鏡下觀察支原體膜為三層結(jié)構(gòu)，其中央有電子密度大的密

52、度顆粒群或絲狀的中心束。支原體多吸附或散在于細(xì)胞表面和細(xì)胞之間。橫斷面與細(xì)胞微絨毛相似，但微絨毛電子密度比支原體小，且中央無(wú)顆粒群或中央束。支原體代謝需固醇類(lèi)物質(zhì)，部分種類(lèi)需要精氨酸、2或葡萄糖，每一種支原體都有自身特點(diǎn)。DNA分子雜交檢查或支原體培養(yǎng)等方法：檢出率高，但方法較復(fù)雜。 2021/7/16 星期五1362021/7/16 星期五1374）病毒的污染及檢測(cè)濾器對(duì)病毒沒(méi)有任何阻擋作用，通常不容易被污染，因?yàn)椴《静荒茉诩?xì)胞外復(fù)制，而且它們通常具有宿主細(xì)胞的感染限制。通常其檢測(cè)方式是抗體檢測(cè)及PCR檢測(cè)。細(xì)胞交叉污染及檢測(cè)不容易發(fā)生，常見(jiàn)的細(xì)胞形態(tài)觀察可以區(qū)分。2021/7/16 星期五

53、138污染的預(yù)防培養(yǎng)前培養(yǎng)操作時(shí)其他注意事項(xiàng)必要的細(xì)胞備份對(duì)新引進(jìn)或構(gòu)建的細(xì)胞株應(yīng)加強(qiáng)觀察，并做必要的支原體和病毒的檢查。定期消毒培養(yǎng)箱。2021/7/16 星期五1392021/7/16 星期五140二、培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)鑒定1、細(xì)胞形態(tài)觀察內(nèi)容：細(xì)胞形態(tài)、核質(zhì)比例、染色質(zhì)、核仁大小及多少、微絲微管排列狀態(tài)等方法：倒置相差顯微鏡、電鏡2021/7/16 星期五1412021/7/16 星期五1422021/7/16 星期五1432、細(xì)胞生長(zhǎng)情況細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定1）、細(xì)胞計(jì)數(shù)法血細(xì)胞計(jì)數(shù)器：人工計(jì)數(shù)細(xì)胞Counter計(jì)數(shù)儀2021/7/16 星期五1442021/7/16 星期五145用酒精沖洗

54、計(jì)數(shù)板后擦凈，將蓋片覆在計(jì)算板上，微微移向一側(cè)， 以便滴加細(xì)胞懸液. 取一吸管伸入培養(yǎng)瓶，輕輕吹打細(xì)胞懸液，混勻。從蓋片邊緣滴加細(xì)胞懸液，使其充滿計(jì)數(shù)板和蓋片間的空隙中。 注意：勿使液體漫過(guò)蓋片或出現(xiàn)氣泡。 鏡下觀察計(jì)數(shù)： 計(jì)算計(jì)數(shù)板四角大格內(nèi)的細(xì)胞數(shù)，壓線者只計(jì)算 左側(cè)和上方的,右側(cè)和下方的不計(jì)算在內(nèi)。2021/7/16 星期五146步驟取生長(zhǎng)良好接近匯合的細(xì)胞，用胰酶消化，用新培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液后計(jì)數(shù)。如是非貼壁細(xì)胞，則離心棄舊培養(yǎng)基后，換上一定量的新鮮培養(yǎng)基然后制成細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)。 根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果按每個(gè)小方瓶5104mL作傳代培養(yǎng)接種細(xì)胞，共接種21瓶細(xì)胞。24 h后開(kāi)始計(jì)數(shù)細(xì)胞，以后每

55、隔24 h計(jì)數(shù)一次，每次取3瓶細(xì)胞，分別進(jìn)行計(jì)數(shù)。計(jì)算平均值。連續(xù)計(jì)數(shù)7 d。根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，以單位細(xì)胞數(shù)(細(xì)胞數(shù)mL)為縱坐標(biāo)，以時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線。2021/7/16 星期五1472）、 四唑鹽（MTT）比色法四唑鹽（MTT）商品名為噻唑藍(lán)， 四唑鹽比色法的原理：活細(xì)胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶干水的藍(lán)紫色產(chǎn)物（formazan)，并沉淀在細(xì)胞中，而死細(xì)胞沒(méi)有這種功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細(xì)胞中藍(lán)紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比。再用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值 MTT法簡(jiǎn)單快速、準(zhǔn)確，廣泛應(yīng)用于新藥篩選、細(xì)胞毒牲試驗(yàn)、腫瘤放射敏感性實(shí)驗(yàn)等。2021/7/

56、16 星期五148操作步驟 （1）單細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板；103-104細(xì)胞/孔，每孔培養(yǎng)基總量200微升（96孔培養(yǎng)板每孔容積370微升），37、5CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時(shí)間（根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康臎Q定培養(yǎng)時(shí)間） （2）加入2毫克毫升的MTT液（50微升孔）；繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)。 （3）吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后，加入DMSO液（150微升孔），將培養(yǎng)板置于微孔板扳蕩器上振蕩10分鐘，使結(jié)晶物溶解。 （4）酶標(biāo)儀在490nm處檢測(cè)各孔OD值記錄結(jié)果，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線2021/7/16 星期五149CCK-8試劑盒 原理：Cell Counting Kit-8（CCK-8試劑盒）是檢一種基于水溶性四唑鹽的廣泛應(yīng)

57、用快速高靈敏度檢測(cè)試劑盒，為MTT法的替代方法，試劑盒中采用水溶性四唑鹽在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成橙黃色的formazan。細(xì)胞增殖越多越快，則顏色越深；細(xì)胞毒性越大，則顏色越淺。對(duì)于同樣的細(xì)胞，顏色的深淺和細(xì)胞數(shù)目呈良好線性關(guān)系。用于測(cè)細(xì)胞增殖、細(xì)胞存活和細(xì)胞毒性。2021/7/16 星期五1502、細(xì)胞分裂指數(shù)體外培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂繁殖的能力，可用分裂指數(shù)來(lái)表示。它與生長(zhǎng)曲線有一定的聯(lián)系，如隨著分裂指數(shù)的不斷提高，細(xì)胞也就進(jìn)入了指數(shù)生長(zhǎng)期。 分裂指數(shù)指細(xì)胞群體中分裂細(xì)胞所占的百分比，它是測(cè)定細(xì)胞周期的一個(gè)重要指標(biāo)，也是不同實(shí)驗(yàn)研究選擇細(xì)胞的重要依據(jù)。20

58、21/7/16 星期五151步驟 消化細(xì)胞，將細(xì)胞懸液接至內(nèi)含蓋玻片的培養(yǎng)皿中。 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)，使細(xì)胞長(zhǎng)在蓋片上。 取出蓋片，按下列順序操作： 1） PBS漂洗3分鐘甲醇：冰醋酸=3：1固定液中固定30分鐘Giemsa液染色10分鐘自來(lái)水沖洗。 2）蓋片晾干后反扣在載玻片上，鏡檢。 3） 計(jì)算: 分裂指數(shù)=分裂細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)100% 2021/7/16 星期五152細(xì)胞周期（1）放射性核素標(biāo)記自顯影用3H標(biāo)記脫氧胸腺嘧啶核苷 處理30min后，每間隔30min取材，直到48h為止，觀察和計(jì)算細(xì)胞分裂相出現(xiàn)時(shí)間、高峰和消失分裂相數(shù)，繪圖分析。（2）流式細(xì)胞儀測(cè)定法2021/7/1

59、6 星期五1534、培養(yǎng)細(xì)胞活力測(cè)定細(xì)胞活力測(cè)定是腫瘤體外研究中應(yīng)用最廣的技術(shù)手段之一。任何培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)生長(zhǎng)的細(xì)胞都由死細(xì)胞和活細(xì)胞組成，從形態(tài)上區(qū)別死、活細(xì)胞是困難的。1 、細(xì)胞克隆形成率實(shí)驗(yàn)克隆形成試驗(yàn)是測(cè)定單個(gè)細(xì)胞增殖能力的有效方法之一，其基本原理是單個(gè)細(xì)胞在體外增殖6代以上，其后代所組成的細(xì)胞群體形成肉眼可見(jiàn)的克隆?？寺⌒纬陕视脕?lái)表示細(xì)胞的增殖能力 克隆形成率克隆形成數(shù)接種細(xì)胞數(shù)，通過(guò)計(jì)數(shù)克隆形成率，可對(duì)單個(gè)細(xì)胞的增殖潛力作定量分析，了解細(xì)胞的增殖率和對(duì)生存環(huán)境的適應(yīng)性?？寺⌒纬陕矢哒咂洫?dú)立生存能力強(qiáng)。這種方法常用于抗癌藥物敏感性試驗(yàn)、腫瘤放射生物學(xué)試驗(yàn)等。常用的方法有平板克隆形成試驗(yàn)和軟

60、瓊脂克隆形成試驗(yàn)。缺點(diǎn)：操作繁瑣優(yōu)點(diǎn)：精確、可靠2021/7/16 星期五1542、臺(tái)盼藍(lán)法 活細(xì)胞不被染色，死細(xì)胞染成藍(lán)色，用活細(xì)胞占細(xì)胞中的百分比表示細(xì)胞活力 臺(tái)盼藍(lán)排斥試驗(yàn)：（1）臺(tái)盼藍(lán)濃度： 母液：4%，用雙蒸水配制；工作液：0.4%，用PBS稀釋。（2）稀釋倍數(shù)： 臺(tái)盼藍(lán)工作液：細(xì)胞懸液 = 1：9（3）結(jié)果判斷：鏡下觀察見(jiàn)死細(xì)胞被染成淡蘭色，活細(xì)胞不著色。（4）細(xì)胞活力的計(jì)算活細(xì)胞率 = 活細(xì)胞總數(shù) / （活細(xì)胞總數(shù)+死細(xì)胞總數(shù)） 100%2021/7/16 星期五1552021/7/16 星期五156（三）培養(yǎng)細(xì)胞種屬鑒定方法1、熒光抗體染色鑒別細(xì)胞的種屬 間接熒光抗體染色技術(shù)采