冷凍干燥的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)

1、For personal use only in study and research; not for commercial use第三章冷凍干燥的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)用凍干法保存菌種、菌苗、病毒等活的微生物的基本原理是將微生物（或其 宿主）及其載體中的水分先凍結(jié)成冰晶，然后在真空低溫下升華，除去其中95% 甚至99. 5%的水分，使其新陳代謝等生命活動基本停止，處于休眠狀態(tài)，儲存 中不改變原來的性狀。由于微生物，特別是單細(xì)胞微生物的體積小，結(jié)構(gòu)簡單，生物學(xué)特性比較接 近，其細(xì)胞功能和生命活動在一個細(xì)胞內(nèi)可完全體現(xiàn)，且對環(huán)境的適應(yīng)性強(qiáng)，凍 干中某些非致死性的生理損傷，可以在短期內(nèi)修復(fù)，又易于分散于懸浮

2、液中，因 此，用凍干法保存微生物被認(rèn)為是現(xiàn)今最優(yōu)良最方便的方法之一。然而，評估這些材料凍干保存的主要指標(biāo)是細(xì)菌的存活性和其特性的穩(wěn)定 性。如果凍干造成細(xì)胞活性極差或其基本特性被丟失的話，則這種細(xì)胞就無任何 儲存的價值。至于魚、肉、果蔬等食品的凍干保存，雖然不以存活為目的，但凍 干中若其細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭到破壞，復(fù)水后細(xì)胞內(nèi)汁液大量流失，產(chǎn)品失去了復(fù)原性和 原有的口感風(fēng)味，這也不是我們所希望的。因此，如何提高凍干后細(xì)胞的存活率 和結(jié)構(gòu)的完整性，保持活細(xì)胞特性的穩(wěn)定性，乃是凍干機(jī)理研究的又一重要課題。凍干對細(xì)胞造成損害是肯定的。迄今為止還沒有一種微生物細(xì)胞凍干后 100%存活的先例。許多產(chǎn)品在凍干儲存后復(fù)

3、水初期，需要一個修復(fù)過程，才能 與正常細(xì)胞一樣同步生長。這些都說明凍干對微生物細(xì)胞造成了損傷，只是損傷 程度不同而已。較輕的造成生理性損傷，經(jīng)修復(fù)還可復(fù)原。嚴(yán)重的則造成細(xì)胞生 命的死亡。本章的任務(wù)，就是介紹目前關(guān)于凍干對細(xì)胞造成損傷的一些看法。探 討如何優(yōu)化凍干條件和添加合適的保護(hù)劑，以減輕細(xì)胞損傷和死亡。第一節(jié)細(xì)胞凍結(jié)的損傷機(jī)理凍結(jié)對生物體細(xì)胞的損傷機(jī)理，雖然有過多方面的研究，也發(fā)表了為數(shù)眾多 的理論和假說，但由于生物種類的多樣性和凍結(jié)過程中細(xì)胞內(nèi)物理變化、化學(xué)變 化、生物變化的復(fù)雜性，使得迄今尚無統(tǒng)一的看法。在眾多的理論假說中，有細(xì) 胞膜溶質(zhì)損傷說、機(jī)械損傷說、兩因素假說、結(jié)構(gòu)水說、細(xì)胞器

4、損傷說、最小體 積說、溫度休克說和細(xì)胞缺氧說等。這里僅簡單介紹前面四種假說。一、細(xì)胞膜溶質(zhì)損傷說Lovelock認(rèn)為細(xì)胞的損傷是因為凍結(jié)使細(xì)胞脫水，電解質(zhì)濃度增加， 細(xì)胞長時間置于高濃度溶液中，造成細(xì)胞膜類脂蛋白復(fù)合體的破壞和膜的分 解。Levitt認(rèn)為，特殊的胞內(nèi)溶質(zhì)（結(jié)構(gòu)蛋白）的濃縮，使蛋白質(zhì)分子彼此靠 近，有利于二硫鍵將蛋白質(zhì)分子彼此連接起來，而不能恢復(fù)到原天然結(jié)構(gòu)。 這種不可逆變化，造成細(xì)胞功能的喪失和細(xì)胞死亡。Williams認(rèn)為，冷凍使?jié)B透壓增加，造成細(xì)胞收縮，使細(xì)胞膜內(nèi)表面 壓力增加。細(xì)胞膜的收縮可引起一系列的變化，包括膜相分離、膜的萎縮、 膜成分的喪失等。總之，這些理論都認(rèn)為，

5、由于細(xì)胞膜內(nèi)溶質(zhì)脫水濃縮，從而造成細(xì)胞 膜的分解和變性。二、機(jī)械損傷說這種假說認(rèn)為，冰晶在細(xì)胞內(nèi)形成，由于其體積比原來 的增大9% lo%，在細(xì)胞內(nèi)、外形成冰晶的瞬間，擠壓細(xì)胞膜的薄弱部分.使之破裂，或冰晶在細(xì)胞內(nèi)生長時晶尖穿破膜壁導(dǎo)致細(xì)胞死亡。Mackenzie和Bank認(rèn)為，胞內(nèi)冰形成并不一定會對細(xì)胞產(chǎn)生致命的損 傷，但在復(fù)溫中，胞內(nèi)冰發(fā)生再結(jié)晶，由于冰晶的生長，或在形狀、方位上發(fā) 生改變，均會刺破或擠壓細(xì)胞膜，造成細(xì)胞的損傷。三、兩因素假說1972年，Mazur將1949年以來人們經(jīng)過20多年的探索得到不同類型細(xì)胞 的冷凍速率和細(xì)胞存活率的關(guān)系整理成曲線，說明每種細(xì)胞有一個最佳的冷卻 速

6、率，如圖31所示。由此，他認(rèn)為造成冷凍損傷有兩個獨(dú)立的因素，一是過 快的冷卻形成胞內(nèi)冰，造成膜的機(jī)械損傷，且冷卻速率越快損傷也越大；二是 慢速冷卻時，胞外結(jié)冰而胞內(nèi)尚未結(jié)冰，胞內(nèi)的水分子會在水蒸氣分壓差推動 下，滲透到胞外凍結(jié)，造成胞內(nèi)外溶質(zhì)濃縮，而產(chǎn)生溶質(zhì)損傷，且冷卻速率越 慢，其損害也越大。綜合上述兩種因素的影響，得出如圖32所示的總的效果 曲線。如圖3-2所示，對于某一種細(xì)胞，存在著某個最佳的冷卻速率，對應(yīng)有 最大的存活率，過快或過慢的冷卻速率，都會導(dǎo)致細(xì)胞的損傷增大，降低存活 率。四、結(jié)構(gòu)水說結(jié)構(gòu)水說認(rèn)為，細(xì)胞冷凍致死的首要原因，是冷凍促使從細(xì)胞膜、蛋白質(zhì) 等結(jié)構(gòu)中除去極其重要的結(jié)構(gòu)水，使細(xì)胞失去功能而死 亡。僅供個人用于學(xué)習(xí)、研究；不得用于商業(yè)用途。For personal use only in study and research; not for commercial use.Nur fur den personlichen fur Studien, Forschung, zu kommerziellen Zwecken verwendet werden.Pour l etude et la recherche uniquement a des fins personnelles; pas a des fins commerciales.to 門 b ko g門只