唯尚立德TALEN靶向基因操作技術

1、TALEN靶向基因操作TALE 技術(Transcription activator - like effectors)是一種嶄新的分子生 物學工具?？茖W家發(fā)現(xiàn)，來自植物細菌Xanthomonassp.的TAL蛋白的核酸結(jié)合 域的氨基酸序列與其靶位點的核酸序列有恒定的對應關系。利用TAL的序列模塊， 可組裝成特異結(jié)合任意DNA序列的模塊化蛋白，從而達到靶向操作內(nèi)源性基因的 目的。目前TALE技術主要有兩種應用：TALEN (transcription activator-like (TAL) effector nucleases)技術 構建針對任意特定核酸靶序列的重組核酸酶，在特異的位點打斷目

2、標基因 DNA，進而在該位點進行DNA操作，如Knock-out、Knock-in或點突變。它 克服了常規(guī)的ZFN方法不能識別任意目標基因序列，以及識別序列經(jīng)常受 上下游序列影響等問題，而具有ZEN相等或更好的活性，使基因操作變得更 加簡單、方便。TALEA (transcription activator-like (TAL) effector activator)技 術，針對基因啟動子上游任意特定DNA序列構建轉(zhuǎn)錄激活因子，可提高特異 內(nèi)源基因的表達水平，而不需要購買或克隆cDNA。TALE技術已經(jīng)成功應用到了細胞、植物、酵母、斑馬魚及大、小鼠等各類研究 對象，日益成為功能強大的實驗室工具

3、。該技術無疑會為您的研究插上騰飛的翅 膀。技術特點：無基因序列、細胞、物種限制。-TAL的核酸識別單元與A、G、C、T有恒定的對應關系。實驗設計簡單準確、 實驗周期短、成本低。成功率幾乎可達100%。毒性低、脫靶情況少。TALE構建與應用：一、TALE靶點識別模塊構建TAL的核酸識別單位為重復34個恒定氨基酸序列，其中的12、13位點雙連 氨基酸與A、G、C、T有恒定的對應關系，即NG識別T，HD識別C，NI識別A， NN識別G。為獲得識別某一特定核酸序列的TALE，只須按照DNA序列將相應TAL 單元串聯(lián)克隆即可。由于物種基因組大小的不同，選擇的特異序列長度也不同， 對于哺乳類動物包括人類，

4、一般選取16-20bp的DNA序列作為識別靶點。34 aa repeats； I I I I I ； I I I ； PH- COOH HD =C.= ALTPEQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHG= G/ATAL模塊及對應堿基mG HD NiTALE識別模塊的組裝二、TALEN的基因敲除將識別特異DNA序列的TALE與內(nèi)切核酸酶FokI偶聯(lián),可構建成剪切特異DNA 序列的內(nèi)切酶TALEN。而且FokI需形成2聚體方能發(fā)揮活性，大大減少了隨意 剪切的幾率。在實際操作中，需在目標基因的編碼區(qū)或外顯子和內(nèi)顯子的交界處 選擇兩處相鄰（間隔13-22堿基）的靶序列（一般16-2

5、0個堿基）分別進行TAL 識別模塊構建。將這兩個相鄰靶點識別模塊（分別）融合克隆到FokI的N-末端， 形成真核表達載體，得到TALEN質(zhì)粒對。TAT.FN：NTS TAL序列鑰刖模塊FokI - coohLXGTGACA TTCAATTGGATCAAGCCCGG136aarm I 111111 miTGTT GGCTTTGATGCTGTT ACTGGATTC：ACTGT AACffTAACCTAGTTCfiGGCCTALEN特異識別任意選定的DNA序列并剪切DNA將TALEN質(zhì)粒對共轉(zhuǎn)入細胞中可實現(xiàn)靶基因敲除。TALEN質(zhì)粒對共轉(zhuǎn)入細胞 后，表達的融合蛋白，分別與靶位點特異結(jié)合，由于兩個TA

6、LEN融合蛋白中的 FokI臨近，形成二聚體，發(fā)揮非特異性內(nèi)切酶活性，在兩個靶位點之間剪切 DNA，形成DSB (Double-Strand Breaks)，誘發(fā)DNA損傷修復機制。細胞可以通 過NHEJ (Non-homologous End Joining)修復DNA，在此修過程中或多或少地刪 除或插入了一定數(shù)目的堿基，造成移碼，形成目標基因敲除突變體。三、TALEN的同源重組當通過TALEN產(chǎn)生DSB后，若能提供同源修復模板，細胞可通過同源重組方 式修復DNA，因此可以對內(nèi)源DNA做更精細的操作，如點突變(磷酸化位點)、 保守區(qū)域替換、N端或C端加標記(GFP、HA、Flag)等等。5成

7、色eGFP-NeoRI AAACGCTATALEN cuttingHomo logout Recombin alien一! AAACGC l=eGFP Fusion Gene通過TALEN產(chǎn)生DSB后，在外源模板存在的情況下，發(fā)生同源重組修復DNA四、TALEA的轉(zhuǎn)錄激活將識別特異DNA序列的TALE與轉(zhuǎn)錄因子激活區(qū)域VP64(VP64 Activation Domain )融合，可構建成識別啟動子上特異DNA序列的轉(zhuǎn)錄激活因子TALEA.在 實際操作中，需在目標基因的啟動子上游選取靶序列(一般12-18個堿基)，構 建TAL識別模塊。將識別模塊TALE融合克隆到VP64的N-末端，形成真核表

8、達 質(zhì)粒TALEA。將TALEN質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細胞中，表達的融合蛋白結(jié)合啟動子附近的特異 DNA序列，并通過VP64激活區(qū)域與Pol II結(jié)合，從而激活基因的轉(zhuǎn)錄，提高了 內(nèi)源目標基因的表達。VPMPol II136aaTAI kA:NLS TAL怦列詛別模煤TGTT (KK TTTGARK TCiTT ACTGiVP()4GeneTALEA轉(zhuǎn)錄激活因子TALE技術項目內(nèi)容:技術內(nèi)容說明TALEN組裝根據(jù)DNA序列組裝TALEN質(zhì)粒，用于細胞內(nèi)DNA切斷。提 供一個或多個質(zhì)粒和測序結(jié)果。TALEN組裝及活性檢測提供一個有TALEN活性的質(zhì)粒和活性檢測結(jié)果細胞系TALEN100%基因敲除通過TALEN

9、切斷和修復基因第一外顯子，提供兩個目標基因 敲除的細胞系（包括目標基因敲除后基因測序結(jié)果）。細胞系TALEN同源重組通過TALEN進行DNA切斷和同源重組，提供一個目標基因 變異的細胞系?；蜃儺惏▋?nèi)源基因點突變（磷酸化位點、 保守區(qū)域替換），N瑞或C瑞標記（GFP、HA、Flag）TALEN基因文庫提供含有70多個絡氨酸激酶的TALEN基因文庫，也可單個 基因購買。TALEA組裝根據(jù)基因啟動子DNA序列組裝TALEA，提高內(nèi)源基因的表達 水平。提供一個或多個質(zhì)粒和測序結(jié)果。TALEA組裝及活性檢測提供一個有TALEA活性的質(zhì)粒和活性檢測結(jié)果TALEA基因文庫提供含有70多個絡氨酸激酶的TALEA基因文庫，提高內(nèi)源 絡氨酸激酶表達水平。也可單個基因購買。C. elegant基因敲除或同源重組通過TALEN進行DNA切斷和修復，提供至少兩只目標基因 靶點變異的動物體。Drosophila基因敲除或同源重組通過TALEN進行DNA切斷和修復，提供至少兩只目