《菌種改造技術》word版

1、 菌種改造技術 摘要：微生物在工業(yè)上的應用日益增多，而一般從自然中得到的微生物產(chǎn)率都不高，達不到生產(chǎn)要求，而經(jīng)過改造后的菌種產(chǎn)率會大幅度提高。本文論述了誘變育種、代謝調(diào)控育種、基因重組育種等菌種改造技術。關鍵字：菌種改造；技術微生物已廣泛的應用到醫(yī)藥、衛(wèi)生、食品、釀酒等各個領域，都取得了很好的效益，而原始的微生物產(chǎn)率都不高，我們必須對其進行菌種改造，才能更好的應用于工業(yè)領域中。微生物改造的技術有很多，例如，選擇性培養(yǎng)、誘變育種、代謝調(diào)控育種和基因重組等1。這些技術的應用，促使微生物產(chǎn)率大幅度提高，微生物產(chǎn)品應用越來越廣。微生物菌種改造技術涉及微生物學、生物化學、遺傳學、分子生物學等多門學科，是

2、一個綜合性的應用技術。1.出發(fā)菌株的選擇發(fā)酵工業(yè)上選用的菌株最初都是從自然界中分離出來的，篩選出優(yōu)良的菌株是菌種改造的第一步，也是很重要的一步。菌株的自然選育包括采樣、增殖培養(yǎng)、純種分離、性能測定等2步驟。 （1）采樣 采樣地點的確定要根據(jù)篩選的目的、微生物的分布狀況以及菌種的主要特征與外界環(huán)境等，進行綜合、具體的分析來決定。如果預先不知道微生物的具體來源，一般可從土壤中分離。采樣的方法多是在選好的地點，取離地面515 cm的土壤幾十克，盛入預先消毒好的牛皮紙袋或塑料袋中，扎好，記錄采樣的時間、地點、環(huán)境狀況，以備參考。（2）增殖培養(yǎng) 收集到的樣品，如果目標菌株比較多，可直接進行分離并進行增殖

3、培養(yǎng)。而如果目標菌株比較少，則需要對其進行富集培養(yǎng)。提供有利于所需菌株生長而不利于其它菌型生長的條件，使所需菌株大量繁殖，從而有利于分離它們。例如，生產(chǎn)脂肪酶產(chǎn)生菌時，使用植物油作為唯一碳源，可以更快而準確地分離出產(chǎn)生脂肪酶的菌株。（3）純種分離 通過增殖培養(yǎng)還不能得到微生物的純種，因為生產(chǎn)菌在自然情況下通常與各種菌混雜在一起，所以有必要進行分離純化，才能獲得純種。分離純化的方法常選用菌落分離法。把菌種制備成單孢子或單細胞懸浮液，經(jīng)過適當?shù)南♂尯笤僭谄桨迳线M行劃線分離。菌種經(jīng)過多次從點到線的稀釋，最后經(jīng)培養(yǎng)得到單菌落。（4）生產(chǎn)性能的測定 純種分離后需要對菌株的生產(chǎn)性能做測定，一般使用兩步法，

4、即初篩和復篩。而作為育種的出發(fā)菌株，這種直接從自然界分離得到的菌株成為野生菌株以區(qū)別于人工育種得到的變異菌株。經(jīng)過以上四步培養(yǎng)出的菌株即為出發(fā)菌株，出發(fā)菌株的優(yōu)劣對于菌種改造有著重要的影響，所以在增殖培養(yǎng)和純種分離是培養(yǎng)基的選擇很重要。我們需要在實驗前對目標菌種有充分的了解，根據(jù)其特性配制培養(yǎng)基使之更好的和其他菌株分離。2.誘變育種 （工業(yè)菌種基因超級誘變技術的開發(fā)與應用研究）二戰(zhàn)期間，由于青霉素高產(chǎn)菌株的急需，人們進行了最早的通過誘變技術篩選性能改進菌種的工作。突變泛指微生物細胞內(nèi)遺傳物質(zhì)的結(jié)構或數(shù)量突然發(fā)生的可遺傳的變化，突變往往導致產(chǎn)生新的等位基因及新的表現(xiàn)型。然而自然條件下基因突變的概

5、率非常低，所以我們采取人工誘變的方式使微生物發(fā)生可遺傳的變異，然后通過選擇作用保留下對我們有益的菌株，完成誘變育種。2.1誘變劑的類型（1）物理因素 物理因素有很多包括紫外線、X射線、射線、射線、射線以及快中子和超聲波等。由于紫外線應用最為廣泛,效果好，操作方便，我們在此對紫外線誘變做以詳細介紹。一般誘變用15W低功率的紫外燈，這時燈光集中于2537A1，是較有效的誘變作用光譜。具體操作方法：在暗室中安裝具有穩(wěn)壓裝置的15W紫外線燈管，將5mL菌懸液注入直徑9cm的培養(yǎng)皿中，放置在離燈管30cm左右的位置，培養(yǎng)皿底要放平，處理前贏先開燈20-30min，預熱穩(wěn)定。照射時啟動電磁攪拌裝置，以保證

6、照射均勻。一般微生物營養(yǎng)細胞在上述條件下幾十秒鐘即可死亡，因此要選用適當劑量照射。還應當注意的是，為了避免光復活作用，誘變后應再紅光下操作，處理后的菌懸液若需進行增殖培養(yǎng)，也要用黑布包起來。（2）化學誘變劑化學誘變劑用量少、設備簡單，所以今年來發(fā)展較快。但是一般的化學誘變劑都有毒且多為致癌物，所以在使用時應當格外小心謹慎。同一誘變劑對不同微生物或同一微生物不同條件下處理作用效果也不同，因此在設計實驗時應認真考慮。我們根據(jù)化學因素的作用方式，可以把它分為堿基類似物、引起DNA和核苷酸組成成分變化的化合物和改變DNA結(jié)構的化合物三種。堿基類似物的作用原理是堿基類似物能夠代替DNA結(jié)構中的四種堿基進

7、入到DNA中去，而又不妨礙DNA的復制，由于他們的化學結(jié)構改變了，就有可能引起變異。常用于誘變的堿基類似物有：5-溴尿嘧啶、5-溴脫氧尿核苷、2-氨基嘌呤等。引起DNA和核苷酸組成成分變化的化合物主要是指烷化劑和亞硝酸類物質(zhì)。烷化劑類的誘變劑帶有一個或多個活性烷基，此烷基能轉(zhuǎn)移到其他分子中電子密度高的位置上去，所有這些物質(zhì)通過烷化磷酸基、嘌呤和嘧啶與DNA作用。改變DNA結(jié)構的化合物能同DNA或RNA作用改變其化學結(jié)構，但又不形成共價鍵，引起突變。（3）其他因素誘變因素除物理因素化學因素外，還有抗生素、殺菌劑、脫氧核糖核酸和增變因子等，其中以抗生素應用最廣。2.2誘變育種的步驟和方法誘變育種的

8、一般方法3，如圖所示：從圖中可以看出，誘變育種的一般過程與上述出發(fā)菌株的選擇步驟基本一致，只是加入了誘變處理的操作。由于各種誘變劑都有其作用的特殊性，但是目前對絕大多數(shù)微生物表現(xiàn)各種性狀的相應基因了解還很不夠，所以要求通過選用誘變劑來達到某一性狀的改變，還遠遠做不到。誘變劑的選擇只能靠實際的工作經(jīng)驗。誘變處理的方法有單一誘變劑處理、紫外線和光照復活交替處理和復合處理。紫外線照射和光照復活交替的處理方法能夠大大提高突變的概率；兩種誘變劑復合處理的作用效果也要明顯優(yōu)于單一誘變劑處理。3.代謝調(diào)控育種代謝反應的協(xié)調(diào)對生命過程是絕對必需的，這種機制是的微生物對培養(yǎng)條件具有很強的適應性。典型的細菌細胞整

9、個遺傳過程要形成1000多種酶。細胞的協(xié)調(diào)功能確保在任何特定的時刻只形成特定的酶。協(xié)調(diào)功能控制酶的合成量，一旦酶合成，其活性又受到激活因子和抑制因子的調(diào)節(jié)。因此盡管遺傳基因不變，微生物根據(jù)環(huán)境變化有改變自身組成和代謝的驚人能力。環(huán)境雖不能改變其基因型但卻影響著他的表現(xiàn)型。其調(diào)節(jié)機制主要是控制微生物產(chǎn)物的生產(chǎn)彈性和防止產(chǎn)生過量的中間產(chǎn)物。代謝的調(diào)控類型主要有誘導、碳分解代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)、氮分解代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)、磷硫的調(diào)節(jié)、反饋調(diào)節(jié)。3.1代謝的產(chǎn)物調(diào)節(jié)代謝產(chǎn)物的調(diào)節(jié)主要包括初級代謝產(chǎn)物的調(diào)節(jié)和次級代謝產(chǎn)物的調(diào)節(jié)。初級代謝產(chǎn)生細胞中的小分子，這些小分子是合成生物大分子的材料或輔酶。為了控制支路的反饋調(diào)節(jié)就

10、要采取兩種操作：降低抑制型或阻遏型終產(chǎn)物的濃度。初級代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)的方式主要有：（1）降低產(chǎn)物的濃度 在一些較為簡單的代謝途徑中用這種辦法能積累中間產(chǎn)物。在一條從A到E的代謝途徑中，如果要積累化合物C，首先要獲得缺失酶C的營養(yǎng)缺陷型突變菌株，這樣的突變株需要E存在才能生長，添加低濃度的E使得生物體不能積累到有抑制或遏制水平的E。這樣C就會積累。（2）反饋抗性突變 用所需化合物的毒性類似物容易分離出某個酶反饋一直抗性或酶合成系統(tǒng)反饋阻遏突變株。講培養(yǎng)物涂布到含有這種抗代謝物的平皿上能殺死大多數(shù)細胞從而篩到抗性突變株，其中有些可能過量代謝。次級代謝產(chǎn)物是由很少的一些微生物產(chǎn)生的，盡管他們對于某些特殊

11、的微生物很重要，但在生命過程中沒有普遍性的功能，他們通常是相關化合物的混合物。次級代謝調(diào)節(jié)的方式主要有：（1）酶的去阻遏 次級代謝物產(chǎn)生的一個特點為次級代謝物在分批培養(yǎng)的菌體快速生長階段通常不產(chǎn)生而在后期形成。在恒化器的稀釋率無限降低的過程中，酶的專一活力到達一個峰值后開始降低。限量添加不同的營養(yǎng)物酶活在不同的生長速率下達到峰值。（2）反饋調(diào)節(jié) 次級代謝物的積累能反饋調(diào)節(jié)他們自身合成過程，初級代謝終產(chǎn)物反饋調(diào)節(jié)初始代謝共同的酶。（3）碳源分解代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié) 在碳源代謝代謝阻遏機理被普遍認識之前，抗生素發(fā)酵生產(chǎn)中也發(fā)現(xiàn)了碳源分解代謝阻遏。在青霉素生產(chǎn)發(fā)現(xiàn)早期就發(fā)現(xiàn)能被快速利用的葡萄糖是生產(chǎn)青霉素的

12、最差碳源，乳糖雖然僅能唄緩慢用于生長，卻有利于青霉素的形成。經(jīng)典的化學培養(yǎng)基含有葡萄糖和乳糖，在這樣的培養(yǎng)基中產(chǎn)黃青酶在生長期時快速利用葡萄糖，當葡萄糖耗盡后，乳糖利用的阻遏去除了，生長期開始緩慢利用乳糖，抗生素便能夠大量合成。此外還有調(diào)節(jié)氮源，調(diào)節(jié)磷以及對微生物進行誘導等方法。3.2營養(yǎng)缺陷型的篩選營養(yǎng)缺陷型是指喪失了合成某種營養(yǎng)物質(zhì)的能力，在培養(yǎng)基中若不外加這種營養(yǎng)成分就不能正常生長。篩選出營養(yǎng)缺陷型的方法，一般是經(jīng)誘變后經(jīng)過中間培養(yǎng)淘汰野生型，檢出營養(yǎng)缺陷型和確定生長譜等。在實際應用中，可根據(jù)需要靈活運用。（1）中間培養(yǎng) 由于發(fā)生突變后，變異的細胞需要培養(yǎng)一代至幾代才能夠完全分離，為了減

13、少以后篩選中再產(chǎn)生這種分離的混種現(xiàn)象，所以在缺陷型首次分離前，先進行中間培養(yǎng)是必要的。中間培養(yǎng)基可以是完全培養(yǎng)基或者補充培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜即可。 （2）淘汰野生型 淘汰野生型祈禱濃縮缺陷型的作用，主要方法有抗生素法和過濾法?？股刂饕怯们嗝顾?，將中間培養(yǎng)后的菌種在基本培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，野生型可大量生長，而突變型由于營養(yǎng)缺陷生長受到抑制，這時用青霉素處理，殺死正在分裂繁殖的野生型，而保留了突變型。用離心法可將未被破壞的細胞分離出來。過濾濃縮法應用于霉菌和鏈球菌。在基本培養(yǎng)基上涂布孢子，野生型可以快速生長，而缺陷型不能生長，用過濾法可將未生長的缺陷型孢子分離出來。（3）營養(yǎng)缺陷型的檢出 檢出方法很

14、多，包括逐個測定法、夾層檢出法、限量補充培養(yǎng)基檢出法、影印培養(yǎng)法等。（4）確定生長譜 經(jīng)過檢出后，需要測定是什么缺陷型。將生長斜面用無菌水洗下或培養(yǎng)液離心，沉淀物用生理鹽水洗滌后制成細胞懸浮液。去0.1mL涂布在MM上，也可以與已融化并冷卻到50的MM混勻，倒入平皿中。然后在含菌體平皿上放置少量試驗物質(zhì)，觀察生長情況，確定缺陷型的類別。4.基因重組育種基因重組廣義而言是指基因型不同的個體交配產(chǎn)生不同于親本基因型的個體，這表明進行了遺傳信息的重組。微生物的基因重組可以這樣來分類：通過雙親細胞的融合，涉及整套染色體基因的重組；通過雙親細胞的溝通。涉及部分染色體基因的重組；雙親細胞不接觸，但涉及個別

15、或少數(shù)基因的重組，如轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導。4.1雜交育種的方法以酵母菌的雜交為例，步驟包括酵母子囊孢子的形成，子囊孢子的分離和酵母雜種的獲得。（1）子囊孢子的形成 產(chǎn)包子酵母在長期的實驗室條件下培養(yǎng)會引起省包子能力衰退，要形成子囊孢子就需要用生孢子培養(yǎng)基。應為往往在饑餓條件下才會減數(shù)分離形成孢子，所以生孢子培養(yǎng)基通常營養(yǎng)是比較缺乏的。（2）子囊孢子的獲得 用幾毫升蒸餾水洗下斜面或平皿上的子囊，加入1mL液體石蠟和5g硅藻土，在勻漿皿中研磨10分鐘，然后在離心機中4500r/min離心10分鐘，子囊孢子集中在最上一層石蠟中。（3）取集中子囊孢子的液蠟0.05mL，加入0.05mL15%的明膠，涂CM板，就

16、可獲得單倍體菌落。如果要進行雜交可用顯微操作器將子囊孢子配對，進行微滴培養(yǎng)，使之發(fā)芽結(jié)合形成合子。4.2轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)導轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)導也是通過遺傳物質(zhì)間的重組而達到育種目的的方法，但他們不是通過兩親株直接接觸，而是通過其他手段達到重組目的的一些方法。轉(zhuǎn)化育種是把對遺傳起決定作用的DNA從甲菌中拿出來又放到乙菌中去，甲菌的部分遺傳性狀轉(zhuǎn)移到乙菌中。其步驟包括DNA的提取，轉(zhuǎn)化操作及轉(zhuǎn)化體的檢出。轉(zhuǎn)導是噬菌體做媒介，將一個細胞的遺傳物質(zhì)傳遞給另一個細胞的過程。與轉(zhuǎn)化一樣，無需細菌細胞直接接觸。轉(zhuǎn)化中突出的問題是供體DNA易為受體DNA酶所破壞，難以進入，但轉(zhuǎn)導是借助噬菌體將DNA帶入感染記住，使之改變特性。

17、所以轉(zhuǎn)導的關鍵是選擇合適的噬菌體。4.3原生質(zhì)體的融合原生質(zhì)體育種技術主要有原生質(zhì)體融合、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，原生質(zhì)體技術育種是在經(jīng)典基因重組基礎上發(fā)展的一種新的更為有效的方法。原生質(zhì)體融合育種雜交率高、瘦結(jié)合型或致育型的限制較小、遺傳物質(zhì)傳遞更為完整等優(yōu)點。原生質(zhì)體融合的步驟：（1）標記菌株的篩選和穩(wěn)定性驗證；（2）原生質(zhì)體制備；（3）等量原生質(zhì)體加聚乙二醇促進融合；（4）涂布與再生培養(yǎng)基，再生出菌落；（5）選擇性培養(yǎng)基上劃線生長，分離驗證，跳去融合子進一步試驗、保藏；（6）生產(chǎn)性能篩選。5.基因工程育種基因工程又稱重組DNA技術，是指講一種或多種生物的基因與載體在體外進行拼接重組，然后轉(zhuǎn)入另一種生物，是受體按人們的愿望表現(xiàn)出新的性狀。基因工程最典型的操作一般包括三個步驟：外源DNA的獲得與酶切、外源DNA與經(jīng)同樣酶切的載體的連接、連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化受體細胞級陽性轉(zhuǎn)化子的篩選。主要材料有外源DNA、載體、DNA體外重組用的酶及宿主細胞。江南大學王正祥等人利用DNA重組技術或得了一種高發(fā)酵產(chǎn)率的酒精酵母4。其主要思想是將酸性蛋白酶基因通過酵母的整合型表達載體轉(zhuǎn)化到工業(yè)酒精酵母中，酸性蛋白酶的表達可以水解原料中的蛋白質(zhì)，增加醪液中酵母可吸收性氮，促進酵母的增殖。應用這種重組酵母可提高酒精發(fā)酵速率，發(fā)酵周期縮短38%，而且并減少底物流失和能耗，提高原料出酒率，相對出酒率提高