(完整版)3_環(huán)境污染的微生物檢測課件

1、Environmental Microbiology鄭州大學生物工程系 席 宇環(huán)境微生物學第十章 環(huán)境污染的微生物檢測主 要 內(nèi) 容 環(huán)境污染的指示微生物 污染物生物毒性的微生物學檢測方法污染物致突變的微生物學檢測方法微生物的存在離不開環(huán)境，而微生物的數(shù)量分布和種群組成、理化性狀、遺傳變異等，又是環(huán)境狀況的綜合而客觀的反映。因此利用微生物我們可以指示環(huán)境狀況，監(jiān)測環(huán)境污染,評價污染物毒性。第一節(jié) 環(huán)境污染的指示微生物指示微生物（indicator microorganism）:也稱為指示菌（indicator bacteria）是指在常規(guī)的環(huán)境監(jiān)測中，用于指示環(huán)境樣品污染程度，并評價環(huán)境污染狀

2、況的具有代表性的微生物。一、一般污染指示微生物1.細菌總數(shù)（total bacteria count）:指環(huán)境中被測樣品，在一定條件下培養(yǎng)后所得的1ml或者1g檢樣中所含的細菌菌落總數(shù)。細菌總數(shù)主要反映環(huán)境中異養(yǎng)型細菌的的污染度，也間接反映一般營養(yǎng)性有機物的污染程度微生物總數(shù)的表示方法：細菌總數(shù)一般采用：個/ml、cfu/ml 或cfu/g來表示。cfu(colony forming unit)是指單位體積、單位表面積或單位質(zhì)量檢樣中菌落形成單位。pfu(plaque formation unit ):空斑形成單位，用于病毒、蛭弧菌的效價測定。2.霉菌和酵母菌總數(shù)(fungi and yeas

3、t count)指環(huán)境中被測樣品經(jīng)過處理，在一定條件下培養(yǎng)后所得的1ml或者1g檢樣中所含的霉菌和酵母菌菌落總數(shù)。檢測霉菌和酵母菌，是從另一生物學層次，反映環(huán)境的一般污染。我國在食品、藥品和化妝品都規(guī)定了檢出標準(p387)二、糞便污染指示菌1.總大腸菌群（total coliform）也稱為大腸菌群(coliform 或者 coliform group)。大腸菌群是一群需氧和兼性厭氧的，能在37培養(yǎng)24h內(nèi)使乳糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭氏陰性無芽胞桿菌，包括埃希氏菌屬、檸檬酸桿菌屬、腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬等。2.糞大腸菌群（fecal coliform）指能夠在44.5 (44-45)發(fā)酵乳糖的大

4、腸菌群，亦稱耐熱性大腸菌群(thermotolerant coliform)。糞大腸桿菌也包括同樣的4個屬，但以埃希氏菌屬為主。糞大腸菌群與糞便中大腸桿菌數(shù)目直接相關(guān)，在外界環(huán)境中不易繁殖，作為糞便污染指示菌意義更大Coliforms are several different types of bacteria that exist in the intestines of warm blooded animals and are found in bodily waste, animal droppings, and naturally in soil.Coliform bacteria

5、are described and grouped, based on their common origin or characteristics, as either total or fecal coliforms.The group of total coliforms includes faecal coliform bacteria, such as Escherichia coli (E.coli), as well as other types of coliform bacteria that can survive in soil and vegetation.Total

6、coliforms do not necessarily indicate recent water contamination by faecal waste, however the presence or absence of these bacteria in treated water is often used to determine whether water disinfection is working properly.我國目前水質(zhì)標準中規(guī)定的大腸菌群數(shù)（cfu/L）：飲用水3 游泳池水 100地表水 第一級500 第二級10000 第三級50000* * *第二節(jié) 污染

7、物生物毒性的微生物學檢測方法一、生態(tài)毒理學的基本概念1.毒性的概念與檢測毒性（toxicity）:指外源化合物與肌體接觸或進入體內(nèi)的易感部位后，能引起損害作用的相對能力，毒性越強的物質(zhì)造成損害所需的劑量和濃度越低。毒性的檢測一般有動物試驗和微生物試驗當我們以微生物為檢測手段時多稱為生物毒性（biotoxicity）微生物檢測方法的原理是選擇微生物的某一項或幾項生理指標作為指征，根據(jù)待測物質(zhì)影響或者抑制這些指征的程度來判斷毒性的強度。2.毒性試驗的常用參數(shù)致死劑量或致死濃度：Lethal Dose，LD或者 Lethal Concentration，LC.絕對致死劑量：Absolute Leth

8、al Dose ,LD100半數(shù)致死劑量：Median Lethal Dose ,LD50最小致死劑量：Minimum Lethal Dose ,MLD最大耐受劑量：Maximum Lethal Dose ,LD0半數(shù)效應(yīng)濃度（Median Effect Concentration,EC50）能夠影響微生物某種正常生理指標值50%所需的待測物質(zhì)濃度,有時候也指能夠引起50%的受試生物的某種效應(yīng)變化的濃度.半數(shù)抑制濃度（Median Inhibition Concentration,IC50）能夠引起受試生物的的某種效應(yīng)50%抑制的濃度。二、原核微生物檢測方法生物發(fā)光是某些生物的一種生理現(xiàn)象，海

9、洋生物中更為多見。（一）發(fā)光細菌-生物發(fā)光抑制試驗上世紀70年代至80年代初，國外科學家首次從海魚體表分離和篩選出對人體無害，對環(huán)境敏感的發(fā)光細菌，用于檢測水體生物毒性，現(xiàn)已成為一種簡單、快速的生物毒性檢測手段。美國Microbics公司設(shè)計制造了一套微毒測定儀器。中國科學院南京土壤研究所成功地研制DXY-2型的生物發(fā)光光度計。華東師范大學生物系也分別成功地研制了9N-1型的生物毒性測試儀。美國的Beckman公司研制出系列的細菌發(fā)光檢測儀，將毒性的測定過程標準化，命名為Microtox1.發(fā)光細菌(luminous bacteria)主要從海洋中分離的一類能夠產(chǎn)生生物發(fā)光的細菌，目前發(fā)現(xiàn)的主

10、要有弧菌屬、發(fā)光桿菌屬，異短桿菌屬。發(fā)光細菌均為革藍氏陰性、兼性厭氧菌2.試驗原理發(fā)光菌檢測法是以一種非致病的明亮發(fā)光桿菌作指示生物，以其發(fā)光強度的變化為指標，測定環(huán)境中有害有毒物質(zhì)的生物毒性的一種方法。細菌發(fā)光的生物學機制為：生物發(fā)光是發(fā)光細菌生理狀態(tài)的一個反映，在生長的對數(shù)期發(fā)光能力最強。當環(huán)境條件不良或者有毒物質(zhì)存在時，因為細菌的熒光素酶活性或細胞呼吸受到抑制，發(fā)光的能力受到影響而減弱，其減弱程度與毒性的大小和濃度成一定的比例關(guān)系。3.測試方法菌種復(fù)蘇樣品處理毒性測定向測試管中定量加入菌液和樣品，以苯酚作為陽性有機毒物對照，Zn2+作為陽性無機毒物對照，蒸餾水為陰性對照。15 下培養(yǎng)5m

11、in或者15min，就可以生物發(fā)光光度計直接讀出或者掃描出5min或者15min的光量抑制百分率(Inhibition rate,IR)IR=陰性對照組指標值-實驗組指標值陰性對照組指標值100%IR為50%時樣品的劑量即為IC50Microtox Toxicity TestingMicrotox is a standardized toxicity test system which is rapid, sensitive, reproducible, ecologically relevant and cost effective. It is recognised and used th

12、roughout the world as a standard test for aquatic toxicity testing. The Procedure employs the bioluminescent marine bacterium (Vibrio fischeri) as the test organism. The bacteria are exposed to a range of concentrations of the material being tested. The reduction in intensity of light emitted from t

13、he bacteria is measured along with standard solutions and control samples. The change in light output and concentration of the toxicant produce a dose / response relationship. The results are normalised and the EC50 (concentration producing a 50% reduction in light) is calculatedThe Microtox system

14、has been used as an aquatic toxicity test since the early 1980s and is accepted as a standard test in a number of countries including Australia. In the United States it is a recognised test method in a number of federal programs. The Acceptance of MicrotoxThe U.S. EPA, has adopted Microtox as a stan

15、dard test in an ongoing program of Assessment and Remediation of Contaminated Sediments. Microtox has been adopted by the U.S Fish and Wildlife Service as a screening test at the National Fisheries Contaminant Research Centre. Microtox is similarly recognised in Canada, the United Kingdom, Germany,

16、Sweden and the Netherlands.In Australia, the Microtox system is recognised by and listed in discharge, trade waste and effluent regulations by a number of Authorities. In Victoria, Microtox toxicity is used to check regulatory compliance of some discharges and effluents.The Benefits of MicrotoxThe M

17、icrotox system has many benefits over other toxicity testing systems. The low cost enables it to be used as a regular monitoring and screening test. A full Microtox assay is about a tenth of the cost of other toxicity tests.It is usually desirable to have toxicity results as soon as possible. Microt

18、ox assays can be completed within an hour and a report available within 24 hours, making them a very rapid form of testing. 二、硝化作用抑制試驗（nitrification inhibition test）1989年國際標準化組織把該方法作為檢測化合物或廢水毒性的標準化方法（ISO9509）之一1.試驗原理NH3 NO2-NO3-亞硝化細菌硝化細菌二、測試方法硝化作用抑制試驗可單獨選擇亞硝化單胞菌或硝化桿菌，也可采用活性污泥中的混合菌株。菌種活化與增殖樣品稀釋與設(shè)置培養(yǎng)與

19、取樣比較與計算三、真核微生物檢測方法（一）藻類生長抑制試驗（alage growth inhibition test）1.試驗原理藻類對水體污染的反應(yīng)十分敏感。藻類的生長量和水體污染的關(guān)系很大。水質(zhì)監(jiān)測和毒性檢測常用的有硅藻、柵藻、小球藻等2.試驗方法藻類生長量的測量藻體生長量 放氧量攝取14C量細胞DNA和ATP的測定藻體生長量的測量細胞計數(shù)藻體干重藻液渾濁度葉綠素a含量繁殖純藻種試驗配置與藻類接種同等適宜條件下培養(yǎng)定時取樣檢測并繪制生長曲線計算與分析3.毒性測定程序第三節(jié) 污染物致突變的微生物學檢測方法污染物對人體的潛在危害，引起人們的普遍關(guān)注。世界上已發(fā)展了百余種短期快速測試法，檢測污染

20、物的遺傳毒性效應(yīng)。 目前一般認為人類癌癥的發(fā)生與環(huán)境污染物的致突變性有一定的關(guān)系。誘變劑作用的共性原則：超過95%的致癌物質(zhì)對微生物有誘變作用；化學藥劑對細菌的誘變率與其對動物的致癌性成正比。所有這些檢測試驗都基于兩個原則90%以上的非致癌物質(zhì)對微生物沒有誘變作用。人和細菌在DNA的結(jié)構(gòu)及特性方面是一致的，能使微生物發(fā)生突變的誘變劑必然也會作用于人的DNA，使其發(fā)生突變，最后造成癌變或其他不良的后果。生命的“生物化學統(tǒng)一性”法則：美國加利福尼亞大學Bruce Ames教授等于1975年正式建立的沙門氏菌回復(fù)突變試驗（亦稱Ames試驗）已被世界各國廣為采用，是檢測環(huán)境誘變劑的的首選試驗。一、 A

21、mes試驗Ames試驗是檢測DNA堿基序列是否發(fā)生改變即基因突變的一種方法。1.試驗原理鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）的組氨酸營養(yǎng)缺陷型（his-）菌株，在含微量組氨酸的培養(yǎng)基中，除極少數(shù)自發(fā)回復(fù)突變的細胞外，一般只能分裂幾次，形成在顯微鏡下才能見到的微菌落。受誘變劑作用后，大量細胞發(fā)生回復(fù)突變，自行合成組氨酸，發(fā)育成肉眼可見的菌落。野生型與組氨酸營養(yǎng)缺陷型關(guān)系如下：野生型his+營養(yǎng)缺陷型his-正向突變回復(fù)突變回復(fù)突變(reverse mutation或back mutation)：突變體失去的野生型性狀，可以通過第二次突變得到恢復(fù)，這種第二次突變稱為回復(fù)突

22、變。實驗菌株目前推薦使用的一套菌株是組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株TA97、TA98、TA100和TA102。鑒定前先進行增菌培養(yǎng)。為鑒定結(jié)果可靠，需同時培養(yǎng)野生型TV菌株，作為測試菌基因型之對照。由于生物體內(nèi)、體外可能存在的差異，可在體外加入哺乳動物（如大鼠）微粒體酶系統(tǒng)，使待測物活化，使Ames試驗的準確率達80-90%。哺乳動物微粒體酶S9混合液：雄性大鼠肝臟勻漿物上清液+輔酶 +G-6-PMost environmental genotoxins are found in an inactive state (progenotoxin) and must be metabolically act

23、ivated to become DNA-damaging substances. The incorporation of a mammalian (rodent) hepatic metabolic activation system - the postmitochondrial supernatant fraction (commonly referred to as the S9 fraction) - into a genotoxicity test significantly improved the assays sensitivity to a broader spectru

24、m of genotoxins.The use of fish S9 (Johnson, 1993c) has increased the ecological relevancy of these tests in aquatic ecosystems. This addition of a hepatic metabolic activation system has become an important milestone in the development of environmental genotoxicity testing . 檢測鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella ty

25、phmurium)組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株(his-)的回復(fù)突變率2.具體操作程序?qū)嶒灧椒ê芏?，目前主要?yīng)用的是斑點法和平板摻入法，此外還有一些其它的方法。Ames試驗Ames試驗Ames試驗的應(yīng)用范圍檢測食品添加劑、化妝品等的致突變性，由此推測其致癌性；檢測水源水和飲用水的致突變性，探索較現(xiàn)行方法更加衛(wèi)生安全的消毒措施 ；檢測城市污水和工業(yè)廢水的致突變性，結(jié)合化學分析，追蹤污染源，為研究防治對策提供依據(jù) 檢測土壤、污泥、廢渣堆肥、廢物灰燼的致突變性，防止土壤受致突變物污染后，通過農(nóng)作物危害人類檢測氣態(tài)污染物的致突變性，防止污染物經(jīng)由大氣，通過呼吸對人體發(fā)生潛在危害 用Ames試驗研究化合物結(jié)構(gòu)與

26、致變性的關(guān)系，為合成對環(huán)境無潛在危害的新化合物提供理論依據(jù)檢測農(nóng)藥在微生物降解前后的致突變性，了解農(nóng)藥在施用后代謝過程中對人類有無隱患 用Ames試驗篩選抗突變物，研究開發(fā)新的抗癌藥等等Ames試驗的應(yīng)用實例：國外曾開發(fā)了一種降低婦女妊娠反應(yīng)的藥物“反應(yīng)?！?，由于其藥效顯著，在60-70年代十分流行。但隨后人們就發(fā)現(xiàn)畸形兒的出生率明顯增高，而且生產(chǎn)畸形兒的婦女大多曾服用“反應(yīng)?！?，后來采用Ames試驗發(fā)現(xiàn)這種物質(zhì)的確具有很強的致突變作用，因此這種藥物被禁止使用，但如果能在這種藥物上市之前就進行Ames試驗檢測，那么這種大量出生畸形兒的悲劇完全可以避免。二、發(fā)光細菌實驗（Mutatox）發(fā)光細菌

27、可用于各類污染物的急性毒性檢測，經(jīng)特殊處理后還可用于污染物的遺傳毒性的檢測檢測的主要原理為發(fā)光細菌的自發(fā)暗變異株與致突變物接觸后，可恢復(fù)一定強度的發(fā)光能力。美國的Microbics公司將這一方法標準化，命名為Mutatox.Mutatox toxicity testThe Mutatox test is considered as a promising tool for detection of mutagenic compounds in environmental samples. The genotoxicity of water samples can be determined w

28、ith Mutatox Genotoxicity Test System (Microbics Corporation, CAL U.S.A.).The Mutatox assay detects genotoxins with a dark mutant strain of the luminescent bacterium Photobacterium phosphoreum. DNA-damaging substances are recognized by measuring the ability of a test sample to restore the luminescent

29、 state in the bacterial cells .Light produced by luminescent bacteria makes an easy quantitative endpoint in the genotoxicity assayThe amount of light increase indicates the genotoxicity of the sample.Various genotoxins, base-substitution or frame-shift, DNA synthesis inhibitors, and DNA-intercalati

30、ng agents, have been detected with the Mutatox assay . Mutatox protocol is very simple, requiring minimal expertise. The assay may be initiated and completed in less than 24 hours. Prepackaged dehydrated media, freeze-dried bacteria, and standard disposable reaction tubes require only a few hydratio

31、n, mixing, and dilution steps and eliminate the rigors, tedium and cost of sterile technique.Bacteria are nonpathogenic, clonal, and require no reisolation or reculturing; in addition, they are completely disposable without causing any environmental harmIncubation time is short which reduces the possibility of cross-contamination with bacterial contaminants.Quality assurance and quality control are sim