4-1微生物的固氮作用課件

1、第四節(jié) 微生物的固氮作用 氮是組成生物細(xì)胞必不可少的重要元素之一。氮?dú)?N2)約占空氣總體積的78%，但由于N N三鍵非常穩(wěn)定，故N2不能被高等生物和大多數(shù)微生物利用，只有少數(shù)原核微生物能直接 利用N2作氮源，將其還原成氨，供植物和其他微生物利用。 固氮微生物利用固氮酶的催化 作用將分子態(tài)氮轉(zhuǎn)化為氨的過程稱為生物固氮。生物固氮是地球上僅次于光合作用的第二大生物化學(xué)反應(yīng)。生物每年在溫和條件下的固氮量約為高溫高壓(300300個(gè)大氣壓)條件下工業(yè)固氮量的2倍多，約為1億噸，故生物固氮對地球生態(tài)系統(tǒng)中的氮素循環(huán)和生物的生息繁衍具有十分重要的作用。 1.固氮微生物的種類 自1886年M.W.Beije

2、rinck分離到能共生固氮的根瘤菌后，人們共發(fā)現(xiàn)了50多屬100多種生物有固氮能力，這些生物均為原核生物。 按其固氮方式可分為3種類型： 能獨(dú)立固氮的微生物稱為自生固氮菌； 必須與其他生物共生才能固氮的微生物稱為共生固氮菌； 必須生活在植物根際、葉面或腸道等處才能固氮的微生物稱為聯(lián)合固氮菌。 自生固氮菌 好氧化能異養(yǎng)： 固氮菌屬(Azotobacter) 拜葉林克氏菌屬(Beijerinckia) 固氮單胞菌屬(Azomonas) 固氮球菌屬(Azococcus) 德克斯氏菌屬(Derxia) 黃色分枝桿菌(Mycobacterium flavum) 自養(yǎng)棒桿菌(Corynebacterium

3、 autotrophicum) 產(chǎn)脂螺菌(Spirillum lipoferum) 甲烷氧化菌等 化能自養(yǎng)： 氧化亞鐵硫桿菌(Thiobacillus ferroxidans 光能自養(yǎng)： 念珠藍(lán)菌屬(Nostoc) 魚腥藍(lán)菌屬(Anabaena) 著色菌屬(Chromatium) 綠假單胞菌屬(Ch loropseudomonas) 微好氧 (化能異養(yǎng))： 棒桿菌屬(Corymebact erium) 固氮螺菌屬(Azospirillum) 兼性厭氧化能異養(yǎng)： 克雷伯氏菌屬(Klebsiella) 無色桿 菌屬(Achromobacter) 多粘芽孢桿菌(Bacillus polymyxa)

4、檸檬酸桿菌屬(Cit robacter) 歐文氏菌屬(Erwinia) 腸桿菌屬(Enterobacter) 光能異養(yǎng)： 紅螺 菌屬(Rhodospirillum) 紅假單胞菌屬(Rhodopseudomonas)厭氧化能異養(yǎng)： 巴氏梭菌(Clostridium pasteurianum) 脫硫弧菌屬(Desulforibrio) 脫硫腸狀菌屬(Desulfotomaculum) 共生固氮菌根瘤豆科植物： 根瘤菌屬(Rhizobium)非豆科植物： 弗蘭克氏菌屬放線菌(Frankia)白蟻等動(dòng)物腸道： 腸桿菌屬(Enterobacter)植物地衣： 念珠藍(lán)菌屬(Nostoc) 魚腥藍(lán)菌屬(An

5、abaena) (單歧藍(lán)菌屬) 等(Tolypothrix)滿江紅： 滿江紅魚腥藍(lán)菌(Anabaena azollae)蘇鐵珊瑚根： Nostoc,A nabaena肯乃拉草： Nostoc聯(lián)合固氮菌 根際溫帶： Bacillus，Klebsiella 熱帶： 雀稗固氮菌(Azotobacter paspali)，Azospirillum,Beijerinckia 葉面： Beijerinckia, Azoto bacter2.固氮的生化機(jī)制 固氮酶：生物固氮反應(yīng)的核心。 1960年，J.E.Carnahan從巴氏梭菌(Clost ridium pasteurianum)中獲得了具有固氮活性的

6、無細(xì)胞抽提液，實(shí)現(xiàn)了分子氮還原為NH3 的實(shí)驗(yàn)。 1966年，L.Mortenson從巴氏梭菌(C.Pasteurianum)和維涅蘭德固氮菌(Azotobacte r vinelandii)的無細(xì)胞抽提液中，分離出兩種固氮蛋白鉬鐵蛋白和鐵蛋白，使固氮研究進(jìn)入分子水平。 固氮反應(yīng)的必要條件： 大量ATP 還原力NAD(P)H2 固氮酶 N2 Mg2+ 嚴(yán)格的厭氧微環(huán)境 固定1mol N2需要消耗1015molATP 。這些ATP由呼吸、發(fā)酵或光合磷酸化過程提供。從不同生理類型的固氮微生物細(xì)胞中抽提到的固氮酶具有相同結(jié)構(gòu)，它們均含、兩種組分。組分為鉬鐵蛋白(MF)或鉬鐵氧還蛋白(MoFd)，是真

7、正的“固氮酶”；組分為鐵蛋白(F)，是固氮酶還原酶。 固氮酶的、兩種組分 項(xiàng)目 組分 組分 蛋白質(zhì)亞基數(shù) 4(2大2小) 2(相同) 分子量 22萬左右 六萬左右 Fe原子數(shù) 30(2432) 4 不穩(wěn)態(tài)S原子數(shù) 28(2032) 4 Mo原子數(shù) 2 0 Cys的SH基數(shù) 3234 12 活性中心 鐵鉬輔因子(FeMoCo) 電子活化中心(Fe4S4) 功能 絡(luò)合、活化和還原N2 傳遞電子到組分上 固氮酶活力測定：測定固氮酶活力的經(jīng)典方法有微量K氏定氮法和同位素法，但前者精度低，后者程序復(fù)雜。 1966年，M.J.Dilworth等發(fā)表了靈敏簡便的乙炔還原法，促進(jìn)了固氮酶活性及固氮機(jī)理研究。該

8、法的理論依據(jù)是：固氮酶除了能催化N2 NH 3外，還能催化C2H2(乙炔) C2H2(乙烯)及2H+ H2等多種反應(yīng)。 乙炔還原反應(yīng)中產(chǎn)生的乙烯及底物乙炔即使?jié)舛群艿?，也能方便地用氣相色譜儀測定。該測定方法靈敏度高、設(shè)備簡單、成本低及操作簡便，可用于純酶制劑及自然固氮生態(tài)體系的固氮活力測定。 固氮的生化途徑 固氮總反應(yīng)式為： N2 + 6e + 6H+ + 12ATP 2NH3 + 12ADP + 12Pi N2分子經(jīng)固氮酶催化還原為NH3，再通過轉(zhuǎn)氨途徑形成各種氨基酸。固氮酶除具有固氮功能外，還能催化2H+ H2。在缺N2條件下，固氮酶可將H+全部還原為H2；在有N2條件下，固氮酶將75%的

9、NAD(P)H2用于N2的還原，另外25%的NAD(P)H2形成H2浪費(fèi)掉。但在大多數(shù)固氮菌中，含有氫酶，可將固氮催化形成的無效H2重新轉(zhuǎn)化為NAD(P)H2和ATP。圖氮的生化途徑 圖氮的生化途徑 N2經(jīng)根瘤菌被植物吸收 3.固氮菌的抗氧機(jī)制 固氮酶的兩個(gè)蛋白組分對氧極端敏感，一旦遇氧就可發(fā)生不可逆失活。組分(鐵蛋白)在空氣中暴露45秒其酶活喪失一半，組分在空氣中的活性半衰期約為10min。不同固氮微生物的鉬鐵蛋白具有不同的氧敏感性。大多數(shù)固氮菌為好氧菌，它們需要氧氣進(jìn)行呼吸和產(chǎn)能。固氮菌在長期的進(jìn)化中形成了許多巧妙的機(jī)制，解決了細(xì)胞 需氧和固氮酶厭氧的矛盾。 不同固氮菌鉬鐵蛋白的氧敏感性

10、名稱 半衰期(min) 大豆根瘤菌 4.5 肺炎克雷伯氏菌 8.0 維涅蘭德氏固氮菌 10.0 圓褐固氮菌 10.0 巴氏梭菌 60好氧自生固氮菌的保護(hù)機(jī)制： 抗氧方式主要有兩種：呼吸保護(hù)和構(gòu)象保護(hù)。 固氮菌以較強(qiáng)的呼吸作用迅速將周圍環(huán)境中的氧消耗掉，使細(xì)胞周圍微環(huán)境處于低氧態(tài)，以保護(hù)固氮酶不受氧損傷，該抗氧方式稱為呼吸保護(hù)。 本機(jī)制存在的證據(jù)：屬于固氮菌科(Azotobacterlaceae)的固氮菌都具有特別高的呼吸強(qiáng)度。例如，把生長在低氧分壓下的A.vinelandii突然轉(zhuǎn)移到高氧分壓下培養(yǎng)時(shí)，其呼吸強(qiáng)度和NADPH2脫氫酶活性同時(shí)增高，細(xì)胞色素a2的含量增加，而氧化磷酸化的效率卻明顯

11、降低。其原因在于細(xì)胞動(dòng)用了一套消耗碳源除氧以保護(hù)固氮酶 的呼吸系統(tǒng)。 構(gòu)象保護(hù)指固氮菌處于高氧分壓環(huán)境下時(shí)，其固氮酶能形成一個(gè)無固氮活性但能防止氧損傷的特殊構(gòu)象。該構(gòu)象是由固氮酶與蛋白質(zhì)或磷脂等穩(wěn)定因子結(jié)合形成的。 呼吸與構(gòu)象兩種保護(hù)互相協(xié)調(diào)，形成“雙保險(xiǎn)”機(jī)制。在一般含氧條件下，呼吸保護(hù)就可除去多余氧；若還有 過量分子氧，可利用構(gòu)象保護(hù)使固氮酶免遭損害。 藍(lán)細(xì)菌的固氮酶保護(hù)： 藍(lán)細(xì)菌是放氧光合生物。在光照下，通過光合作用放氧使細(xì)胞內(nèi)的氧濃度增高。 兩種防氧措施： 異形胞抗氧和非異形胞抗氧 異形胞抗氧機(jī)制： 異形胞為一種特化細(xì)胞，個(gè)體較營養(yǎng)細(xì)胞大，細(xì)胞外有一層由糖脂組成的較厚的外膜，該膜具有防

12、止氧氣擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞的物理屏障功能； 異形胞內(nèi)缺少產(chǎn)氧光合系統(tǒng)，脫氫酶與氫酶活性高，使異形胞內(nèi)維持在很強(qiáng)的還原態(tài)； 胞內(nèi)超氧化物歧化酶SOD( Superoxide dismutase)活性很高，有解除氧毒害的功能； 異形胞比相鄰營養(yǎng)細(xì)胞的呼吸強(qiáng)度高2倍，可通過呼吸消耗過多的O2并產(chǎn)生固氮所需ATP。 非異形胞抗氧有多種形式： 利用時(shí)間差解決固氮酶厭氧和光合放氧的矛盾，即在黑暗下固氮，在光照下進(jìn)行光合作用(織線藍(lán)細(xì)菌屬)；提高細(xì)胞內(nèi)SOD和過氧化物酶活性，消除有毒過氧化物，保護(hù)固氮酶活性(粘球粘細(xì)菌屬)。 根瘤菌固氮酶的保護(hù)： 根瘤菌分為豆科根瘤菌與非豆科根瘤菌兩種類型。 豆科根瘤菌以只能生長不能分裂的類菌體(bacteroids)形式存在于豆科植物的根瘤中。許多類菌體被包裹在一層類菌體周膜中，膜內(nèi)具有良好的氧、氮和營養(yǎng)條件。最重要的是在周膜內(nèi)外存在著獨(dú)特的豆血紅蛋白(leghaemoglobin)。該蛋白具有極強(qiáng)的吸氧能力，可使近血紅蛋白處的氧濃度比周圍環(huán)境降低8萬倍，以防止類菌體周圍氧濃度過高使固氮酶失活。豆血紅蛋白猶如氧緩沖劑，可調(diào)節(jié)根瘤中氧的濃度，使其穩(wěn)定在固氮酶的最適范圍內(nèi)。豆血紅蛋白的蛋白質(zhì)部分由根瘤菌觸發(fā)，植物基因編碼合成；血紅素由植物觸發(fā)，根瘤菌基因編碼合成 。 1973年發(fā)現(xiàn)，