第六章增加的內(nèi)容-代謝途徑的調(diào)控

1、第六章增加的內(nèi)容-代謝途徑的調(diào)控Enzyme kineticsRegulation of enzyme activityRegulation of enzyme concentrationGlobal regulation Metabolic Control Analysis 細(xì)胞內(nèi)代謝途徑的調(diào)控主要是通過調(diào)節(jié)參與生化反應(yīng)的各種物質(zhì)的濃度來實(shí)現(xiàn)的，包括：酶的濃度（轉(zhuǎn)錄和翻譯）底物的濃度（分解代謝物阻遏等）產(chǎn)物的濃度（終產(chǎn)物反饋抑制和阻遏）調(diào)節(jié)物分子的濃度（抑制或激活）代謝途徑的調(diào)控代謝途徑調(diào)控的層次性原核生物 基因結(jié)構(gòu)簡潔有效，無多余序列，必須利用少量的DNA序列充分存儲必要的遺傳信息 調(diào)控層

2、次少，簡單而快速：酶活調(diào)節(jié)-轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)-總體調(diào)控 能適應(yīng)多種不利環(huán)境，進(jìn)行快速調(diào)節(jié) 真核生物 有充分的遺傳物質(zhì)，能形成各種特殊的基因結(jié)構(gòu) 調(diào)控層次多而復(fù)雜：轉(zhuǎn)錄前（DNA擴(kuò)增、甲基化） 轉(zhuǎn)錄（增強(qiáng)子） 轉(zhuǎn)錄后（mRNA拼接） 翻譯（翻譯因子的磷酸化、轉(zhuǎn)鐵蛋白等） 翻譯后（蛋白質(zhì)修飾） 對遺傳信息傳遞的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性更有利分子水平調(diào)控 酶的“質(zhì)”和“量”的調(diào)控細(xì)胞水平調(diào)控 調(diào)控代謝子（modulon)或調(diào)節(jié)子(regulon) 代謝網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控(建立代謝調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)、分析調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的特點(diǎn)如拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、層次性等）代謝途徑的調(diào)控的層次性主要介紹原核生物的調(diào)控酶動(dòng)力學(xué)單底物的酶催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型: 由V.

3、C .R. Henri 于1902年及L. Michaelis 和M. L. Menten 于1913年建立的。簡單的酶催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)通常是指Michaelis-Menten動(dòng)力學(xué)或飽和動(dòng)力學(xué)。 E+SESE+P 兩個(gè)假定：1.形成ES復(fù)合物的反應(yīng)速度很快. 2.第二步的逆反應(yīng)速率可忽略。此假設(shè)僅在反應(yīng)初期產(chǎn)物的累積量很少時(shí)才能成立。 米氏方程的推導(dǎo)快速平衡假設(shè)擬穩(wěn)態(tài)假設(shè)E+SESE+P ES的解離常數(shù)最適底物的判斷：（P204 的推導(dǎo)）SKm時(shí) ，S = Km時(shí) ，I=0I0競爭性抑制的最終作用結(jié)果是使 ，因此降低了反應(yīng)速度。最大反應(yīng)速度不變。競爭性抑制可通過提高底物濃度來克服。 Compe

4、titive inhibition enzyme kineticsNon-competitive inhibition enzyme kinetics非競爭性抑制劑不是底物類似物。抑制劑與酶結(jié)合的位點(diǎn)不是酶的活性位點(diǎn)，這種結(jié)合降低了酶的有效濃度。高底物濃度不能克服非競爭性抑制。必須加入其它試劑去阻止抑制劑與酶的結(jié)合。 I=0I0Uncompetitive inhibition enzyme kinetics反競爭性抑制劑只與ES復(fù)合物結(jié)合，而且它與酶無親和作用。 Vm值的降低要比Km值的降低更具顯著作用，其最終結(jié)果是使反應(yīng)速率降低。 I=0I0Substrate inhibition enzy

5、me kinetics如果底物自身有抑制作用：一種反競爭抑制，1/v是1/s的雙曲函數(shù)，該雙曲函數(shù)具有一垂直和一傾斜漸近線 在低底物濃度時(shí)，S2/KSI1，觀察不到抑制作用。反應(yīng)速率為 在高底物濃度時(shí)，Km/S1。Hill 經(jīng)驗(yàn)方程分支代謝途徑中的反饋抑制或激活模式同工酶反饋抑制累積反饋抑制順序反饋抑制協(xié)同反饋抑制增效反饋抑制抑制加激活線性代謝途徑中的終產(chǎn)物反饋抑制前體物激活終產(chǎn)物反饋抑制 同工酶反饋抑制酶I酶II 累積反饋抑制0.5V(1-20%)=0.4V順序反饋抑制 協(xié)同反饋抑制 增效反饋抑制(1-0.85)*0.2=32%激活和抑制的聯(lián)合作用分支代謝途徑反饋調(diào)節(jié)實(shí)例黃色短桿菌中Tyr和

6、Phe協(xié)同反饋抑制DAHP合成酶，并存在兩種優(yōu)先合成和激活調(diào)節(jié)。枯草芽孢桿菌中Tyr、Phe和Trp只抑制其分支途徑中的第一個(gè)酶，造成分支酸和預(yù)苯酸積累，由這兩種中間產(chǎn)物抑制DAHP合成酶，屬于順序反饋抑制。分支代謝途徑反饋調(diào)節(jié)實(shí)例谷氨酸棒桿菌中Lys和Thr對天冬氨酸激酶的協(xié)同反饋抑制：如果高絲氨酸脫氫酶缺陷，在補(bǔ)加生長所需的少量Ileu和Thr后，可以解除協(xié)同反饋抑制而造成Lys積累分支代謝途徑反饋調(diào)節(jié)實(shí)例大腸桿菌中天冬氨酸族氨基酸合成的調(diào)節(jié)三種天冬氨酸激酶，其中兩種分別只受賴氨酸和蘇氨酸的反饋抑制，而且Lys和Thr還分別抑制其分支途徑的第一個(gè)酶屬于同工酶反饋抑制。酶濃度的調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的控制

7、 正調(diào)控 負(fù)調(diào)控（底物誘導(dǎo)和終產(chǎn)物阻遏） 弱化機(jī)制翻譯的控制 反義mRNA mRNA穩(wěn)定性 翻譯起始概率 翻譯速率 等酶濃度的調(diào)節(jié) 轉(zhuǎn)錄的控制順式作用元件：對基因表達(dá)有調(diào)節(jié)活性的DNA序列，其活性只影響與其同處于一個(gè)DNA分子上的基因，這種序列不編碼蛋白質(zhì)，多位于基因旁側(cè)或內(nèi)含子中，如：操縱基因、啟動(dòng)子和終止子。反式作用因子：游離基因產(chǎn)物擴(kuò)散至目標(biāo)場所的過程稱為反式作用，反式作用因子的編碼基因與其識別或結(jié)合位點(diǎn)的靶DNA序列可不在同一個(gè)DNA分子上，如阻遏物、RNA聚合酶等都屬于反式作用因子。正調(diào)控：若調(diào)控蛋白有活性（能和順式作用元件結(jié)合），則受調(diào)控基因才能表達(dá)。負(fù)調(diào)控：若調(diào)控蛋白失活（不能和

8、順式作用元件結(jié)合），則受調(diào)控基因開始表達(dá)。Cell numbersTimeGlucoseLactose二次生長：正調(diào)控與負(fù)調(diào)控的聯(lián)合作用葡萄糖比乳糖更迅速地被利用，因此細(xì)胞以葡萄糖為碳源時(shí)生長比以乳糖為碳源時(shí)要快.以葡萄糖和乳糖同時(shí)作為碳源時(shí)，細(xì)胞出現(xiàn)二次生長現(xiàn)象葡萄糖被優(yōu)先利用，被基本耗盡時(shí)，細(xì)胞開始合成有關(guān)利用乳糖的酶（生長停滯期），將乳糖運(yùn)入胞內(nèi)后繼續(xù)生長。GlucoseLactoseCell numberssugar concentrationCatabolite Repression (also called glucose repression)負(fù)調(diào)控 底物誘導(dǎo)Lac Operon

9、誘導(dǎo)物乳糖（或異乳糖）缺乏時(shí)，lacI編碼的阻遏物具有活性，和操縱基因結(jié)合后關(guān)閉轉(zhuǎn)錄，起負(fù)調(diào)控作用。負(fù)調(diào)控 底物誘導(dǎo)Lac Operon存在誘導(dǎo)物乳糖（或異乳糖）時(shí)，誘導(dǎo)物充當(dāng)輔阻遏物，和阻遏蛋白結(jié)合使其失活，在cAMP-CRP結(jié)合在DNA的前提下，轉(zhuǎn)錄起始。Catabolic Activator Protein (CAP) or cyclic AMP Receptor Protein (CRP) 是乳糖操縱子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)節(jié)物。CRP 是一種多效性的正調(diào)節(jié)物，或總體調(diào)節(jié)子，可以作用于許多操縱子 活化的CRP 可以和特定的DNA序列結(jié)合，并促進(jìn)RNA聚合酶與啟動(dòng)子的結(jié)合CRP 對細(xì)胞內(nèi)cAMP的濃

10、度水平作出響應(yīng)，并被cAMP活化乳糖操縱子的高表達(dá)條件之一是：cAMP-CRP和其上游特定的DNA序列相結(jié)合CRP的簡介 正調(diào)控Positive regulation of the lac operon葡萄糖濃度高時(shí)，細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度很低，CRP無法被激活，即使阻遏蛋白LacI失活，操縱子也不能高表達(dá) 正調(diào)控 Positive regulation of the lac operon乳糖操縱子的高表達(dá)條件之二是：lacI所編碼阻遏物的失活而不能和操縱基因結(jié)合葡萄糖濃度低造成cAMP的大量生成，從而激活CRP啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，起正調(diào)控作用負(fù)調(diào)控 終產(chǎn)物阻遏當(dāng)Trp很少時(shí)，由trpR編碼的阻遏蛋白沒有活

11、性，不能和操縱基因結(jié)合，轉(zhuǎn)錄可以起始。負(fù)調(diào)控 終產(chǎn)物阻遏當(dāng)Trp大量存在時(shí)，阻遏物可以和作為輔阻遏物Trp結(jié)合而被激活，然后和操縱基因結(jié)合，使轉(zhuǎn)錄不能起始。 Trp反饋?zhàn)瓒舻慕獬罐D(zhuǎn)錄強(qiáng)度提高70倍Cell numbersTimeGlucoseL-arabinose大腸桿菌中阿拉伯糖操縱子GlucoseL-arabinoseCell numberssugar concentrationTime和乳糖操縱子類似，也由總體調(diào)節(jié)蛋白 CRP 和一個(gè)專一性的調(diào)節(jié)蛋白 AraC來共同調(diào)節(jié)AraC既是阿拉伯糖操縱子表達(dá)的阻遏蛋白，又是 表達(dá)的激活蛋白AraC 可以調(diào)節(jié)自身的表達(dá)可以形成DNA環(huán)來對轉(zhuǎn)錄進(jìn)行

12、控制E.coli阿拉伯操縱子轉(zhuǎn)錄調(diào)控的特點(diǎn)P tPt araC araB araA araD Activator/ RepressorI1 I2AraC dimerCRP O2O1DNA上有四個(gè)AraC結(jié)合位點(diǎn)E.coli 阿拉伯操縱子轉(zhuǎn)錄調(diào)控的特點(diǎn)CRP P tPt araC araB araA araD O2I1 I21. 無阿拉伯糖時(shí)O1O2I1 I2O1repressedrepressedP araBADP araCAraC dimer is flexibleO2I1 I2O1repressedActiveP araBADP araCAraC結(jié)合在 O2 和I1 位點(diǎn)，P araBAD

13、不能轉(zhuǎn)錄過量 AraC 結(jié)合在 O1 調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi) AraC 的濃度E.coli 阿拉伯操縱子轉(zhuǎn)錄調(diào)控的特點(diǎn)P tPt araC araB araA araD O2I1 I2I1 I2induced(activated)O1CRP P tO2O1P araBAD2. +誘導(dǎo)物阿拉伯糖 + cAMP-CRP誘導(dǎo)物阿拉伯糖使AraC二聚體只能和 I2 、 I1 結(jié)合，和cAMP-CRP一起使 P araBAD高效轉(zhuǎn)錄E.coli 阿拉伯操縱子轉(zhuǎn)錄調(diào)控的特點(diǎn) 在大腸桿菌色氨酸操縱子中在存在一種轉(zhuǎn)錄的弱化調(diào)節(jié)，弱化作用的解除可使轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度升高810倍 轉(zhuǎn)錄的mRNA的5端存在一段前導(dǎo)鏈，通過前導(dǎo)鏈二級結(jié)構(gòu)

14、的變化、色氨酰-tRNA（色氨酸）以及核糖體的翻譯來控制轉(zhuǎn)錄是否繼續(xù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的弱化調(diào)節(jié) RNA二級結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)大腸桿菌色氨酸操縱子前導(dǎo)鏈RNA二級結(jié)構(gòu)受到氨基酰-tRNA分子的調(diào)節(jié)： His、Trp、Phe等氨基酸操縱子前導(dǎo)鏈RNA直接感應(yīng)終端產(chǎn)物的濃度而改變二級結(jié)構(gòu)： THI（B1）-box、RFN （B2） -box和 B12 -box維生素操縱子、嘌呤操縱子等或與其代謝相關(guān)的基因，這種調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)也稱為“Riboswitch”前導(dǎo)鏈的特點(diǎn)：含有一個(gè)起始密碼子和一個(gè)終止密碼子含有兩個(gè)連續(xù)的Trp密碼子四段能形成不同二級結(jié)構(gòu)的序列，可以形成終止子結(jié)構(gòu)或抗終止子結(jié)構(gòu)色氨酸操縱子轉(zhuǎn)錄的弱化調(diào)節(jié)一旦轉(zhuǎn)錄

15、開始后，核糖體結(jié)合在前導(dǎo)鏈上開始翻譯，核糖體緊隨在RNA聚合酶之后移動(dòng)。Trp缺乏時(shí)，由于大多數(shù)色氨酰-tRNA空載，核糖體在兩個(gè)連續(xù)的Trp密碼子處暫時(shí)停滯或移動(dòng)變慢，轉(zhuǎn)錄出的前導(dǎo)鏈2、3區(qū)配對形成抗終止子結(jié)構(gòu)，mRNA鏈繼續(xù)隨著RNA聚合酶的移動(dòng)而延長，直到轉(zhuǎn)錄出完整的產(chǎn)物。色氨酸操縱子轉(zhuǎn)錄的弱化調(diào)節(jié)色氨酸操縱子轉(zhuǎn)錄的弱化調(diào)節(jié)Trp充足時(shí)，大多數(shù)色氨酰-tRNA載有Trp ，核糖體快速通過兩個(gè)連續(xù)的Trp密碼子并占據(jù)前導(dǎo)鏈2區(qū)的一部分，使2、3區(qū)不能配對形成抗終止子，而是3、4區(qū)配對，剛好形成終止子結(jié)構(gòu)，mRNA鏈從RNA聚合酶上脫落下來，轉(zhuǎn)錄提前終止。前導(dǎo)鏈RFN元件 B.subtili

16、s核黃素操縱子轉(zhuǎn)錄弱化 B.subtilis核黃素操縱子轉(zhuǎn)錄弱化 FMN和RFN元件對轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié) FMN或FAD對核黃素操縱子的轉(zhuǎn)錄起調(diào)節(jié)作用 rib前導(dǎo)區(qū)含有RFN元件，可特異地同F(xiàn)MN/FAD結(jié)合來感知其濃度。 當(dāng)FMN/FAD的濃度的較高時(shí)， RFN元件與其結(jié)合形成一個(gè)復(fù)合物改變mRNA了的構(gòu)象，形成抗反終止子結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄在前導(dǎo)區(qū)提前終止，從而抑制核黃素的生成。當(dāng)FMN/FAD的濃度低于某個(gè)水平時(shí)，無法形成這樣的復(fù)合物，這時(shí)RNA正常形成反終止子，使轉(zhuǎn)錄正常延伸 RiboswitchsOliver Schilling1,2, Ines Langbein2, Michael Mller2

17、, Matthias H. Schmalisch1,2 and Jrg Stlke*,1,2 A protein-dependent riboswitch controlling ptsGHI operon expression in Bacillus subtilis: RNA structure rather than sequence provides interaction specificity Nucleic Acids Research, 2004, Vol. 32, No. 9 2853-2864ptsGHI操縱子表達(dá)受 GlcT 蛋白調(diào)節(jié)RNA感應(yīng)蛋白質(zhì)濃度而改變二級結(jié)構(gòu)翻譯

18、的控制反義mRNA：和mRNA上的糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS序列）互補(bǔ)結(jié)合，阻斷mRNA的翻譯Riboswitch：即mRNA對翻譯的自調(diào)節(jié)阻抑蛋白：可以和糖體結(jié)合位點(diǎn)或起始密碼子結(jié)合而阻止核糖體的結(jié)合。蛋白質(zhì)產(chǎn)物的自體負(fù)調(diào)控：如核糖體蛋白的富集會抑制其自身合成應(yīng)急調(diào)控（Stringent response）：ppGpp對終止rRNA轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)合成的調(diào)節(jié)。mRNA穩(wěn)定性：自身結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄后的修飾作用影響其半衰期。 翻譯速率：翻譯因子eIF2、 eIF-4E、 eIF-4B的磷酸化調(diào)控，加快或減緩翻譯速度。Riboswitch對翻譯的自調(diào)節(jié)類似于對轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)，mRNA前導(dǎo)鏈也能形成反-反SD序列的二級結(jié)構(gòu)（無效應(yīng)物時(shí)），即SD序列不被掩蔽，核糖體可以進(jìn)行翻譯。或形成反SD序列的二級結(jié)構(gòu)（有效應(yīng)物時(shí)），即SD序列被掩蔽，核糖體不能與其結(jié)合。溫度也可以充當(dāng)翻譯的調(diào)節(jié)信號：低溫時(shí)穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)掩蔽SD序列；高溫時(shí)破壞二級結(jié)構(gòu)，露出SD序列Listeria.monocytogen