免疫學(xué)技術(shù)綜述課件

1、第十講 分子免疫學(xué)技術(shù)內(nèi)容摘要1免疫學(xué)基本概況2 分子免疫的基本理論3 抗血清制備技術(shù)4免疫檢測(cè)技術(shù)5 酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法6單克隆抗體技術(shù)1免疫學(xué)基本概況1.1什么是免疫反應(yīng)？廣義的說(shuō)，凡是研究抗原物質(zhì)在體內(nèi)發(fā)生排異現(xiàn)象，刺激產(chǎn)生免疫答應(yīng)產(chǎn)物的方法學(xué)稱為免疫反應(yīng)。刺激產(chǎn)生免疫反應(yīng)的物質(zhì)稱之為抗原，產(chǎn)生免疫答應(yīng)產(chǎn)物稱之為抗體，產(chǎn)生免疫答應(yīng)的過(guò)程稱之為免疫周期。1.2免疫學(xué)的范疇在相當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)期內(nèi)，免疫學(xué)幾乎是只是研究有關(guān)傳染病預(yù)防問(wèn)題，但是隨著人對(duì)疾病作斗爭(zhēng)實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)的積累，隨著免疫化學(xué)和免疫生物學(xué)的深入研究，免疫學(xué)的研究越來(lái)越廣泛，并與許多相關(guān)學(xué)科交織在一起，發(fā)展成了許多分支學(xué)科。目前劃分的主

2、要學(xué)科主要有： 免疫生物學(xué)免疫遺傳學(xué)免疫細(xì)胞學(xué)免疫生理學(xué)免疫藥理學(xué)血液免疫學(xué)腫瘤免疫學(xué)1.3肌體內(nèi)的免疫系統(tǒng)在高等動(dòng)物體內(nèi)存在著具有免疫功能的組織主要有：淋巴組織(中樞淋巴組織的胸腺，外周淋巴組織的淋巴結(jié)，紅骨髓，脾臟)免疫活性細(xì)胞（T淋巴細(xì)胞,B淋巴細(xì)胞）免疫活性介質(zhì)（抗體，補(bǔ)體，淋巴因子）1.4外源抗原物質(zhì)組織、器官細(xì)菌、病毒紅細(xì)胞蛋白質(zhì)、多糖抗生素類藥物二價(jià)重金屬離子1.5免疫動(dòng)物原則上說(shuō)，行市對(duì)異體物質(zhì)具有免疫反應(yīng)的哺乳動(dòng)物均可作為免疫動(dòng)物，但是常用與免疫實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物主要有：馬羊兔鼠2 分子免疫的基本理論2.1基本原理當(dāng)抗原初次進(jìn)入具有免疫答應(yīng)能力的動(dòng)物體內(nèi)后，要經(jīng)過(guò)一段較長(zhǎng)的潛伏期才出

3、現(xiàn)抗體，又經(jīng)過(guò)一段高峰期后抗體量下降至消失。在這段時(shí)期內(nèi)總抗體量較少，抗體的主要成分是IgM，這次機(jī)體對(duì)抗原產(chǎn)生的答應(yīng)反應(yīng)為“初次答應(yīng)”。當(dāng)抗原再次進(jìn)入機(jī)體時(shí)，血液中抗體很快出現(xiàn)，含量明顯高于初次答應(yīng)反應(yīng)，抗體的主要成分是IgG，這次機(jī)體對(duì)抗原產(chǎn)生的答應(yīng)反應(yīng)為“再次答應(yīng)”。如此重復(fù)科獲得較高的答應(yīng)產(chǎn)物。 圖1,動(dòng)物機(jī)體的初次和再次免疫答應(yīng)由于動(dòng)物的遺傳性不同，同一抗原對(duì)不同的的動(dòng)物或同種不同品系的動(dòng)物，甚至同一品系不同個(gè)體的動(dòng)物，產(chǎn)生特異性免疫答應(yīng)的強(qiáng)弱是不同的。對(duì)于動(dòng)物個(gè)體的不同組織部位對(duì)抗原刺激的敏感性也是有差異的。淋巴結(jié)，脾臟，足掌，眼睫膜等是反映的敏感部位。近幾十年來(lái)，在研究抗原抗體大

4、分子的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系方面取得了很大的進(jìn)展。通過(guò)對(duì)合成抗原，人工抗原和天然抗原分子結(jié)構(gòu)與免疫源性的研究，表明只有蛋白質(zhì)，結(jié)合蛋白，和多糖類生物大分子誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫答應(yīng)，在免疫學(xué)上稱之為抗原。從抗原的化學(xué)結(jié)構(gòu)上分析，決定產(chǎn)生免疫答應(yīng)的不是抗原的整個(gè)分子二十分子上的一些特定的化學(xué)基團(tuán)或結(jié)構(gòu)，這些化學(xué)基團(tuán)稱為“抗原決定族”。它們幾十誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體，有事抗原與抗體結(jié)合部位。因此，一個(gè)復(fù)雜的蛋白質(zhì)大分子可以有多個(gè)抗原決定族，如：甲狀腺球蛋白有個(gè)抗原決定族。具有多個(gè)抗原決定族的生物大分子可以誘導(dǎo)產(chǎn)生多種特性的不同類別的抗體。2.2抗體的分類抗血清是指含有某種特異抗體的動(dòng)物血清，通過(guò)免疫學(xué)檢測(cè)抗原與抗體反應(yīng)

5、具有高度的特異性，無(wú)需純化可以進(jìn)行直接檢測(cè)。動(dòng)物血清中的抗體有5類，即IgG，IgM，IgA，IgE和IgD。這些抗體中，IgG含量最高。3 抗血清制備技術(shù)3.1免疫動(dòng)物的基本技術(shù)(1)抗原選擇以生物大分子作抗原，主要是蛋白類或多糖，如果要想得到多種混合抗體可以用多種蛋白同時(shí)免疫動(dòng)物，如用血清直接免疫動(dòng)物。如果要想得到單一抗體可以用純蛋白免疫動(dòng)物，如用牛血清青蛋白免疫(2)佐劑的配制a 不完全福氏佐劑(Freundsadjuvant)：由羊毛脂和液體石蠟按一定比例混合而成，一般在夏季羊毛脂：液體石蠟=1：2，冬季羊毛脂：液體石蠟=1：3b完全福氏佐劑：由不完全福氏佐劑，抗原物質(zhì)和卡介苗組成，混

6、合的比例是不完全福氏佐劑：抗原物質(zhì)：卡介苗=5：4：1c 混合方式：取5份不完全福氏佐劑置于乳缽中，一邊研磨一邊滴加水溶性抗原和卡介苗，直到混合物完全乳化形成油包水的注射用佐劑。外觀是乳白色的膠體。(3)動(dòng)物的選擇根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮涂贵w的用途，選擇不同的免疫動(dòng)物。如是用于大量制備抗體，可選用馬或羊等大的哺乳動(dòng)物，這些動(dòng)物的免疫周期較長(zhǎng)，通常要用3-6個(gè)月，如果是少量制備或科研分析可選用兔或鼠，這些動(dòng)物的免疫周期較短，通常要用一個(gè)半月左右。選擇年輕健康的動(dòng)物。(4)注射部位和注射量a 注射部位：通常選擇在免疫動(dòng)物的活動(dòng)部位為注射點(diǎn)，如足掌，肩胛骨，髖骨等。b 注射方式：每次采用多點(diǎn)注射。對(duì)于大的

7、哺乳動(dòng)物將佐劑注射在皮下，小哺乳動(dòng)物如鼠，可采用腹腔或肌肉注射,無(wú)需佐劑。C 注射量：根據(jù)動(dòng)物的不同，注射的量也有區(qū)別。以兔為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，總注射量為2ml，0.5ml/注射點(diǎn)。靜脈注射0.2ml, 無(wú)需佐劑(5)采血技術(shù)心臟采血耳沿靜脈采血尾靜脈采血眼窩采血頸動(dòng)脈采血3.2抗體的純化(1)血清制備，血清的制備有兩種方法。一種方法是將加入了抗凝劑的免疫動(dòng)物血液，于2500rpm/min離心，除去血球獲得到血漿或?qū)⑽醇涌鼓齽┑拿庖邉?dòng)物血液，待血液凝聚后放置24小時(shí)，直接滲出血清。(2)鹽析法粗提：在血清中加入飽和度為75%的硫酸銨鹽析，放置24小時(shí)后，然后將沉淀物用生理鹽水溶解，對(duì)蒸餾水透析，獲得抗

8、體粗提液。(3)離子交換分離：將抗體粗提液通過(guò)DEAE-Sepharose-4B陰離子交換柱層析分離，緩沖液：10mmol/L pH7.4磷酸緩沖液，洗脫液： 0.5mol/L NaCl溶液，一般采用梯度洗脫方式。(4)親和層析法：將純化好的抗原偶聯(lián)到瓊脂糖凝膠層介質(zhì)(Sepharose 4B)上，制成免疫親合柱，利用抗原抗體的互補(bǔ)性進(jìn)行分離。4免疫檢測(cè)技術(shù)4.1檢測(cè)的基本原理將可溶性抗原與相應(yīng)的抗體混合，如果二者比例合適，并有電解質(zhì)（如氯化鈉）存在時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)抗原-抗體沉淀反應(yīng)。如果這免疫檢測(cè)是在瓊脂糖凝膠介質(zhì)中進(jìn)行，則可看到白色沉淀的抗原抗體復(fù)合物。根據(jù)沉淀線出現(xiàn)與否可以判斷樣品種抗原-抗

9、體的存在 根據(jù)稀釋都梯度可以測(cè)定樣品種抗原-抗體的效價(jià)?？乖?抗體的結(jié)合在沉淀反應(yīng)中，呈現(xiàn)出一定的分子比例，不同抗原與相應(yīng)的抗體之間的分子比例是不同的，只有在抗原-抗體比例合適時(shí)才能見(jiàn)到沉淀線，所以抗原-抗體結(jié)合能否出現(xiàn)沉淀線，并不能完全反應(yīng)抗原-抗體是否存在和發(fā)生結(jié)合。因?yàn)榭乖梢越Y(jié)合多個(gè)抗體分子，所以稱抗原是多價(jià)的；抗體只能結(jié)合兩個(gè)抗原分子的抗原決定簇，故稱抗體是二價(jià)的。因此，只有抗原抗體的結(jié)合價(jià)被飽和時(shí)，才能出現(xiàn)大量的抗原抗體復(fù)合物沉淀。 A B C抗原、抗體的比例 4/16 8/12 8/4 1/4 1/1.5 2/1當(dāng)抗原為單價(jià)時(shí)（如某些有機(jī)小分子，多肽，小分子蛋白等）或抗體為單價(jià)，

10、雖然抗原抗體能發(fā)生結(jié)合，但不會(huì)形成大分子復(fù)合物，不出現(xiàn)沉淀反應(yīng)，所以單價(jià)的抗原或抗體不能用沉淀反應(yīng)直接進(jìn)行檢測(cè)。4.2檢測(cè)方法(1)雙向免疫擴(kuò)散雙向擴(kuò)散法(double diffusion),又稱瓊脂擴(kuò)散法。它是利用瓊脂糖凝膠介質(zhì)具有多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的特性，抗原抗體分子在瓊脂糖凝膠介質(zhì)中可以自由擴(kuò)散。當(dāng)具有一定間隔距離的抗原和相應(yīng)的抗體，通過(guò)在瓊脂糖凝膠介質(zhì)中的擴(kuò)散作用二者相遇，形成抗原抗體復(fù)合物，在比例合適時(shí)就會(huì)出現(xiàn)白色沉淀。由于瓊脂糖凝膠是透明的，可以直接觀察到抗原抗體復(fù)合物的沉淀線。沉淀線的特征和位置與抗原的相對(duì)分子量大小，分子結(jié)構(gòu)，擴(kuò)散系數(shù)和濃度等因素有關(guān)。當(dāng)抗原抗體存在多種系統(tǒng)時(shí)，會(huì)出

11、現(xiàn)多條沉淀線。根據(jù)沉淀線的形狀，數(shù)量和相對(duì)位置可以定性抗原，診斷某些疾病。此法的優(yōu)點(diǎn)是：操作簡(jiǎn)單，數(shù)據(jù)可靠。2.5cmm7.5cm(2)對(duì)流免疫電泳對(duì)流免疫電泳(counter immunoelectrophoresis)是外加電場(chǎng)以限制抗原，抗體的擴(kuò)散，提高抗原抗體的局部濃度，加快抗原抗體結(jié)合的速度。對(duì)流免疫電泳主要是利用血清抗原在pH8.6巴比妥緩沖液的離子瓊脂糖凝膠中，帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)下向正極移動(dòng)，而血清中的抗體在該溶液中處于電中性，在場(chǎng)下不移動(dòng)，但受電滲的影響向負(fù)極滲動(dòng)。由于抗原向正極移動(dòng)，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間電泳，抗原就會(huì)與抗體相遇，在抗原抗體的比例合適的情況下會(huì)出現(xiàn)白色沉淀。采用此方法可以

12、測(cè)定抗體效價(jià)或抗原效價(jià)。測(cè)定抗原的效價(jià)是：抗體為原濃度，抗原采用二倍稀釋法，沉淀顯出在最稀的一個(gè)稀釋倍數(shù)就是該抗原的效價(jià)。此法的優(yōu)點(diǎn)是：測(cè)定效價(jià)時(shí)間短，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確。抗 抗 抗 抗 抗 抗原 體 原 體 原 體2.5cm7.5cm(3)微量免疫電泳微量免疫電泳(micro-immunoelecrophoresis)是將免疫雙擴(kuò)散和免疫電泳技術(shù)結(jié)合起來(lái)的一種檢測(cè)方法，以此來(lái)提高免疫檢測(cè)的分辨率和靈敏度。該方法是，首先將抗原通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳把抗原各個(gè)組分分開(kāi)，并沿抗原分離的邊線開(kāi)一個(gè)小槽，然后在槽內(nèi)加滿抗體，抗體隨瓊脂糖凝膠介質(zhì)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)自由擴(kuò)散，與抗原的相應(yīng)組分相遇出現(xiàn)白色沉淀線。微量免疫電泳不僅

13、可以用于抗原抗體的定性和純度鑒定，而且可以用于臨床診斷。此法的優(yōu)點(diǎn)是：檢測(cè)靈敏度高，方法簡(jiǎn)便7.5cm2.5cm(4)火箭免疫電泳火箭免疫電泳(rocket immunoelectrophoresis)又稱單向定量免疫電泳。抗原抗體出現(xiàn)的沉淀線的形狀類是于子彈頭，故火箭電泳也因此而得名。檢測(cè)的方法是先在融化的瓊脂糖凝膠中加入一定量的抗體，混勻后鋪成瓊脂糖抗體板（也稱抗體板），在抗體板的一端打一排小孔，依次加入不同濃度的抗原。在電場(chǎng)作用下，不同濃度的抗原向前泳動(dòng)，當(dāng)遇到瓊脂板中的抗體時(shí)，就會(huì)形成抗原抗體復(fù)合物，出現(xiàn)沉淀線。由于抗原的加樣孔中的抗原不斷的進(jìn)入凝膠向前移動(dòng)，新增的抗原造成了抗原的過(guò)剩

14、。使已形成的抗原抗體復(fù)合物又被溶解。過(guò)剩的抗原在電場(chǎng)的作用下繼續(xù)往前走，又遇到瓊脂板中未被結(jié)合的抗體，再次形成新的抗原抗體復(fù)合物，出現(xiàn)新的沉淀線。因此，在電泳過(guò)程中抗原不斷的發(fā)生沉淀溶解沉淀。只有在加樣孔內(nèi)的抗原完全進(jìn)入凝膠并與抗體形成復(fù)合物時(shí)，才出現(xiàn)穩(wěn)定的沉淀線。若抗原的濃度越大，形成火箭峰越高，濃度越小形成峰越低。8cm8cm(5)雙向免疫電泳雙向免疫電泳也稱之為交叉免疫電泳(crossed electrophoresis)。首先在一塊離子瓊脂板上，像微量電泳一樣將抗原各組分分開(kāi)，稱之為第一相。然后將其轉(zhuǎn)移到玻璃板的一端并在另一側(cè)鋪上抗體瓊脂板，正好與第一相凝膠銜接。由于第一相已經(jīng)將抗原的

15、蛋白組分分開(kāi)了，在進(jìn)行第二相時(shí)只有單一組分的各個(gè)抗原向前泳動(dòng)。當(dāng)各種組分的抗原與抗體板中的相應(yīng)抗體相遇時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)各個(gè)組分的抗原抗體復(fù)合物沉定。第一向電泳第二向電泳5 酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定技術(shù)是在1971年由瑞典科學(xué)家Engvall等人提出來(lái)的。它們采用纖維素和聚苯乙烯是管作為固定相載體來(lái)吸附抗原或抗體，并建立了酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(Enzyme Linked Immunoserbent Assay，簡(jiǎn)稱ELISA)。1974年，因Voller等人改用聚苯乙烯微量反應(yīng)板為固定相作為免疫吸附載體，才使酶聯(lián)免疫吸附法得到了廣泛的應(yīng)用。ELISA檢測(cè)由于采用了酶標(biāo)法，被標(biāo)記酶的酶促與相應(yīng)

16、的底物反應(yīng)具有放大作用。它除了能保留抗原抗體的高度特異性結(jié)合外，還提高了檢測(cè)靈敏度，使檢測(cè)量達(dá)到ng甚至pg級(jí)的水平，接近放射免疫測(cè)定。ELISA檢測(cè)法在臨床和生物學(xué)研究中廣泛應(yīng)用，在抗原，半抗原和抗體的測(cè)定方面起到重要作用，尤其在單克隆抗體的研究中，為雜交瘤細(xì)胞株的篩選，提供了簡(jiǎn)單快捷，靈敏，快速的測(cè)定方法。免疫酶技術(shù)是將酶標(biāo)記在抗體或抗原分子上，形成酶標(biāo)抗原或抗體，稱之為酶結(jié)合物。該結(jié)合物中的酶分子，在免疫反應(yīng)后作用于相應(yīng)的底物生成顏色。根據(jù)反應(yīng)是否產(chǎn)生顏色可判斷抗原或抗體是否存在，作定性鑒定；根據(jù)反應(yīng)產(chǎn)生顏色的深淺來(lái)測(cè)定抗原或抗體含量。ELISA檢測(cè)法是免疫酶技術(shù)中一種，它是利用聚苯乙烯

17、微量反應(yīng)板具有吸附蛋白質(zhì)能力的特性，將待測(cè)抗原或抗體吸附在聚苯乙烯酶標(biāo)反應(yīng)板上，使其固相化，然后進(jìn)行免疫結(jié)合和酶反應(yīng)。根據(jù)ELISA檢測(cè)法的吸附方法不同，免疫吸附反應(yīng)的類型也不同，歸納起來(lái)主要有四類。5.1直接法測(cè)定抗體該法是將待測(cè)抗體吸附在聚苯乙烯酶標(biāo)板的凹槽內(nèi)，經(jīng)保溫吸附后，洗去游離的未被吸附的抗體。然后再加酶標(biāo)抗抗體，保溫一段時(shí)間，加入底物顯色，反應(yīng)30分鐘，終止酶反應(yīng)，進(jìn)行定量測(cè)定。A 將抗體吸附在固定相載體表面，洗去游離的抗體B 加入酶標(biāo)抗抗體，保溫，洗去未被結(jié)合的酶標(biāo)抗體C 加入底物顯色，測(cè)定底物的降解量。底物的降解量就等于抗體的量。 5.2間接法測(cè)定抗體間接法測(cè)定抗體，也稱測(cè)定抗

18、體間接法。該法是將已知濃度的抗原吸附在聚苯乙烯酶標(biāo)板的凹槽內(nèi)，經(jīng)保溫吸附后，洗去游離的未被吸附的抗原。再加入待測(cè)抗體保溫一定的時(shí)間，使抗體與抗原充分結(jié)合，洗去未被結(jié)合的抗體，然后再加酶標(biāo)抗抗體，保溫一段時(shí)間，加入底物顯色，反應(yīng)30分鐘，終止酶反應(yīng)，進(jìn)行定量測(cè)定。 A B C DA 將抗原吸附在固定相載體表面，洗去游離的抗原B 加入抗體與吸附在固定相載體表面抗原結(jié)合, 洗去游離的抗體C 加入酶標(biāo)抗抗體，保溫，洗去未被結(jié)合的酶標(biāo)抗體D加入底物顯色，測(cè)定底物的降解量。底物的降解量就等于抗體量 5.3 雙抗夾心法測(cè)定抗原雙抗夾心法測(cè)定抗原，是首先將抗原免疫第一種動(dòng)物獲得的特異性抗體（第一抗體），即免疫

19、球蛋白吸附在酶標(biāo)板的凹槽內(nèi)，洗去未被吸附的多余抗體；加入待測(cè)抗原，保溫，使其形成抗體-抗原復(fù)合物，洗去未被結(jié)合的抗原；再加入抗原免疫第二種動(dòng)物獲得的特異性抗體（第二抗體），保溫，使其形成抗原-抗體復(fù)合物，洗去未被結(jié)合的抗體；然或加入酶標(biāo)抗抗體（抗第二種動(dòng)物抗體的抗體）；保溫，使其形成抗體抗抗體復(fù)合物，洗去未被結(jié)合的酶標(biāo)抗體；加入底物顯色，終止酶反應(yīng)，比色測(cè)定抗原量 A B C D EA將抗原免疫第一種動(dòng)物獲得的抗體吸附在固定相載體表面，洗去游離的抗體B 加入抗原，保溫，形成抗原-抗體復(fù)合物，洗去未被結(jié)合的抗原和雜蛋白C加入抗原免疫第二種動(dòng)物獲得的抗體，保溫，形成抗原-抗體復(fù)合物，洗去多余的抗原和雜蛋白D 加入酶標(biāo)抗抗體（抗第二種動(dòng)物抗體的抗體），保溫，洗去未被結(jié)合的酶標(biāo)抗抗體E 加入底物顯色，測(cè)定底物的降解量。底物的降解量就等于抗原的量。5.4競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定抗原競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定抗原，首先將特異性抗體分成兩份（B1 和B2），分別加入到聚苯乙烯酶標(biāo)板的凹槽內(nèi)，使抗體吸附在酶標(biāo)板上，然后在B1板中加入酶標(biāo)抗原和待測(cè)抗原的混合物；在B2板中只加入與B1相同濃度的酶標(biāo)抗原，分別洗去未被吸附的