創(chuàng)新藥物學(xué)--特殊毒性評(píng)價(jià)課件

1、第一節(jié)：特殊毒性評(píng)價(jià)的目的和意義第二節(jié)：評(píng)價(jià)原則第三節(jié)：內(nèi)容和步驟第四節(jié)：致突變?cè)囼?yàn)第五節(jié)：生殖毒性試驗(yàn)第六節(jié)：致癌試驗(yàn)第七節(jié)：其他特殊毒性試驗(yàn)特殊毒性評(píng)價(jià)第一節(jié) 特殊毒性評(píng)價(jià)的目的和意義毒理學(xué)一般毒性評(píng)價(jià)急性毒性長(zhǎng)期毒性局部毒性特殊毒性評(píng)價(jià)遺傳毒性致癌性生殖毒性依賴性特殊毒性：主要包括遺傳毒性、致癌毒性和生殖毒性等，是新藥安全性評(píng)價(jià)的主要內(nèi)容之一，同時(shí)也是臨床前研究與評(píng)價(jià)中的重要內(nèi)容之一。特殊毒性研究就是研究對(duì)遺傳物質(zhì)是否有損傷，是否會(huì)引起腫瘤衰老及畸胎等。特殊毒性試驗(yàn)存在著種屬差異性、定性差異、定量差異等。特殊毒性研究的意義：可減少或避免致癌毒性、遺傳毒性和生殖毒性的產(chǎn)生和發(fā)展。第二節(jié) 評(píng)

2、價(jià)原則一、應(yīng)遵循試驗(yàn)研究管理規(guī)范藥物的遺傳、生殖和致癌毒性試驗(yàn)屬于安全性評(píng)價(jià)研究，根據(jù)中華人民共和國(guó)藥品管理法的規(guī)定，必須執(zhí)行藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范二、具體問題具體分析原則特殊毒性試驗(yàn)的設(shè)計(jì)應(yīng)該在對(duì)受試物認(rèn)知的基礎(chǔ)上，遵循具體問題具體分析的原則。根據(jù)藥物的理化性質(zhì)、已有的藥理毒理研究信息、適應(yīng)癥和適用人群特點(diǎn)，臨床用藥方案選擇合理的試驗(yàn)方法，設(shè)計(jì)適宜的試驗(yàn)方案，并綜合上述信息對(duì)試驗(yàn)就過進(jìn)行全面的分析第三節(jié) 內(nèi)容和步驟一、內(nèi)容按照新藥審評(píng)的基本要求，特殊毒性的評(píng)價(jià)包括以下內(nèi)容：（一）遺傳毒性（致突變）試驗(yàn)微生物回復(fù)突變?cè)囼?yàn)、哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)和整體試驗(yàn)（常選用微核試驗(yàn)）。作用于生

3、殖系統(tǒng)的藥物，需進(jìn)行動(dòng)物顯性致死試驗(yàn)（二）致癌試驗(yàn)所有新化合物都必須進(jìn)行致癌試驗(yàn)，并要與已知致癌化合物進(jìn)行比較研究，包括短期致癌試驗(yàn)和長(zhǎng)期致癌試驗(yàn)（三）生殖毒性（致畸）試驗(yàn)在動(dòng)物生殖過程中的不同階段給予受試物，觀察其對(duì)受試動(dòng)物生殖能力及其子代發(fā)育的影響二、步驟藥物特殊毒性的評(píng)價(jià)是一個(gè)長(zhǎng)期、細(xì)致的過程，不僅在新藥上市前需進(jìn)行必要的臨床前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，而且上市后還需經(jīng)臨床的觀察。實(shí)驗(yàn)室、臨床，反復(fù)印證，多次循環(huán)，才能使藥物的毒性獲得比較正確的評(píng)價(jià)。特殊毒性實(shí)驗(yàn)的步驟一般包括以下幾個(gè)方面：（一）實(shí)驗(yàn)條件的遵循根據(jù)中華人民共和國(guó)藥品管理法的規(guī)定，毒性試驗(yàn)研究必須執(zhí)行藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范。（二）受試物

4、的選擇受試物應(yīng)能充分代表臨床試驗(yàn)樣品和上市藥品。一般用中試或中試以上規(guī)模的樣品，并注明其名稱、來源、批號(hào)、含量（或規(guī)格）、保存條件及調(diào)配方法等。外用藥物和注射劑一般以制劑作為受試物。（三）動(dòng)物分組和劑量設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)組的組數(shù)及每組動(dòng)物數(shù)的設(shè)定，應(yīng)以能夠科學(xué)合理的解釋所獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，恰當(dāng)?shù)胤磻?yīng)有生物學(xué)意義的作用，并符合統(tǒng)計(jì)學(xué)要求為原則。一般可設(shè)三個(gè)劑量組，同時(shí)應(yīng)考慮采用合理的空白或陰性對(duì)照。必要時(shí)還應(yīng)設(shè)陽性對(duì)照。小動(dòng)物每組一般不少于10只，大動(dòng)物每組一般不少于6只。動(dòng)物一般要求雌雄各半。選擇劑量時(shí)，要參考其他毒性試驗(yàn)的結(jié)果，還要參考擬推薦臨床適用劑量和國(guó)外同類藥物的毒性劑量綜合進(jìn)行。（四）給藥途徑整

5、體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，首先應(yīng)考慮與臨床擬用給藥途徑一致。如果有多個(gè)臨床擬用途徑時(shí)，分別采用相應(yīng)的給藥途徑。對(duì)于在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中難以實(shí)施的特殊給藥途徑，可根據(jù)受試物的特點(diǎn)選擇，并說明理由。（五）給藥頻率和期限根據(jù)特殊毒性的實(shí)驗(yàn)特點(diǎn)，選擇適宜的給藥頻率和期限，應(yīng)根據(jù)具體情況合理設(shè)計(jì)給藥次數(shù)（六）檢測(cè)指標(biāo)的合理確定根據(jù)特殊毒性試驗(yàn)要求，合理確定檢測(cè)指標(biāo)。（七）實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析和綜合評(píng)價(jià)根據(jù)詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)記錄，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行定性和定量分析，并選用合適的統(tǒng)計(jì)方法。根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，并結(jié)合個(gè)體數(shù)據(jù)和其他安全性試驗(yàn)、有效性試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)其進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。（八）資料整理應(yīng)規(guī)范新藥的特殊毒性研究就是要保證臨床用藥的安全性。試驗(yàn)完成后，要嚴(yán)格按照

6、試驗(yàn)?zāi)康暮鸵饬x、基本原則、基本內(nèi)容和要求、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及可行性分析、試驗(yàn)中注意的問題等內(nèi)容進(jìn)行資料整理。第四節(jié) 致突變實(shí)驗(yàn) 致突變實(shí)驗(yàn)，亦為遺傳毒性試驗(yàn)，可分為體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。體外遺傳毒理實(shí)驗(yàn)方法包括鼠傷寒沙門菌誘變性實(shí)驗(yàn)、體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變實(shí)驗(yàn)、姐妹染色單體交換實(shí)驗(yàn)、SOS顯色實(shí)驗(yàn)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)包括動(dòng)物體內(nèi)骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)、哺乳動(dòng)物骨髓細(xì)胞染色體畸變實(shí)驗(yàn)、顯色致死實(shí)驗(yàn)和小鼠睪丸染色體畸變實(shí)驗(yàn)。但沒有任何單一實(shí)驗(yàn)方法能檢測(cè)出所有的遺傳毒性物質(zhì)。因此，通常采用體外和體內(nèi)遺傳毒性實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)組合方法，即體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)相結(jié)合、真核細(xì)胞與原核細(xì)胞相結(jié)合等，以減少遺傳毒性藥物的假陰性結(jié)果。這些實(shí)驗(yàn)相互補(bǔ)充

7、，既可以提高遺傳物質(zhì)的檢測(cè)能力，又為綜合考慮實(shí)驗(yàn)結(jié)果奠定基礎(chǔ)。一：鼠傷寒沙門菌回復(fù)突變實(shí)驗(yàn)二：體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變實(shí)驗(yàn)三：SOS顯色實(shí)驗(yàn)四：動(dòng)物體內(nèi)骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)五：顯性致死實(shí)驗(yàn)一、鼠傷寒沙門菌回復(fù)突變實(shí)驗(yàn)該實(shí)驗(yàn)是鼠傷寒沙門菌組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型回復(fù)突變實(shí)驗(yàn)的簡(jiǎn)稱，又稱Ames實(shí)驗(yàn)。（一）試驗(yàn)原理 本實(shí)驗(yàn)采用鼠傷寒沙門菌組氨酸缺陷突變株作為指示微生物，檢測(cè)藥物的致突變性。人工誘導(dǎo)的鼠傷寒沙門菌突變株在其組氨酸操縱子中有一個(gè)突變，突變菌株必須依賴外源性組氨酸才能生長(zhǎng)，而在無組氨酸的選擇性培養(yǎng)基上不能存活，誘導(dǎo)劑可使其基因發(fā)生回復(fù)突變，使它在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上也能生長(zhǎng)。計(jì)數(shù)誘發(fā)的回變菌落數(shù)即

8、可判斷藥物的誘變能力。（二）培養(yǎng)基制備1.營(yíng)養(yǎng)肉湯 營(yíng)養(yǎng)肉湯用于在液體條件增值培養(yǎng)細(xì)菌。以獲得用于實(shí)驗(yàn)的細(xì)菌培養(yǎng)液。 成分 牛肉浸膏 5g 蛋白胨 10g NaCl 5g 置燒瓶?jī)?nèi)加三重蒸餾水1000ml，依次加入上述成分，加熱助溶。特別注意等一種成分溶解后，再加另一種成分，待完全溶解后，冷卻至室溫（1530），用1mol/L NaOH調(diào)整PH為7.07.2。分裝于試管內(nèi)，封口，高壓滅菌后，置4冰箱放置備用。注意保存不得超過6個(gè)月。2.營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 用于分離、鑒定菌種及制作斜面保存菌種。成分 營(yíng)養(yǎng)肉湯 瓊脂 2g 三重蒸餾水 100g 將上述配料置入試驗(yàn)容器中，加熱溶解瓊脂，經(jīng)高壓滅菌20分

9、鐘，冷至70左右，倒入平皿，每皿25ml左右。3.上層培養(yǎng)基 0.5mmol/L氫氯組氨酸/生物素混合液：稱取L-氫氯組氨酸（分子質(zhì)量：209.63Da）10.48mg，放入100ml容量瓶中。取D-生物素（分子質(zhì)量：244.31Da）12.216mg加入一燒杯中，放入20ml三重蒸餾水，加熱煮沸至生物素完全溶解后，移入容量瓶?jī)?nèi)。并溶解組氨酸，反復(fù)沖洗盛生物素的燒杯34次，依次移入容量瓶中，最后用雙蒸水將溶液體積補(bǔ)至100ml，混勻后，4冰箱保存?zhèn)溆?。成?瓊脂粉 0.6g NaCl 0.5g 0,5mmol/L氫氯組氨酸/生物素混合液 10ml 三重蒸餾水 補(bǔ)至100ml 上述成分依次加入三

10、角燒瓶中，棉塞封口，高壓滅菌15分鐘，備用。4.底層基本培養(yǎng)基 成分 VB液（10） 50ml 葡萄糖水溶液（20%） 50ml 瓊脂 7.5g 取VB液（10）50ml，加入三重蒸餾水400ml,用1mol/LNaOH調(diào)整ph為7.0。然后加入瓊脂7.5g，高壓滅菌20分鐘后，待冷至80左右時(shí)，趁熱加入20葡萄糖50ml,用兩個(gè)500ml三角燒瓶來回混勻4-5次，澆制平板。 5.兩種富含組氨酸的主平板 制備底層培養(yǎng)基后，冷卻至50，加入不同成分，混勻，倒入平皿內(nèi)，冷后可制得主平板。（三）測(cè)定步驟1.選擇菌株 2.細(xì)胞培養(yǎng) 3.冷凍保存4.主平板保存 5.斜面保存 6.菌株的分離培養(yǎng)7.實(shí)驗(yàn)菌

11、株的鑒定 8.誘變性實(shí)驗(yàn)（四） 受試驗(yàn)所誘發(fā)的回變菌落數(shù)增加為自發(fā)對(duì)照的2倍或以上，并有劑量效應(yīng)關(guān)系?；蛎繙y(cè)試點(diǎn)（菌落數(shù)）為自發(fā)對(duì)照的2倍或以上，呈現(xiàn)可重復(fù)的并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的增加。符合上述一條即可判為陽性。二：體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)（一）原理 在細(xì)胞分裂的中期進(jìn)行染色體畸變的觀察和分析。為收集足夠的中期細(xì)胞相，在收獲細(xì)胞前，用秋水仙堿或乙酰甲基秋水仙堿處理，以阻斷微管蛋白的聚合，抑制細(xì)胞分裂時(shí)紡錘體的形成。使分裂間期和前期的細(xì)胞停留在中期相。低滲處理細(xì)胞，使染色體均勻散開，然后固定、染色，可在油鏡下觀察。（二）測(cè)定步驟 1.細(xì)胞 常選用中國(guó)倉鼠CHL細(xì)胞株，需定期檢查核型及是否有支原體

12、污染等。-80或液氮保存。2.濃度設(shè)置 至少設(shè)3個(gè)濃度組。高濃度以40%細(xì)胞生長(zhǎng)抑制為基準(zhǔn)，中、低濃度組可采用倍量稀釋法，最低濃度不得小于有效濃度。3.代謝活化 采用藥酶誘導(dǎo)劑處理后的哺乳動(dòng)物肝微粒體酶（S9）進(jìn)行體外代謝活化實(shí)驗(yàn)，即在加S9mix和不加S9mix平行的條件下測(cè)試。4.藥物作用時(shí)間 在非代謝活化條件下，藥物和細(xì)胞分別作用24小時(shí)和48小時(shí)收獲細(xì)胞；而在代謝活化條件下，藥物和細(xì)胞接觸至少6小時(shí)以上。5.對(duì)照 每批實(shí)驗(yàn)必須設(shè)空白對(duì)照、溶劑對(duì)照、陽性對(duì)照和S9平行對(duì)照。6.收獲時(shí)間 在第一次實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞應(yīng)在有和無代謝活化條件下染毒36小時(shí)，并在染毒開始后約1.5倍的正常周期時(shí)采樣。7.

13、染色體制備 在收獲前以秋水仙素或秋水仙堿處理細(xì)胞培養(yǎng)物24小時(shí)。8.染色體分析 （1）染色體數(shù)目畸變：非整倍體、多倍體 （2）染色體結(jié)果異常（三）結(jié)果評(píng)定三：SOS顯色實(shí)驗(yàn)（一）原理 遺傳毒物損傷細(xì)菌DNA會(huì)誘發(fā)一系列表現(xiàn)，包括修復(fù)增加、誘導(dǎo)活性增高、原噬菌體誘導(dǎo)以及細(xì)胞分裂中止，這些功能統(tǒng)稱為SOS應(yīng)答，它由細(xì)胞染色體上基因的SOS調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控。(二)操作步驟1.SOS比色實(shí)驗(yàn)（定量實(shí)驗(yàn)）2.-半乳糖苷酶測(cè)定3.堿性磷酸酶（AP）測(cè)定4.對(duì)照5.酶活性測(cè)定與計(jì)算 酶活性=1000A420/t6.判斷標(biāo)準(zhǔn) 如果一個(gè)化合物實(shí)驗(yàn)結(jié)果滿足下列條件，就可以認(rèn)為對(duì)大腸埃希菌SOS修復(fù)系統(tǒng)具有誘導(dǎo)性。誘導(dǎo)

14、因子大于1.5；-半乳糖苷酶活性比試劑對(duì)照組顯著增高；受試物濃度與誘導(dǎo)因子之間存在劑量反應(yīng)關(guān)系；結(jié)果具有重復(fù)性。四：動(dòng)物體內(nèi)骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)（一）原理微核實(shí)驗(yàn)是用于染色體損傷和干擾細(xì)胞有絲分裂的化學(xué)毒物的快速檢測(cè)方法。一般認(rèn)為微核是細(xì)胞內(nèi)染色體斷裂或紡錘體受影響而在細(xì)胞有絲分裂后期滯留在細(xì)胞核外的遺傳物質(zhì)。所以，微核實(shí)驗(yàn)?zāi)軝z測(cè)化學(xué)毒物或物理因素誘導(dǎo)產(chǎn)生的染色體完整性改變和染色體分離改變這兩種遺傳學(xué)終點(diǎn)。（二）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠是微核實(shí)驗(yàn)的常用動(dòng)物，也可用大鼠。通常用712周齡，體重2530g的小鼠或體重為150200g的大鼠。每組用兩種性別的動(dòng)物至少各5只或每組雄小鼠不少于6只。（三）劑量及分組受試

15、物應(yīng)設(shè)三個(gè)劑量組，高劑量組原則上以1/2LD50為基準(zhǔn)，分別取1/4LD50和1/8LD50作為中、低劑量組，亦可參照藥物的ED50，或臨床擬用劑量來設(shè)計(jì)。（四）操作步驟1.受試物配制 2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的處理3.標(biāo)本制備 4.閱片（五）結(jié)果評(píng)價(jià) 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)結(jié)果微核率有明顯的劑量關(guān)系并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，即可確認(rèn)為陽性結(jié)果。 若統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異有顯著性，但無劑量反應(yīng)關(guān)系時(shí)，則需進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果能重復(fù)者可確定為陽性。 五：顯性致死實(shí)驗(yàn)（一）原理發(fā)育中的精子或卵子受藥物作用后可發(fā)生染色體損傷，使受精卵在發(fā)育過程中死亡，引起顯性致死的染色體損傷主要包括單純的染色體斷裂或具有重組的染色體斷裂。有的染

16、色體損傷的卵裂球可形成畸形的桑葚胚或胚芽，由于受損程度不同，有的在到達(dá)子宮前死亡，有的在子宮著床后不久死亡。因此，顯性致死的主要觀察指標(biāo)是受孕、植入前丟失和胚胎早期死亡。（二）動(dòng)物與分組1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 要求用810周齡、體重3035g的小鼠或200g以上的大鼠。需3050只雄鼠、500600只未交配的雌鼠。2.劑量和分組 一般設(shè)三個(gè)實(shí)驗(yàn)劑量組，一個(gè)陽性對(duì)照組和一個(gè)陰性對(duì)照組。每組10只雄鼠。實(shí)驗(yàn)中高劑量為最大耐受劑量（MTD）(三)操作步驟1.給藥與交配 可采用腹腔注射、灌胃、吸入等給藥途徑。當(dāng)天開始交配，用1只雄鼠與23只雌鼠同籠，每6天更換雌鼠，1天后讓雄鼠與第二批雌鼠交配，如此進(jìn)行56批。

17、2.觀察結(jié)果 將雌鼠于開籠的第17天脫臼處死，剖腹檢查。3.數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析（四）注意事項(xiàng)1.動(dòng)物 雌性動(dòng)物應(yīng)選擇健康、成年未生育過的動(dòng)物。每組每周至少有20只受孕母鼠的要求。2.劑量 劑量太小，不易獲得陽性結(jié)果；劑量太大，會(huì)使動(dòng)物死亡或降低雄鼠的交配能力。可通過預(yù)實(shí)驗(yàn)選擇合劑量。3.條件 應(yīng)滿足SPF級(jí)飼養(yǎng)條件。本實(shí)驗(yàn)最好在春、秋季進(jìn)行，以提高動(dòng)物交配受孕率。第五節(jié) 生殖毒性試驗(yàn)一般生殖毒性試驗(yàn)致畸敏感期試驗(yàn)圍生期試驗(yàn)生殖毒性試驗(yàn)（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簷z測(cè)受試物與動(dòng)物接觸后，對(duì)動(dòng)物的性腺功能、交配能力等的影響。（二）動(dòng)物及劑量選擇：一般選擇大鼠或小鼠，也可選用家兔。一.一般生殖毒性試驗(yàn)（三）劑量設(shè)計(jì)一

18、般設(shè)3個(gè)劑量，另設(shè)空白對(duì)照組，受試物中含有溶劑時(shí)有時(shí)需要設(shè)溶劑對(duì)照組，以檢驗(yàn)溶劑對(duì)動(dòng)物生殖的影響，為了更確切地說明試驗(yàn)結(jié)果必要時(shí)設(shè)陽性對(duì)照組。每組雌雄各20只以上動(dòng)物，雌性動(dòng)物可多一些，以保障有一定的子代數(shù)量，順利完成子代的試驗(yàn)。（四）給藥及給藥周期給藥期應(yīng)充分考慮生殖細(xì)胞發(fā)育的過程，最少應(yīng)給予一個(gè)生殖細(xì)胞的發(fā)育周期，雌性動(dòng)物至少兩個(gè)性周期。雄性小、大鼠一般在出生后3540天開始給藥，給藥后6080天后開始交配，雌性動(dòng)物應(yīng)給藥兩周后開始交配，并繼續(xù)給藥至多數(shù)器官形成，一般為妊娠后6天。（五）試驗(yàn)過程將大鼠或小鼠按雌、雄2:1或1:1的比例，每天下午45點(diǎn)以后同籠自然交配，為了提高受精的成功率，

19、可以對(duì)雌性動(dòng)物進(jìn)行動(dòng)情期誘導(dǎo)，將一只雄鼠與雌鼠同籠隔離，同籠隔離生活兩天，然后再交配，以使雌鼠發(fā)情期一致。為了增加受孕成功率，也可做陰道分泌物涂片檢查，以保證雌鼠在動(dòng)情期進(jìn)行交配。家兔妊娠一般依靠子宮觸摸來確定，多在妊娠后十幾天才能確定，但在確定之前就要分組給藥。（六）藥后觀察每日觀察親代動(dòng)物的生存情況，包括精神、行為、活動(dòng)，觀察動(dòng)物的可視黏膜、皮毛等，特別注意觀察妊娠動(dòng)物有無流產(chǎn)，定期稱量動(dòng)物的體重，稱量動(dòng)物的飲食，測(cè)量動(dòng)物的飲水。雄兔交配完成后處死，去附睪精子進(jìn)行精子計(jì)數(shù)、精子活動(dòng)能力檢查。計(jì)算附睪、睪丸重量及系數(shù)，睪丸進(jìn)行組織學(xué)檢查，重點(diǎn)觀察曲細(xì)精管內(nèi)精子的發(fā)育過程。記錄仔鼠出生24小時(shí)

20、的死、活仔鼠數(shù)，仔鼠體重，性別，觀察性別及外觀畸形，部分仔鼠可進(jìn)行胎兒形態(tài)學(xué)檢查，包括內(nèi)臟和骨骼檢查。（七）結(jié)果及統(tǒng)計(jì)合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)能在該試驗(yàn)中得到大量的藥物與動(dòng)物機(jī)體作用的信息，包括母體反應(yīng)、交配情況、受孕情況、子代生長(zhǎng)發(fā)育情況。（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康臋z測(cè)妊娠動(dòng)物在胚胎器官形成期接觸受試物，受試物對(duì)胚胎發(fā)育的影響。（二）動(dòng)物及給藥劑量可選用大鼠、小鼠、和家兔來進(jìn)行，一般選擇小鼠。受試物一般設(shè)3個(gè)劑量組，另設(shè)一空白對(duì)照組。（三）給藥方法胚胎對(duì)藥物的敏感性因不同種動(dòng)物胚胎的發(fā)育階段而異，應(yīng)選擇在器官形成期。二.致畸敏感期試驗(yàn)（四）觀察指標(biāo)1.母鼠 觀察記錄母鼠的精神、行為、飲食、體重，注意觀察有無流產(chǎn)等

21、。2.仔體 計(jì)數(shù)胚胎數(shù)量、性別，記錄仔體重量，進(jìn)行外觀檢查，記錄有無血腫，頭部有無異常等。（五）骨骼檢查進(jìn)行外觀檢查后隨機(jī)抽取1/2胎鼠進(jìn)行骨骼檢查，將胎鼠置入75%乙醇中固定2天，再在氫氧化鉀溶液中透明，經(jīng)茜素紅染色后進(jìn)行骨骼檢查。（六）仔體內(nèi)部臟器檢查進(jìn)行外觀檢查后隨機(jī)抽取1/2胎鼠進(jìn)行頭部及內(nèi)部臟器檢查，將胎鼠在Bouin液中固定，胸腔臟器可在非固定胎鼠上進(jìn)行檢查；其余臟器在固定后的胎鼠上檢查。（七）結(jié)果及統(tǒng)計(jì)應(yīng)記錄交配率、剖檢母體動(dòng)物數(shù)、孕期母體增重等。通過統(tǒng)計(jì)，最后確定受試物是否有致畸作用時(shí)還要考慮劑量關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)室該種動(dòng)物正?；ヂ屎突温实?。（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谀阁w懷孕胚胎器官形成期

22、后給藥，主要觀察胎兒在母體內(nèi)發(fā)育情況、胎兒出生后發(fā)育情況、母體分娩情況、帶乳情況等。（二）動(dòng)物及給藥劑量基本原則同致畸敏感期實(shí)驗(yàn)。（三）給藥方法大鼠一般在妊娠后的15天開始給藥，直至分娩后的第28天。小鼠則在妊娠后的15天開始，至分娩后21天。家兔在妊娠后22天開始，至分娩后的31天。三.圍生期試驗(yàn)（四）藥后觀察1、一般觀察 2.仔鼠 出生后24小時(shí)計(jì)算死、活仔鼠數(shù)，仔鼠體重，性別等。3.下一代斷乳前發(fā)育情況4.觀察子代肢體反射的出現(xiàn)5.下一代斷乳后運(yùn)動(dòng)和學(xué)習(xí)能力的測(cè)定6.下一代生殖行為試驗(yàn)（五）結(jié)果及統(tǒng)計(jì)記錄母鼠體重、飲水、食料量、產(chǎn)仔數(shù)、仔鼠存活率等，對(duì)仔鼠的生理發(fā)育、斷乳后的行為能力、學(xué)

23、習(xí)能力作綜合性評(píng)價(jià)。 第六節(jié) 致癌試驗(yàn)致癌試驗(yàn)的研究，也是藥物安全性評(píng)價(jià)的重要方面。外源性化學(xué)物致癌性的評(píng)價(jià)方法與模型，大致可分為：1、短期致突變性和致癌性篩選實(shí)驗(yàn)2、體外轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)3、促癌劑與共致癌劑評(píng)價(jià)4、有限致癌實(shí)驗(yàn)5、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型6、長(zhǎng)期致癌實(shí)驗(yàn)（一）基本原理體外細(xì)胞轉(zhuǎn)化以致癌物誘發(fā)細(xì)胞核型改變?yōu)閮?nèi)因，細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化為檢測(cè)終點(diǎn)，在此過程中發(fā)生細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞生長(zhǎng)能力、生化表型及動(dòng)物體內(nèi)成瘤能力的改變。一般認(rèn)為，相對(duì)于體內(nèi)致癌作用來說，細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)比其他短期測(cè)試更加可靠。由于對(duì)轉(zhuǎn)化集落形態(tài)的判定存在主觀誤差，因此在形態(tài)表型轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)之后，應(yīng)結(jié)合染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)、細(xì)胞生長(zhǎng)能力、動(dòng)物體內(nèi)成瘤能力

24、等的變化進(jìn)行分析，以動(dòng)物接種致瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果最為可靠。一、敘利亞地鼠胚胎細(xì)胞體外惡性轉(zhuǎn)化試驗(yàn)所以，細(xì)胞體外惡性轉(zhuǎn)化試驗(yàn)觀察受試物與細(xì)胞接觸后，導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的危險(xiǎn)，觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)化成具有腫瘤細(xì)胞性質(zhì)的突變細(xì)胞。該試驗(yàn)可檢測(cè)遺傳性致癌物和非遺傳性致癌物，直接反映體外對(duì)受試細(xì)胞的致癌作用。（二）敘利亞地鼠胚胎細(xì)胞制備孕后1214天敘利亞地鼠，打擊頭部致死，酒精消毒，無菌條件下分離子宮，取出胎鼠，去除四肢、頭、內(nèi)臟，洗凈，將軀干剪成1mm3的小塊，用胰蛋白酶消化，過尼龍網(wǎng)去除殘?jiān)?，濾過液體離心，棄去上清液，沉淀物中加入細(xì)胞培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞濃度，培養(yǎng)3天后收獲細(xì)胞，對(duì)收獲的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化的敏感性試驗(yàn)，對(duì)已知陽

25、性物轉(zhuǎn)化試驗(yàn)符合要求的細(xì)胞用液氮凍存，備用。（三）細(xì)胞轉(zhuǎn)化培養(yǎng)凍存的細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)，將凍存細(xì)胞進(jìn)行滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)和靶細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)24小時(shí)后可細(xì)胞染毒，進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。受試物的劑量可根據(jù)受試物對(duì)細(xì)胞的毒性來確定，一般以引起半數(shù)細(xì)胞死亡的劑量（濃度）作為最高劑量，并依次半量遞減，試驗(yàn)一般設(shè)57個(gè)濃度。在有些情況下，劑量可不依此設(shè)計(jì)，如受試物受溶解度（包括使用無細(xì)胞轉(zhuǎn)化作用的助溶劑）的限制，有時(shí)達(dá)不到半數(shù)細(xì)胞死亡的濃度。還有一些低細(xì)胞毒的物質(zhì)，在明顯高于臨床可能接觸劑量的情況下，也可達(dá)不到半數(shù)細(xì)胞死亡的濃度。（四）觀察報(bào)告將細(xì)胞固定、染色、分別計(jì)算集落形成率和轉(zhuǎn)化率公式如下：集落形成率（%）=

26、（集落數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）100%集落轉(zhuǎn)化率（%）=（轉(zhuǎn)化集落數(shù)/集落數(shù)）100%（五）判定1、有明確的劑量效應(yīng)；2、若無劑量效應(yīng)，但在2個(gè)或2個(gè)以上的濃度中發(fā)生細(xì)胞轉(zhuǎn)化；3、在單一劑量下出現(xiàn)3個(gè)或3個(gè)以上的轉(zhuǎn)化集落時(shí)。符合上述任一條件者可判為陽性，否則為陰性。如判定有困難時(shí)，應(yīng)進(jìn)一步對(duì)細(xì)胞進(jìn)行核型分析、軟瓊脂接種等觀察判定，必要時(shí)可做動(dòng)物接種生瘤試驗(yàn)。二、嚙齒類致癌實(shí)驗(yàn)（一）基本原理嚙齒類致癌實(shí)驗(yàn)（RCB）是在受試物的結(jié)構(gòu)活性關(guān)系、多種體外致突變實(shí)驗(yàn)與短期動(dòng)物致癌實(shí)驗(yàn)等多種實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行的致癌實(shí)驗(yàn)，是判斷化學(xué)物是否是動(dòng)物致癌物的唯一依據(jù)。RCB基本實(shí)驗(yàn)步驟為：每日經(jīng)一定途徑給各個(gè)組動(dòng)物一定劑量的受試物，接觸期為動(dòng)物預(yù)期壽命的大部分時(shí)間。接觸期間每天觀察各種癥狀并間隔一定時(shí)間稱量體重和做必要的實(shí)驗(yàn)檢查。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)處死動(dòng)物，進(jìn)行大體解剖及適當(dāng)?shù)慕M織病理學(xué)檢查觀察其腫瘤發(fā)生情況。（二）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)1、實(shí)驗(yàn)人員及其職責(zé) 在開展RCB之前，毒理學(xué)家、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物專家、病檢人員、統(tǒng)計(jì)人員、化學(xué)分析人員應(yīng)密切合作，詳細(xì)收集相關(guān)的實(shí)驗(yàn)資料，并撰寫相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)方案。2、受試物（1）需進(jìn)行RCB的藥物：RCB耗時(shí)耗力，僅僅當(dāng)人體的藥物接觸情況需要得到動(dòng)物終身研究的資料以評(píng)價(jià)其潛在致癌性時(shí)，才應(yīng)進(jìn)行致癌實(shí)驗(yàn)。確定某一新藥是否需要進(jìn)展長(zhǎng)期致