動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)(同名218)課件

1、第三節(jié) 細(xì)胞工程技術(shù)制藥1.動物細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)室操作技術(shù) 2.植物細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)室操作技術(shù) 一、細(xì)胞培養(yǎng)基本概念 從體內(nèi)組織取出細(xì)胞，在體外模擬體內(nèi)環(huán)境下，使其生長繁殖，并維持其結(jié)構(gòu)和功能的一種培養(yǎng)技術(shù)?？梢允菃蝹€細(xì)胞，也可以是細(xì)胞群 二、細(xì)胞培養(yǎng)目的與用途生物藥物研究及生產(chǎn)新藥篩選：如化學(xué)合成藥物藥效研究、中藥有效成分篩選與鑒定等。 疫苗研究與生產(chǎn)：如病毒性疫苗的研究與生產(chǎn)（肝炎病毒疫苗、艾滋病疫苗等）、腫瘤疫苗(多肽疫苗)等。基因工程藥物研究與生產(chǎn)：如干擾素研究與生產(chǎn)，細(xì)胞生長因子研究與生產(chǎn)等。細(xì)胞工程藥物研究與生產(chǎn)：生物活性多肽研究與生產(chǎn)，人參皂甙、紫杉醇等生物活性成分研究與生產(chǎn)。單克隆

2、抗體制備：包括診斷用單克隆抗體，治療用單克隆抗體?；A(chǔ)研究藥物作用機(jī)理基因功能疾病發(fā)生機(jī)理三、細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)施和基本條件實(shí)驗(yàn)室設(shè)計 細(xì)胞培養(yǎng)室和設(shè)計原則：防止微生物污染和有害因素影響，要求工作環(huán)境 清潔、空氣清新，干燥和無煙塵。細(xì)胞培養(yǎng)工作包括：工作液配制、無菌操作（采樣）、溫育、無菌處理，細(xì)胞和用品貯存等。細(xì)胞培養(yǎng)室的設(shè)計實(shí)施原則一般是無菌操作區(qū)設(shè)在室內(nèi)較少走動的內(nèi)側(cè)，常規(guī)操作和封閉培養(yǎng)于一室，而洗刷消毒在另一室 普通細(xì)胞培養(yǎng)一角細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)普通細(xì)胞培養(yǎng)室內(nèi)走廊萬級層流細(xì)胞培養(yǎng)室常用設(shè)施及設(shè)備 超凈工作臺：凈化工作臺 無菌操作間：一般由更衣間、緩沖間和操作間三部分組成。操作間放置凈化工作 臺及二氧

3、化碳培養(yǎng)箱、離心機(jī)、倒置顯微鏡等。緩沖間可放置電冰箱、冷藏器及消毒好的無 菌物品等。 操作間：普通培養(yǎng)箱、離心機(jī)、水浴鍋、定時鐘、普通天平及日常分析處理物品。 洗刷消毒間：烤箱、消毒鍋、蒸餾水處理器及酸缸等。分析間：顯微鏡、計算機(jī)及打印機(jī)等。 培養(yǎng)器皿 液體儲存瓶：用于儲存各種配制好的培養(yǎng)液、血清等液體。 培養(yǎng)瓶：用于細(xì)胞傳代培養(yǎng)的細(xì)胞要求瓶壁厚簿均勻，便于細(xì)胞貼壁生長和觀察，瓶口要大小一致，口徑一般不小于1cm，允許吸管伸入瓶內(nèi)任何部位。培養(yǎng)皿：用于開放式培養(yǎng)及其它用途。 吸管：常用的有長吸管和短吸管兩類，長吸管也稱刻度吸管。短吸管也叫滴管， 分彎頭和直頭兩種。 離心管：根據(jù)用途不同形態(tài)各樣

4、，常用 于細(xì)胞培養(yǎng)的離心管有大腹式尖底離心管和普通尖底離心管兩類。 培養(yǎng)用品的清洗與消毒 在組織細(xì)胞培養(yǎng)中，體外細(xì)胞對任何有害物質(zhì)都非常敏感。微生物產(chǎn)品附帶雜物，上次細(xì)胞殘留物及非營養(yǎng)成分的化學(xué)物質(zhì)，均能影響培養(yǎng)細(xì)胞的生長。對新使用和重新使用 的培養(yǎng)器皿都要嚴(yán)格徹底的清洗，且要根據(jù)器皿的組成材料不同，選擇不同的清洗方法 培養(yǎng)用品的清洗與消毒 玻璃器皿的清洗 清洗過程：浸泡、刷洗、侵酸和沖洗。清洗后的玻璃器皿不僅要求干凈透明無油跡，而且不能殘留任何物質(zhì) 浸泡新的初次使用的玻璃器皿：玻璃表面帶有大量灰 塵，且玻璃表面常呈堿性及帶有一些對細(xì)胞有害的物質(zhì)等。新瓶使用前應(yīng)先用自來水簡單刷洗，然后用稀鹽酸

5、液浸泡過夜，以中和其中的堿性物質(zhì)。再次使用的玻璃器皿則常附有大量剛使用過的蛋白質(zhì)，干固后不易洗掉，故用后要立即浸入水中，且要求完全浸入，不能留有氣泡或浮在液面上。 浸酸清潔液是由重鉻酸鉀、濃硫酸和蒸餾水按一定比例配制而成，其處理過程稱為浸酸。清潔液對玻璃器皿無腐蝕作用，而其強(qiáng)氧化作用可除掉刷洗不掉的微量雜質(zhì)。浸泡時器皿要充滿清潔液，勿留氣泡或器皿露出清潔液面。浸泡時間一般為過夜，不應(yīng)少于 6 小時。 清潔液配制的強(qiáng)度，常用的下列三種： 強(qiáng)清潔液：重鉻酸鉀63g ，濃硫酸1000ml ，蒸餾水200 ml次強(qiáng)清洗液：重鉻酸鉀120g ，濃硫酸200ml ，蒸餾水1000 ml弱清潔液：重鉻酸鉀1

6、00 g ，濃硫酸100 ml ，蒸餾水1000 ml配制過程注意事項配制過程中可使重鉻酸鉀溶于水中，然后慢慢加濃硫酸。不停的用玻璃棒攪拌， 使產(chǎn)生的熱量揮發(fā)配制溶液應(yīng)選擇塑料制品。配成后清潔液一般為棕紅色 沖洗沖洗最好用洗滌裝置。即省力、效果又好。用手工操作，則需流水沖洗 十次以上，每天水須灌滿及倒干凈，最好用蒸餾水清洗 3-5 次，晾干備用 膠塞的清洗 新購置的瓶塞帶有大量滑石粉及雜質(zhì)，應(yīng)先用自來水沖洗，再做常規(guī)處理常規(guī)清洗方法：每次用后立即置入水中浸泡，然后用 2% NaOH 或洗衣粉煮沸 1020 分鐘，以除掉培養(yǎng)中的蛋白質(zhì)。1%稀鹽酸浸泡 30 分鐘或蒸餾水沖洗后煮沸 1020 分鐘

7、，晾干備用。 塑料制品的清洗 塑料自制品現(xiàn)多是采用無毒并已經(jīng)特殊處理的包裝，打開包裝即可用，多為一次性物品。必要時用 2% NaOH 浸泡過夜，用自來水充分沖洗，再用 5%鹽酸溶液浸泡 30 分鐘，最后用自 來水和蒸餾水沖洗干凈，晾干備用。 消毒 常見的原因操作間或周圍空間的不潔培養(yǎng)器皿和培養(yǎng)液消毒不 合格或不徹底由于有關(guān)培養(yǎng)的每個環(huán)節(jié)的失誤均能導(dǎo)致培養(yǎng)失敗，故細(xì)胞培養(yǎng)的每個環(huán)節(jié) 都應(yīng)嚴(yán)格遵守操作常規(guī)，防止發(fā)生污染 消毒 紫外線消毒 對象：用于空氣，操作臺表面和不能使用其它法進(jìn)行消毒和培養(yǎng)器皿。培養(yǎng)室紫外線燈應(yīng)距地面不超過 2.5 米，且消毒物品不宜相互遮檔，照射不到的地方起不到消毒作用。 紫

8、外線可產(chǎn)生臭氧，污染空氣，試劑及培養(yǎng)液都有不良影響，對人皮膚也有傷害，不宜近照射也進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。 消毒 濕熱消毒消毒物品不能裝得過滿，以防止消毒器內(nèi)氣體阻塞而千百萬危險，保證其內(nèi)氣體的流通。在加熱升壓之前，先要打開排氣閥門排放消毒器內(nèi)的冷空氣，冷氣空氣排出后，關(guān)閉排 氣閥門，同時檢驗(yàn)安全閥活動自如，繼后開始升壓，當(dāng)達(dá)到所需壓力時，開始記算消毒時間。 消毒過程中，操作者不能離開工作崗位，要定時檢查壓力及安全，防止意外事件發(fā)生。 消毒 化學(xué)消毒法最常見的是70%酒精及1的新潔而滅，前者主要用于操作者的皮 膚，操作臺表面及無菌室內(nèi)的壁面處理。后者則主要用器械的浸泡及皮膚和操作室壁面的擦 試消毒。抗生

9、素消毒 主要用于培養(yǎng)用液滅菌或預(yù)防培養(yǎng)物污染。 四、動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)原代培養(yǎng)技術(shù) 動物細(xì)胞傳代培養(yǎng)技術(shù) 原代培養(yǎng)技術(shù)又稱為初代培養(yǎng)，是指從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)一直到第一次傳代階段，一般持續(xù)l4周 原代培養(yǎng)的基本過程包括取材、培養(yǎng)材料的制備、接種及培養(yǎng)等步驟。原代培養(yǎng)的方法很多，最基本和最常用的是組織塊培養(yǎng)法和分離細(xì)胞培養(yǎng)法 1、組織塊培養(yǎng)法組織塊原代培養(yǎng)過程 取材用培養(yǎng)液濕潤所取組織材料，并用鋒利的眼科剪將附在其上的脂肪和結(jié)締組織去除干凈。再用平衡鹽溶液PBS或Hanks液漂洗；切碎用鋒利的眼科彎剪將組織塊剪成長1mm、寬1mm、厚0.5mm的小塊；再用PBS液或Hanks液漂洗多次，直至液體

10、不混濁、無油滴、清亮為止。 貼瓶用濕潤的吸管吸取切碎的組織塊，輕輕吹到培養(yǎng)瓶皿中，并將其按一定間距均勻擺放在培養(yǎng)瓶底壁上，量不要過多。要將組織塊切面貼在培養(yǎng)瓶底壁上。 加營養(yǎng)液將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)，使瓶底朝上，在種植了組織塊一側(cè)的對側(cè)面加足培養(yǎng)液，勿使組織塊與培養(yǎng)液接觸，塞緊瓶塞 干固將種植了組織塊的一側(cè)朝上，靜置于37培養(yǎng)箱中；培養(yǎng)待組織塊貼壁lh3h后翻瓶，使貼壁的組織塊浸沒于培養(yǎng)液中，靜置。每隔2天3天更換一次培養(yǎng)液，或者根據(jù)培養(yǎng)液顏色的變化確定換液時間 操作過程注意事項組織塊接種后的前3天，從組織塊向外遷移的細(xì)胞數(shù)很少，組織塊的粘附不牢固，在觀察和移動過程中，注意不要引起液體的振蕩。要避免經(jīng)常

11、翻動或振動，否則組織塊不易附著在瓶壁上或附著后也會脫落漂起。 加入的培養(yǎng)液不易過多，避免浸泡的組織塊受輕微的波動而脫落下來 操作過程注意事項用組織塊培養(yǎng)時，要及時觀察，當(dāng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞向外遷移出來后要記錄并去除漂浮的組織塊和殘留的細(xì)胞，因?yàn)橐哑〉慕M織塊和那些細(xì)胞碎片已死亡，它們產(chǎn)生的有毒物質(zhì)會影響原代細(xì)胞的生長，要及時清除。 操作過程注意事項為促進(jìn)組織塊盡快粘貼在培養(yǎng)瓶皿上，可以在接種前先將膠原薄層涂在培養(yǎng)瓶底壁上。細(xì)胞培養(yǎng)過程中，膠原中的促細(xì)胞貼附因子先吸附于培養(yǎng)瓶底壁上，懸浮的圓形細(xì)胞再與已吸附有促細(xì)胞帖附因子的底壁附著。 、消化培養(yǎng)法將妨礙細(xì)胞生長的細(xì)胞間質(zhì)、纖維等用相關(guān)的消化酶除去，使細(xì)胞

12、分散，形成懸液，易從外界吸收養(yǎng)分和排出代謝產(chǎn)物，可以很快得到大量活細(xì)胞，細(xì)胞在短時間內(nèi)生長成片。 、消化培養(yǎng)法懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的兩種形式體外培養(yǎng)這種細(xì)胞或微生物時，可以通過對培養(yǎng)液以及其中的細(xì)胞進(jìn)行不斷攪拌或者對培養(yǎng)器皿進(jìn)行振蕩、快速旋轉(zhuǎn)而維持細(xì)胞的懸浮狀態(tài)；一些細(xì)胞無需攪拌或用搖床搖動，只要在培養(yǎng)器皿表面涂上一層不利于細(xì)胞粘附的硅脂即可維持懸浮狀態(tài)。、消化培養(yǎng)法原代培養(yǎng) 貼壁培養(yǎng)過程、消化培養(yǎng)法制備細(xì)胞懸液：從動物胚胎或動物體獲取臟器組織，剪成長1mm、寬1mm、厚0.5mm的小塊，用胰酶消化分散，制備細(xì)胞懸液。調(diào)整密度：計數(shù)并用培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度，用培養(yǎng)液稀釋成21057105ml的細(xì)胞懸液。

13、 接種：分裝入培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板內(nèi)置37 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、消化培養(yǎng)法培養(yǎng)形式一：在培養(yǎng)器皿內(nèi)放人一個有聚四氯乙烯包被的磁棒。將培養(yǎng)器皿封口，送人恒溫箱內(nèi)。在磁力攪拌器上邊攪拌邊培養(yǎng) 形式二：細(xì)胞接種在培養(yǎng)瓶或試管內(nèi)，封口后可將培養(yǎng)器皿固定在恒溫?fù)u床上，邊搖動邊培養(yǎng)，無需放置磁棒 形式三：接種于預(yù)先用硅脂包被過的培養(yǎng)器內(nèi)在培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)換培養(yǎng)液：培養(yǎng)液略呈黃色時換液。吸出部分舊培養(yǎng)液（一般為培養(yǎng)液的1/31/2），加人新鮮培養(yǎng)液即可 動物細(xì)胞傳代培養(yǎng)技術(shù)“傳代培養(yǎng)”或“繼代培養(yǎng)”組織細(xì)胞經(jīng)過原代培養(yǎng)，細(xì)胞分裂繁殖，培養(yǎng)物逐漸增多長滿培養(yǎng)空間，繼而相互間接觸發(fā)生接觸性抑制，生長速度逐漸減慢甚至停

14、止。需要將培養(yǎng)物分割，重新接種到培養(yǎng)瓶內(nèi)進(jìn)行再培養(yǎng)。這種將培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞用胰酶消化下來，制成細(xì)胞懸液，再轉(zhuǎn)接到兩個或兩個以上的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。 動物細(xì)胞傳代培養(yǎng)技術(shù)組織塊培養(yǎng)物的傳代過程 分離細(xì)胞培養(yǎng)物貼壁型細(xì)胞的傳代過程分離細(xì)胞培養(yǎng)物懸浮型細(xì)胞的傳代過程、分離細(xì)胞培養(yǎng)物貼壁型細(xì)胞的傳代過程、分離細(xì)胞培養(yǎng)物貼壁型細(xì)胞的傳代過程分割培養(yǎng)物再次接種 、分離細(xì)胞培養(yǎng)物貼壁型細(xì)胞的傳代過程移液：取出培養(yǎng)瓶，打開瓶蓋。用吸管吸出舊培養(yǎng)液。漂洗：用無Ca2+、Mg2+離子的平衡鹽溶液輕輕漂洗培養(yǎng)物1次2次，洗去殘余血清后棄去平衡鹽溶液。消化：在培養(yǎng)器皿內(nèi)加入胰蛋白酶溶液，室溫下消化5min15min，顯微鏡

15、下觀察細(xì)胞突起縮回近似圓形、細(xì)胞之間間隙增大時停止消化。、分離細(xì)胞培養(yǎng)物貼壁型細(xì)胞的傳代過程終止消化：用吸管吸去消化液后立即加人含血清培養(yǎng)液或蛋白酶抑制劑，抑制胰蛋白酶的活性。脫壁：用彎頭吸管吸取培養(yǎng)器皿內(nèi)的培養(yǎng)液反復(fù)吹打瓶皿底壁，使已經(jīng)消化的細(xì)胞脫離瓶皿底壁。離心：低速高心，棄去上清液。計數(shù)：用新鮮培養(yǎng)液將細(xì)胞沉淀重新懸浮，計數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度。傳代：將細(xì)胞懸液接種到一個或多個新的培養(yǎng)器皿中。、分離細(xì)胞培養(yǎng)物懸浮型細(xì)胞的傳代過程將培養(yǎng)物移入離心管低速離心。用吸管吸去上清液，加入新鮮培養(yǎng)液使細(xì)胞沉淀重新懸浮。根據(jù)傳代目的將細(xì)胞懸液接種在一個或多個新的培養(yǎng)器皿中。加足培養(yǎng)液，加蓋封口，放人恒溫箱中

16、繼續(xù)培養(yǎng) 傳代培養(yǎng)注意事項離體培養(yǎng)的細(xì)胞生命力比較脆弱，傳代時細(xì)胞沒有生長到培養(yǎng)瓶底壁面積的80以前，不要急于傳代 對貼壁細(xì)胞消化后的吹打過程要有序進(jìn)行，要從一邊開始到另一邊結(jié)束，尤其是器皿的四角處。確保瓶皿底壁各處的細(xì)胞都被吹打脫離。吹打時動作不宜過猛，吹出液體的力度要適中，否則會直接損傷細(xì)胞并產(chǎn)生能傷害細(xì)胞的氣泡。傳代培養(yǎng)注意事項傳代數(shù)是指對培養(yǎng)物傳代的次數(shù)，它不等于細(xì)胞分裂的次數(shù)或細(xì)胞的代數(shù)，而僅代表傳代操作的次數(shù)。傳代對細(xì)胞的影響或傷害程度僅次于將活細(xì)胞從生物體內(nèi)取出并進(jìn)行原代培養(yǎng)的程度。傳代后的細(xì)胞生長不像剛開始原代培養(yǎng)時那樣緩慢。傳代對細(xì)胞生長和性狀會產(chǎn)生不利影響，一般情況下要盡可

17、能減少傳代次數(shù)。五、細(xì)胞污染的檢監(jiān)測與排除微生物（細(xì)菌、真菌、支原體）化學(xué)因素（影響細(xì)胞生長而非細(xì)胞所需的化學(xué)物質(zhì)）。（一）生物污染的檢測細(xì)菌的污染及檢測真菌的污染及檢測支原體的污染及檢測細(xì)菌的污染及檢測細(xì)菌污染的種類及時間：在細(xì)胞培養(yǎng)中較多見的是大腸桿菌、白色葡萄球菌、假單孢菌；多在傳代、換液、加樣操作后發(fā)生。細(xì)菌污染的檢測方法及過程將10ml左右的細(xì)胞懸液以1000rmin離心5min，再用無菌的PBS洗滌2次，接種到無抗生素的培養(yǎng)基中，置于培養(yǎng)箱中，37 條件下培養(yǎng)24h。如培養(yǎng)物真的受到污染，可見細(xì)菌生長。當(dāng)污染的菌量較大或細(xì)菌繁殖到一定程度時，培養(yǎng)幾小時之后增殖的細(xì)菌即可導(dǎo)致培養(yǎng)基外

18、觀混濁，在倒置相差顯微鏡下，可見培養(yǎng)基中有大量的細(xì)菌顆粒漂浮。 真菌的污染及檢測污染的種類：煙曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子菌、白色念珠菌、酵母菌等 污染的檢測：在倒置相差顯微鏡下可見絲狀或樹枝狀的菌絲。這些菌絲呈白色絲狀團(tuán)塊，如棉絮狀，懸浮在培養(yǎng)基中或附著在培養(yǎng)器皿、培養(yǎng)物的表面 污染的時機(jī)：真菌污染常見于在潮濕環(huán)境下使用培養(yǎng)板和培養(yǎng)皿等開放性培養(yǎng)系統(tǒng)。培養(yǎng)器皿外的污染物需及時用酒精棉球擦洗，以防止其傳人培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi) 支原體的污染及檢測支原體污染的表現(xiàn)：受支原體污染的培養(yǎng)系統(tǒng)不發(fā)生混濁，也無其它特殊的外觀表現(xiàn)。如果在培養(yǎng)過程中用顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)許多細(xì)胞發(fā)生破碎，而且培養(yǎng)細(xì)胞需頻繁改變培養(yǎng)環(huán)境才能長期

19、傳代時，應(yīng)懷疑培養(yǎng)系統(tǒng)是否受到支原體污染 支原體污染的檢測方法PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）方法 PCR方法是模擬自然狀態(tài)下DNA分子的復(fù)制方式在體外實(shí)現(xiàn)DNA擴(kuò)增。利用事先設(shè)計好的對支原體特異的rRNA基因引物或rRNA基因間隔區(qū)的引物，可以檢測到培養(yǎng)系統(tǒng)中極其微量的支原體DNA，其敏感度非常高。 支原體污染的檢測方法熒光染色法 原理：用能與DNA相結(jié)合的熒光染料對細(xì)胞進(jìn)行染色，無支原體污染時，DNA只存在于培養(yǎng)細(xì)胞的核內(nèi)，而污染了支原體的細(xì)胞，由于支原體附著在細(xì)胞的外表面，所以，在熒光顯微鏡下可見細(xì)胞周圍或附著于細(xì)胞表面的綠色小亮點(diǎn)，而且亮點(diǎn)密度和支原體污染程度成正比。支原體污染的檢測方法相差顯

20、微鏡觀察在培養(yǎng)器皿中事先放置一個蓋玻片，把培養(yǎng)細(xì)胞接種于其上，24h后取出，將有細(xì)胞的一面朝下覆蓋在載玻片上，用相差顯微鏡的油鏡觀察，在細(xì)胞表面和細(xì)胞之間的暗色微小顆粒，即為支原體支原體污染的檢測方法免疫學(xué)方法利用人工制備的針對各類支原體的單克隆抗體，與培養(yǎng)細(xì)胞表面的支原體結(jié)合，再用熒光酶標(biāo)記的針對支原體單克隆抗體的抗抗體，用間接免疫細(xì)胞化學(xué)染色法染色，陽性者即可認(rèn)定存在支原體污染 支原體污染的檢測方法電鏡觀察取培養(yǎng)細(xì)胞，用掃描電鏡或透射電鏡觀察，此方法即簡便又快捷（二）生物污染的排除使用抗生素加溫處理動物體內(nèi)接種與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)使用抗生素確定培養(yǎng)物被污染后，可直接進(jìn)行大劑量（5倍10倍的常規(guī)劑量）沖擊用藥 用含藥培養(yǎng)基處理24h48h后，再換常規(guī)培養(yǎng)基，有時可奏效，此法在污染的早期效果較好 加溫處理方法：將受支原體污染的培養(yǎng)細(xì)胞放置在41的水浴中作用5h10h，最長不超過18h，可殺滅培養(yǎng)系統(tǒng)中的支原體。策略：高溫對細(xì)胞的生長也有較大影響，在實(shí)驗(yàn)前應(yīng)先用少量培養(yǎng)細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)以找出最合適的時間和溫度，盡可能保證既殺死支原體又使細(xì)胞不致受到太大損傷。 動物體內(nèi)接種將被污染的培養(yǎng)細(xì)胞接種在裸鼠的皮下或腹腔，其可以接受人的腫瘤細(xì)胞形成移植瘤，而其體內(nèi)的巨噬細(xì)胞和其它非特異的防御體系仍可消滅污染的微生物。等