動物細胞培養(yǎng)制藥工藝課件

1、第十七章 動物細胞培養(yǎng)制藥工藝動物細胞培養(yǎng)的應用動物細胞培養(yǎng)制藥工藝17.1 制藥動物細胞的表達系統(tǒng)與特征17.2 基因工程動物細胞系的構建17.3 動物細胞培養(yǎng)基的制備17.4 動物細胞培養(yǎng)技術17.5 培養(yǎng)過程檢測與工藝控制17.1制藥動物細胞的表達系統(tǒng)與特征一、動物細胞的結構與功能二、制藥動物細胞的種類三、生產用細胞系四、動物細胞的生產特征17.1制藥動物細胞的表達系統(tǒng)與特征 1.動物細胞的結構與功能2、動物細胞培養(yǎng)的代謝特征葡萄糖和谷氨酰胺：能量和合成代謝的前體。葡萄糖限制:通過增加谷氨酰胺消耗得以補償，反之亦然。葡萄糖代謝：糖酵解為主，生成丙酮酸和乳酸，乳酸分泌到胞外并在培養(yǎng)液中積累

2、。另一條途徑為TCA循環(huán)，徹底氧化產生CO2和水。一小部分為戊糖磷酸途徑，生成4、5、7碳糖和NADPH。中間產物進入脂肪酸代謝、核酸代謝和氨基酸代謝。葡萄糖代謝旺盛，產生大量乳酸，對細胞有毒性。三羧酸循環(huán)2、動物細胞培養(yǎng)的代謝特征谷氨酰胺代謝：脫氨、轉氨等，合成其他非必需氨基酸。脫氨作用：生成谷氨酸，脫氨產生的氨，對細胞有毒性。轉氨作用：生成嘧啶，嘌呤，氨基糖等合成代謝前體。谷氨酰胺與丙酮酸發(fā)生轉氨作用，生成丙氨酸，進入培養(yǎng)液并積累。離體動物細胞，轉氨是主要代謝途徑；Gln是動物細胞的氮源，Gln受限制時，通過增加其他氨基酸的消耗得以補償。流加葡萄糖或谷氨酰胺，控制整個代謝過程，避免有毒廢物

3、的積累。 蛋白質合成場所：粗糙內質網上的核糖體，以 mRNA為模板，進行密碼的翻譯。3、蛋白質合成，糖基化修飾和分泌表達動物細胞制藥表達系統(tǒng)蛋白質糖基化修飾糖基化場所：粗糙內質網腔內和高爾基體，加工修飾形成糖基化蛋白質，糖基結構易變化。不同細胞系糖基化特征不同，根據藥物的結構，選擇適宜細胞系。動物細胞制藥表達系統(tǒng)糖基化改造是研究熱點。糖基化蛋白質分泌分泌泡與細胞膜融合，把產物釋放到胞外，完成了蛋白質的分泌表達。動物細胞制藥表達系統(tǒng)細胞周期：細胞從分裂開始到分裂結束的一段時間。一個細胞分裂，形成兩個細胞。1224h。4、細胞周期與凋亡四個階段：M期：分裂期，很短，0.51 h分裂間期 G1 S

4、G2 期。 G1期：DNA 復制前期,差異大 S期：DNA 合成期，68 h G2期：DNA 復制后期，25 h 細胞死亡的兩種方式：壞死：環(huán)境因素或病原物入侵，細胞受到嚴重傷害時快速膨脹，染色質凝聚而死亡，細胞直接裂解。 特征是壞死過程不受細胞自主控制。細胞凋亡：細胞對環(huán)境變化作出的有計劃的、執(zhí)行預定程序的死亡應答過程。特征是細胞收縮，細胞核和DNA斷裂，同時被膜包裹形成凋亡小體。4、細胞周期與凋亡動物細胞制藥表達系統(tǒng)顯微鏡下凋亡的細胞形態(tài)反應器中的死亡形式主要是凋亡不同細胞凋亡發(fā)生不同原因：缺乏生長因子或血清、營養(yǎng)受限和逆境等均可引發(fā)凋亡發(fā)生。細胞培養(yǎng)中需嚴格控制條件，防止細胞凋亡。動物細

5、胞制藥表達系統(tǒng) 5、制藥動物細胞表達系統(tǒng) 5.1 哺乳動物細胞表達系統(tǒng) 5.2 昆蟲表達系統(tǒng)基于細胞來源：原代細胞，傳代細胞?；诩毎麎勖河邢藜毎?，無限細胞系。基于細胞的染色體數目：二倍體細胞系，異倍體細胞系?；讷@得方式：工程細胞系，癌變細胞系?；谏L特性：貼壁依賴型，非貼壁依賴型5.1 哺乳動物細胞表達系統(tǒng)1、細胞系的分類動物細胞制藥表達系統(tǒng)概念：是生長和壽命有限的細胞，經過若干傳代培養(yǎng)后失去增殖能力，老化死亡。特點：有限生長（時間），有接觸抑制性（密度）。舉例： WI-38、MRC-5、2BS等用于藥品生產，曾經廣泛應用，但不是理想的生產細胞系。壽命：取決于細胞來源的物種和年齡、器

6、官。人細胞最高培養(yǎng)次數為5060代。胚成纖維細胞：人，50代；雞胚，30代；小鼠，8代。 （1）有限細胞系動物細胞制藥表達系統(tǒng)概念：細胞在生長基質上分裂增殖，逐漸匯集成片，當每個細胞與其周圍的細胞互相接觸時，細胞就停止增殖。特點：保持充足的營養(yǎng)，細胞仍可存活一段時間，但細胞密度不再增加。大多數細胞：形成單層細胞，有少數懸浮培養(yǎng)細胞（癌細胞）：無接觸抑制（2）無限細胞系概念是壽命和活性不受傳代次數影響的細胞系，可連續(xù)培養(yǎng)。也稱為永久細胞系或連續(xù)細胞系。其特點：永生，沒有接觸抑制現象，對培養(yǎng)條件和營養(yǎng)因子等要求較低，倍增時間短，非常適合于制藥工業(yè)生產。動物細胞制藥表達系統(tǒng)（3）工程細胞系采用基因工

7、程技術對宿主細胞的遺產物質進行了修飾改造，獲得具有穩(wěn)定遺傳的獨特性狀的細胞系。方法：融合或重組Namalwa：類淋巴母細胞，懸浮生長。英國Wellcome公司Sendai病毒誘導，大規(guī)模生產干擾素，批準上市。產品逐漸淘汰。WI-38：Wistar Institute（WI），二倍體成纖維細胞系，壽命有限。貼壁生長，對很多病毒敏感，第一個被用于制備疫苗。MRC-5：二倍體成纖維細胞系，生長較WI-38快，對逆境有一定抗性，用于制備疫苗。2、生產用細胞系動物細胞制藥表達系統(tǒng)（1）人源細胞系CHO細胞：Chinese hamster ovary特點：貼壁型生長，也可懸浮培養(yǎng)，對剪切力和滲透壓有較高的

8、忍受能力。最為普遍和成熟表達糖基化蛋白藥物的細胞。多種衍生突變株，高表達。藥物：EPO、HBsAg、G-CSF、凝血因子、DNA酶I（2）哺乳動物細胞系動物細胞制藥表達系統(tǒng)BHK21：baby hamster kidney，成纖維樣細胞，用于增殖病毒、制備疫苗和重組蛋白。上市重組凝血因子。Vero細胞系：非洲綠猴腎的成纖維細胞，多倍體核型，貼壁依賴性。Vero E6最為常用，可增殖多種病毒，生產疫苗。動物細胞制藥表達系統(tǒng)（2）哺乳動物細胞系是脾臟B細胞與骨髓瘤細胞的融合細胞特點：無血清培養(yǎng)基中高密度懸浮生長，容易轉染和生長，大量分泌和高效表達。應用：抗體藥物生產。（3）雜交瘤細胞系動物細胞制藥

9、表達系統(tǒng)昆蟲桿狀病毒科核多角體病毒（載體）攜載外源基因，感染昆蟲細胞或幼蟲（宿主），高水平表達外源蛋白質。1983：苜蓿尺蠖核多角體病毒秋黏蟲細胞表達系統(tǒng)1984：家蠶核多角體病毒家蠶幼蟲表達系統(tǒng)。應用：生產抗體、試劑盒等。日本批準用家蠶系統(tǒng)生產干擾素已上市。常用的昆蟲表達系統(tǒng)：Sf21：來源于秋粘蟲的卵巢細胞。容易放大，高效表達。Sf9：從SF21中分離得到，最常用?？箼C械剪切，無血清培養(yǎng)基的攪拌反應器中生長。TN-5B1-4：來源于粉紋夜蛾。表達能力高，能懸浮培養(yǎng)。5.2 昆蟲表達系統(tǒng)家蠶完成基因組測序（西南大學完成）優(yōu)點：安全：桿狀病毒無致病性，產品安全性受FDA認可易飼養(yǎng)：家蠶喪失了野

10、外生存能力，飼養(yǎng)，發(fā)育快。高量表達：強啟動子，外源基因可超量表達；高效表達：可容納較大的外源基因（12kb），表達數個外源基因，如抗體，并且裝配成有功能的分子。缺點：翻譯后的加工：昆蟲細胞能進行一系列翻譯后的加工，但與哺乳動物細胞不完全相同；蛋白質合成與加工不匹配，修飾效率可能不高，引起溶解性、穩(wěn)定性、免疫性等變化。重組率低，篩選困難，周期長，需要410d。2、優(yōu)點與不足表達系統(tǒng)對培養(yǎng)條件要求嚴格對培養(yǎng)基組成要求高天然結構與活性的藥物6.動物細胞的生產特征對培養(yǎng)條件要求嚴格1、溫度2、氧氣3、pH值 對培養(yǎng)基組成要求高 天然結構與活性的藥物 生產工藝特征17.2 基因工程動物細胞的構建17.2

11、.1 表達載體的設計與構建17.2.2 轉染與培養(yǎng)17.2.3 篩選與鑒定病毒載體： 牛痘病毒：構建多價疫苗 腺病毒、逆轉錄病毒：腫瘤基因治療 (重組人p53腺病毒注射液；5型腺病毒載體DNA和人p53腫瘤抑制基因重組；術中、術后使用可消滅殘留癌)。 桿狀病毒:外源基因表達（昆蟲）。質粒載體：穿梭載體，細菌體內擴增，在動物細胞中表達。 選擇標記，擴增系統(tǒng)。17.2.1 表達載體的設計與構建1、載體類型動物細胞制藥細胞系構建動物病毒啟動子：SV40早期和晚期啟動子、腺病毒晚期啟動子、CMV立即早期基因啟動子。動物基因的啟動子：高表達，延長因子EF-1啟動子、泛素蛋白C啟動子、IgG啟動子。2、

12、啟動子與復制子啟動子編碼藥物基因終止子，選擇標記動物細胞制藥細胞系構建終止密碼子: T(U)AA, T(U)AG,T(U)GA PolyA信號序列：不宜太長，避免能量過度消耗。常用:SV40 polyA(131)、BGH的polyA(225bp)。3、終止子表達載體結構舉例化學方法：磷酸鈣，樹脂，DEAE-葡聚糖物理方法：基因槍，顯微注射，電擊穿孔生物方法：病毒17.2.2 轉染與培養(yǎng)動物細胞制藥細胞系構建轉染：通過病毒載體把外源基因導入哺乳動物細胞的技術。化學轉染動物細胞制藥細胞系構建動物細胞制藥細胞系構建磷酸鈣轉染電擊穿孔物理轉染病毒載體的轉染病毒感染細胞的過程：吸附，脫殼核酸進入進入細胞

13、核整合動物細胞制藥細胞系構建DNA合成途徑阻斷標記，抗生素抗性標記：篩選標記與原理動物細胞制藥細胞系構建選擇劑基因作用機理甲氨喋呤dhfr二氫葉酸類似物，競爭性抑制DHFR活性。氨喋呤Tk抑制正常途徑dTTP合成5-溴脫氧尿苷Tk阻斷dNTP正常合成途徑G418, Zeocinneo干擾核糖體，阻斷蛋白合成小結與思考題動物細胞培養(yǎng)制藥擴增培養(yǎng)：非選擇性培養(yǎng)基，1-2d篩選培養(yǎng)：選擇性培養(yǎng)基,2-4d更換培養(yǎng)基，23周，獲得單克隆細胞集落。鑒定：對獨立集落進行穩(wěn)定性、表達量、生物活性等鑒定。建庫：按生物制品要求，建立細胞系和建庫，妥善保存。動物細胞制藥細胞系構建3、篩選與鑒定、建庫動物細胞培養(yǎng)基

14、制備培養(yǎng)基組成成分培養(yǎng)基種類培養(yǎng)基質量控制動物細胞培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基組成成分1、糖類2、氨基酸3、維生素4、無機鹽類5、生長類因子與激素動物細胞培養(yǎng)的種類1、天然培養(yǎng)基2、合成培養(yǎng)基血清（Serum）成分與作用血清（Serum）成分與作用血清（Serum）成分與作用2、合成培養(yǎng)3、無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)基質量的控制1、培養(yǎng)用水質2、緩沖液Ca,Mg離子具有細胞凝集作用3、生理鹽水和平衡鹽溶液3、生理鹽水和平衡鹽溶液4、氨基酸配制5、NaHCO3配制6、培養(yǎng)基滅菌動物細胞培養(yǎng)技術動物細胞培養(yǎng)技術動物細胞生長和基質依賴性動物細胞培養(yǎng)基本過程動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)方法動物細胞生長和基質依賴性1、生長基質2、貼壁依賴性細胞3、非貼壁依賴性細胞4、兼性貼壁依賴性細胞動物細胞培養(yǎng)基本過程1、原代細胞培養(yǎng) 過程2、傳代細胞培養(yǎng) 過程動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)方法1、單層貼壁培養(yǎng) 概念與過程1、單層貼壁培養(yǎng) 特點2、懸浮培養(yǎng)3、微載體培養(yǎng)4、固定化培養(yǎng) 90年代以來, 醫(yī)學界開始嘗試以微膠囊作為基因重組細胞的免疫隔離和運載工具, 利用重組細胞的代謝產物調節(jié)機體生理功能, 治療相關疾病。 微囊化人胰島 培養(yǎng)15d微囊化小牛腎上腺嗜鉻細胞 培養(yǎng)0d微囊化肝癌細胞 培養(yǎng)40d不同放大倍