普通遺傳學(xué)第十二章-基因工程課件

1、第 十二章 基因工程第 1節(jié) 基因工程概述第 2節(jié) 基因的分離第 3節(jié) 外源基因?qū)胧荏w第 4節(jié) 轉(zhuǎn)基因生物的檢測(cè)與鑒定第 5節(jié) 基因工程的應(yīng)用The future of gene engineering:Can human fly? 遺傳工程（genetic engineering），也稱生物工程，是指：利用工程技術(shù)的方法改造和修飾生物體，使其產(chǎn)生新的性狀或產(chǎn)品，從而改良生物體的一種遺傳學(xué)手段。 細(xì)胞工程（cell engineering） 基因工程（gene engineering） 酶工程（enzyme engineering） 發(fā)酵工程（fermentation engineering

2、）第 1節(jié) 基因工程概述基因工程（gene engineering）利用人工的方法把生物的遺傳物質(zhì)在體外進(jìn)行切割、拼接和重組，獲得重組DNA分子，然后導(dǎo)入宿主細(xì)胞或個(gè)體，使受體的遺傳特性得到修飾或改變的過(guò)程?；蚬こ滩僮鞯膶?duì)象是DNA分子，首先把目標(biāo)基因克隆出來(lái)插入到一定的載體中，然后將重組DNA分子導(dǎo)入到受體細(xì)胞，并使其保持和遺傳下去。 第 1節(jié) 基因工程概述目的基因的獲得目的基因與載體連接成重組DNA分子重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞篩選重組克隆基因表達(dá)與產(chǎn)物分離基因工程的內(nèi)容 第 1節(jié) 基因工程概述第 2節(jié) 基因的分離一 工具酶 載體三 基因分離方法 The future of geneti

3、c engineering?第 2節(jié) 基因的分離一、工具酶（一）限制性內(nèi)切核酸酶 (restriction enzymes)限制性內(nèi)切核酸酶（限制酶）是細(xì)菌中降解外來(lái)DNA分子的一類酶。細(xì)菌中限制修飾現(xiàn)象：作用于同一DNA的兩種酶分解DNA的限制酶和改變DNA堿基結(jié)構(gòu)使其免遭限制酶分解的修飾酶。通過(guò)某些堿基進(jìn)行甲基化修飾，使得限制酶不能進(jìn)行切割。而外來(lái)的DNA沒(méi)有被甲基化，限制酶將其降解。（一）限制性內(nèi)切核酸酶共同的特性： 只切割雙鏈DNA分子，不切單鏈DNA； 每種酶有其特定的核苷酸序列識(shí)別特異性； 需要鎂離子激活等。限制酶可分為3類。（一）限制性內(nèi)切核酸酶限制酶：作用于特定（異）核苷酸序列

4、 的磷酸二脂酶；型酶：僅EcoB和EcoK兩種，催化限制 性切割和修飾核苷酸2種功能；型酶：基因工程中應(yīng)用最廣泛； 型酶：具有特異的識(shí)別位點(diǎn)，識(shí)別位 點(diǎn)是非對(duì)稱的。 （一）限制性內(nèi)切核酸酶通過(guò)用相同的限制性內(nèi)切核酸酶切割形成一個(gè)重組DNA分子 （一）限制性內(nèi)切核酸酶（二）DNA連接酶（ligase）在分子克隆中使用的DNA連接酶有兩種：大腸桿菌DNA連接酶和T4 DNA連接酶。催化DNA中相鄰的3 OH和5 磷酸基末端之間形成磷酸二酯鍵并把兩段DNA連接起來(lái)。（三）反轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase）反轉(zhuǎn)錄酶是一類以RNA為模板來(lái)指導(dǎo)DNA合成的DNA聚合酶，所以又稱為依賴于

5、RNA的DNA聚合酶。反轉(zhuǎn)錄酶在遺傳工程中的主要用途是以mRNA為模板合成cDNA。第 2節(jié) 基因的分離、工具酶：1、內(nèi)切酶2、連接酶3、反轉(zhuǎn)錄酶 4、DNA聚合酶(Taq)-PCR第 1節(jié) 基因工程的概念（四）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR) 是體外快速擴(kuò)增DNA的方法 。 PCR反應(yīng)包括三個(gè)步驟： 變性：在94-95使模板DNA的雙鏈變性成單鏈。 復(fù)性：兩個(gè)引物分別與單鏈DNA互補(bǔ)復(fù)性，復(fù)性的溫度在50-60 延伸：在引物的引導(dǎo)及Taq酶的作用下，于72合成模板DNA的互補(bǔ)鏈 這三個(gè)步驟稱為一個(gè)循環(huán)，PCR反應(yīng)常有25-

6、35個(gè)循環(huán)。The Polymerase Chain Reaction (animations) A T G A C G A T C G A G T A T A C T G C T A G C T CACT G PCR產(chǎn)物可以通過(guò)電泳檢測(cè)瓊脂糖電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（四）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) 第 2節(jié) 基因的分離一 工具酶 載體 二 載體 載體（vector）是將外源基因送入受體細(xì)胞的工具。作為載體DNA分子，需要具備：在宿主細(xì)胞中能獨(dú)立復(fù)制，有獨(dú)立的復(fù)制起始位點(diǎn)；載體DNA分子中有一段不影響其復(fù)制的非必需區(qū)域，即有限制酶切位點(diǎn)，允許外源基因插入且插入后隨載體DNA分子一同進(jìn)行復(fù)制或擴(kuò)增；

7、有選擇標(biāo)記，便于選擇含重組DNA分子的寄主細(xì)胞；分子量小，多拷貝，易于操作。除了上述特點(diǎn)外，一般還要求載體載荷外源DNA的幅度要寬，具有安全性等。（一） 質(zhì)粒 質(zhì)粒(plasmid)是細(xì)菌染色體外存在的一種能夠自我復(fù)制的雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子，大小1kb200kb。質(zhì)粒常常帶有一些特殊的基因，如致死基因，抗抗生素的基因等等。一般質(zhì)粒都含有一個(gè)復(fù)制起始區(qū)，可獨(dú)立復(fù)制。質(zhì)粒DNA復(fù)制與宿主之間的關(guān)系，可分為“嚴(yán)謹(jǐn)型”和“松弛型”。“嚴(yán)謹(jǐn)型”質(zhì)粒在每個(gè)細(xì)胞中的拷貝數(shù)通常13個(gè)，而“松弛型” 通常在10個(gè)以上，可高達(dá)200個(gè)拷貝。一般質(zhì)粒通過(guò)改造后才能用于遺傳工程。 （一） 質(zhì)粒 pUC18可以克隆比

8、較大的DNA片段，在細(xì)胞中產(chǎn)生500個(gè)拷貝左右。有一個(gè)多克隆位點(diǎn)，位于大腸桿菌的lacZ基因之內(nèi)，有利于篩選和分離轉(zhuǎn)化細(xì)胞。篩選的原理是：細(xì)菌細(xì)胞含有野生質(zhì)粒，在含有X-gal（5-溴-氯吲哚-半乳糖苷酶）的培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生蘭色菌斑；插入克隆片段后，lacZ基因失去功能，不能代謝X-gal，從而產(chǎn)生白色菌斑。（一） 質(zhì)粒 （二） 病毒載體 噬菌體基因組全長(zhǎng)48kb。中間約1/3的序列為中間基因簇(central gene cluster)，兩端為DNA左、右臂?；蚪M的中間基因簇序列可被外源DNA片段取代, 而不影響噬菌體感染細(xì)菌及形成噬菌斑的能力。噬菌體（二） 病毒載體 噬菌體載體可接受1

9、5 kb-23 kb的外源DNA片段，它既可作為克隆載體，也可作為表達(dá)載體，廣泛用于各類基因庫(kù)的構(gòu)建，多用于cDNA文庫(kù)的構(gòu)建。 (三 ) 克隆大片段載體粘粒載體、細(xì)菌人工染色體和酵母人工染色體載體等。粘粒載體（cosmid）是一類含有cos位點(diǎn)的質(zhì)粒載體.兼有噬菌體的高效感染能力和質(zhì)粒的易于克隆和選擇的優(yōu)點(diǎn)，既能像質(zhì)粒一樣在寄主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，又能象DNA一樣被包裝到噬菌體顆粒中去。與噬菌體載體和質(zhì)粒載體相比具有多個(gè)優(yōu)點(diǎn)：具有cos位點(diǎn)，能高效地轉(zhuǎn)化大腸桿菌，能在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)自身環(huán)化，并能在大腸桿菌中復(fù)制；有像質(zhì)粒一樣的選擇標(biāo)記；cosmid載體比較小，但能插入較大的外源片段，可克隆外源片段的

10、長(zhǎng)度在1545 kb之間。 由于cosmid載體的大片段克隆能力，多用于基因組文庫(kù)的構(gòu)建。已有多種粘粒載體可用于基因克隆，pJB8是最常用的粘粒載體之一粘粒載體細(xì)菌人工染色體（bacterial artificial chromosome，BAC） BAC載體是基于細(xì)菌的性因子(F因子)質(zhì)粒的一些特點(diǎn)構(gòu)建的。F因子在細(xì)菌接合時(shí)轉(zhuǎn)移1Mb（106bp）的細(xì)菌染色體片段。將F因子經(jīng)基因工程改良構(gòu)成的BAC載體，可用于克隆100 kb以上的DNA片段。帶有外源片段的BAC載體在細(xì)菌細(xì)胞中通常僅單個(gè)拷貝，這一特點(diǎn)有利于保持DNA大分子，在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定復(fù)制而不發(fā)生重組。BAC載體本身分子量小，具有氯霉素抗

11、性選擇基因及多克隆位點(diǎn)。酵母人工染色體（yeast artificial chromosome，YAC）酵母人工染色體是另一類酵母穿梭載體。具有自主復(fù)制序列、克隆位點(diǎn)以及可在細(xì)菌和酵母菌中選擇的標(biāo)記基因。 YAC可以接受100-1000 kb的外源DNA片段，這一特點(diǎn)使YAC成為人類基因組計(jì)劃及圖位克隆分離基因的重要工具，并促進(jìn)了發(fā)展人類人工染色體(human artificial chromosome，HAC)的研究。 三 基因分離方法基于基因庫(kù)的分離基因方法 T-DNA標(biāo)簽克隆基因基于PCR的基因克隆人工合成基因1 構(gòu)建基因庫(kù) 基因庫(kù)(library)是一組DNA和cDNA序列克隆的集合體

12、。從基因庫(kù)中分離基因，首先要構(gòu)建基因庫(kù)。只有利用合乎要求的基因庫(kù)才有可能篩選出所需要的基因，很多分子遺傳學(xué)工作才能繼續(xù)深入下去。（一）基于基因庫(kù)的分離基因方法 National Gene Bank in Korea核基因庫(kù) 核基因庫(kù)(genomic library或genomic bank)是將某一生物的全部基因組DNA酶切后與載體連接構(gòu)建而成的。 通常的方法是，盡量提取大分子量的核DNA，用限制性酶酶切后，分離選擇具有一定長(zhǎng)度(大于15kb)的DNA片段，與適宜的載體連接構(gòu)成重組DNA分子, 選擇相應(yīng)的宿主細(xì)胞用于克隆。載體可以是質(zhì)粒，噬菌體，BAC或YAC等（一）基于基因庫(kù)的分離基因方法

13、染色體基因庫(kù) 將基因組的一部分（如一條染色體）用來(lái)構(gòu)建基因庫(kù)，對(duì)于選擇特異基因及分析染色體結(jié)構(gòu)和組織十分有價(jià)值。果蠅X染色體上的一個(gè)片段，具有50多個(gè)多線染色體帶，利用微切割技術(shù)切割，抽提DNA，構(gòu)建染色體片段基因庫(kù)。在人類基因組項(xiàng)目研究中，利用流動(dòng)細(xì)胞分揀技術(shù)將人類染色體分開，構(gòu)建單個(gè)染色體基因庫(kù)，大大加速了人類基因組作圖和分析。在酵母菌中，利用一種改良的脈沖電泳方法，將酵母菌的16條染色體分開，用于構(gòu)建染色體庫(kù)。cDNA庫(kù) 以mRNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶合成互補(bǔ)DNA (cDNA)，構(gòu)建的基因庫(kù)。絕大多數(shù)真核生物mRNA的3端具有一段多聚A (poly-A)尾端序列。在反轉(zhuǎn)錄酶作用下，用po

14、ly-T引物(primer)，引導(dǎo)合成一條互補(bǔ)DNA，即第一條DNA鏈，形成RNA-DNA雜合雙鏈。然后合成第2條鏈。 cDNA庫(kù)僅具有用于分離mRNA的細(xì)胞或組織內(nèi)表達(dá)的基因的mRNA序列，僅包括基因組的部分基因序列。構(gòu)建什么樣的基因庫(kù)取決于研究目的。cDNA 庫(kù)對(duì)于研究基因的表達(dá)模式、分離某一特定基因是十分有用的。如分離在某一細(xì)胞或組織高效表達(dá)的某種基因。通常是將cDNA庫(kù)與核基因庫(kù)配合使用，以便既能得到基因的編碼序列，又可得到基因的調(diào)控序列。cDNA庫(kù) 2 篩選基因庫(kù) 從基因庫(kù)中篩選、分離基因，可據(jù)對(duì)待選基因相關(guān)信息的了解程度，確定篩選方法和條件。常用方法是利用一段核苷酸序列(DNA，c

15、DNA或寡核苷酸)作探針(probe)，用放射性同位素或非放射性同位素標(biāo)記探針，也可用抗體作探針，篩選基因庫(kù)。菌落雜交技術(shù)尋找目標(biāo)DNA克隆從文庫(kù)中篩選獲得目標(biāo)克隆后，只有進(jìn)行測(cè)序才能進(jìn)行生物信息分析和功能預(yù)測(cè)。3、序列測(cè)定和分析DNA sequencing（二）T-DNA標(biāo)簽克隆基因基本原理：利用T-DNA插入突變創(chuàng)造突變體，獲得各突變體的純合材料；然后分析突變性狀與T-DNA的共分離關(guān)系，存在共分離的材料用適當(dāng)?shù)腜CR克隆技術(shù)獲得T-DNA的側(cè)翼基因組序列；用其作探針篩選基因文庫(kù)，獲取目標(biāo)基因或克隆，再進(jìn)行下一步的分析 。T-DNA 載體構(gòu)建轉(zhuǎn)化植物（T1，T-DNA雜合子)收獲T2種子篩

16、選T2，獲突變子，應(yīng)為3:1分離確定T-DNA與突變型共分離的個(gè)體產(chǎn)生純合后代克隆T-DNA兩側(cè)的植物DNA利用側(cè)翼DNA序列作探針從該植物的cDNA文庫(kù)中釣取基因基因功能的驗(yàn)證（三）基于PCR的基因克隆基于PCR的DNA克隆與基于載體的克隆技術(shù)相比具有一定優(yōu)越性。PCR反應(yīng)速度很快，可以在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)完成，而載體克隆需要幾周時(shí)間。PCR反應(yīng)非常靈敏，可以用來(lái)擴(kuò)增痕量樣品的DNA。對(duì)于部分降解、甚至污染，用載體克隆無(wú)法進(jìn)行的DNA樣品，PCR擴(kuò)增仍可獲得目的基因克隆。（四） 人工合成基因 根據(jù)已知的基因或氨基酸序列，將化學(xué)合成寡核苷酸的方法與酶促合成DNA的方法結(jié)合起來(lái)，可以很快地人工合成基因。

17、例如，首先化學(xué)合成多個(gè)含有80-100個(gè)核苷酸的寡核苷酸，每個(gè)寡核苷酸之間具有19-24個(gè)核苷酸的重疊序列，再將各個(gè)寡核苷酸等量混合，在DNA聚合酶(或Taq酶)作用下，各寡核苷酸又作為引物合成新鏈，使單鏈部分補(bǔ)齊成為雙鏈，再用兩個(gè)PCR引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增出DNA片段。若將兩個(gè)DNA片段放在一起，經(jīng)SOE-PCR(sequence overlapped extension，SOE)擴(kuò)增出完整的基因片段。第三節(jié) 外源基因的導(dǎo)入一、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化二 、基因槍法 需要具備如下條件：高效的植株再生體系。選擇容易從體細(xì)胞再生植株的受體基因型是獲得轉(zhuǎn)化成功的關(guān)鍵。受體植物細(xì)胞對(duì)農(nóng)桿菌要有很高的親和力

18、。一般認(rèn)為受體細(xì)胞應(yīng)處于高度的分裂狀態(tài)，T-DNA才能插入植物基因組；具有有效的選擇系統(tǒng)。必須有一個(gè)理想的選擇方法將轉(zhuǎn)化細(xì)胞從非轉(zhuǎn)化細(xì)胞中選擇出來(lái)；穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化技術(shù)和基因表達(dá)。外源基因轉(zhuǎn)入植物后應(yīng)能傳代并穩(wěn)定表達(dá)。一、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化1、根癌農(nóng)桿菌(Ti質(zhì)粒) Ti質(zhì)粒是一種細(xì)菌質(zhì)粒，它自然存在于土壤農(nóng)桿菌細(xì)胞中。土壤農(nóng)桿菌可感染大多數(shù)雙子葉植物的受傷部位，使之產(chǎn)生冠癭瘤(grown gall tumors)。 Ti 質(zhì)粒。 Ti質(zhì)粒的一部分DNA叫做轉(zhuǎn)移DNA（T-DNA），當(dāng)T-DNA整合到宿主植物細(xì)胞的染色體后，就誘導(dǎo)出根瘤，并使根瘤細(xì)胞合成冠癭堿(opine),作為土壤農(nóng)桿菌的碳源和

19、氮源 。（1）T-DNA區(qū)（transferred-DNA regions） T-DNA是農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞時(shí)，從Ti質(zhì)粒上導(dǎo)入植物細(xì)胞的一段DNA。 T-DNA兩端各有一段25bp的重復(fù)序列(LB, RB)。 T-DNA攜帶的致瘤基因是一些與激素合成有關(guān)的基因，由于激素合成基因使細(xì)胞處于不停的分裂狀態(tài)，形成冠癭瘤，不能進(jìn)行細(xì)胞分化。 Ti質(zhì)粒改造后才能應(yīng)用于植物的基因工程。 保留T-DNA兩端的末端序列，然后用外源DNA插入或直接取代野生型T-DNA的部分基因，使轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞不具有成瘤能力。（2）Vir區(qū)（virolence region）Vir區(qū)段上的基因與T-DNA從細(xì)菌轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞

20、的遺傳過(guò)程有關(guān)，區(qū)段上的基因能夠使農(nóng)桿菌表現(xiàn)出毒性，故稱之為毒性區(qū)。（3）Con區(qū)(regions encoding conjugations) 該區(qū)段上存在著與細(xì)菌間接合轉(zhuǎn)移的有關(guān)基因（tra），調(diào)控Ti質(zhì)粒在農(nóng)桿菌之間的轉(zhuǎn)移。 （4）Ori區(qū)(origin of replication) 該區(qū)段基因調(diào)控Ti質(zhì)粒的自我復(fù)制，故稱之為復(fù)制起始區(qū)。2、發(fā)根農(nóng)桿菌(Ri質(zhì)粒)發(fā)根農(nóng)桿菌侵染后植物細(xì)胞產(chǎn)生許多不定根，這種不定根生長(zhǎng)迅速，不斷分枝成毛狀，故稱之為毛狀根(發(fā)狀根)Ri質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)與Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)很相似，可以分為T區(qū)、vir區(qū)、ori區(qū)和其它區(qū)域等幾個(gè)部分。T區(qū)與Ti質(zhì)粒的T-DNA十分相似

21、，包括T區(qū)的左右邊界序列;TL-DNA區(qū);TR-DNA區(qū)。 圖12-15 棉花轉(zhuǎn)基因植株生產(chǎn)過(guò)程F1. 共培養(yǎng)2. 在選擇培養(yǎng)基上篩選3. 篩選獲得的抗性愈傷 5. 胚萌發(fā)成苗6. 轉(zhuǎn)基因植株移栽大田4. 抗性愈傷分化成胚狀體二 、基因槍法 基因槍法生物彈法微粒槍法微粒轟擊法 基因槍法（gene gun）是依賴高速的金屬微粒將外源基因?qū)牖罴?xì)胞的一種轉(zhuǎn)化技術(shù)?；驑尳榉▋?yōu)點(diǎn)：（1）無(wú)宿主限制。可以對(duì)任何基因型材料進(jìn)行轉(zhuǎn)化研究；靶受體幾乎包括所有具有潛在分化能力的組織或細(xì)胞。（2）易于操作。缺點(diǎn)：如轉(zhuǎn)化頻率低、嵌合體較多、結(jié)果的重復(fù)性差，轉(zhuǎn)化的外源基因以多拷貝居多，易導(dǎo)致基因沉默，實(shí)驗(yàn)成本較高等

22、。還有很多將外源基因引入植物基因組的方法，如電激法、花粉管通道法、超聲波法等，它們都在不同程度上得到應(yīng)用?；驑尫ǖ?二節(jié) 基因的分離第三節(jié) 外源基因的導(dǎo)入一、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化二 、基因槍法 第四節(jié) 轉(zhuǎn)基因生物的檢測(cè)與鑒定基于基因庫(kù)的分離基因方法 T-DNA標(biāo)簽克隆基因基于PCR的基因克隆人工合成基因第4節(jié) 轉(zhuǎn)基因生物的檢測(cè)與鑒定一、分子檢測(cè)二、 生物學(xué)性狀鑒定Fields trials for herbicide resistance of transgenic wheat lines (T3 progeny) in Russia upon treatment with 1% Basta

23、. A. before treatment. B. one week after treatment. PCRSouthern雜交Northern雜交Western雜交常用的轉(zhuǎn)基因生物分子檢測(cè)手段有一、分子檢測(cè)PCR檢測(cè)PCR檢測(cè)外源基因的原理是根據(jù)被轉(zhuǎn)移的外源基因（目的基因或選擇標(biāo)記基因）設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增外源基因的片段。如果擴(kuò)增出的片段與設(shè)計(jì)的一對(duì)引物之間的實(shí)際片段在長(zhǎng)度上相吻合，說(shuō)明基因已轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞。在進(jìn)行PCR檢測(cè)時(shí)應(yīng)設(shè)兩個(gè)對(duì)照：陽(yáng)性對(duì)照即質(zhì)粒DNA和陰性對(duì)照即非轉(zhuǎn)基因材料的DNA。PCR擴(kuò)增結(jié)果只能初步確定轉(zhuǎn)基因材料的真實(shí)性，并不能完全確信。容易出現(xiàn)假陽(yáng)性，通常需要進(jìn)一步用Southe

24、rn雜交才能證實(shí)。轉(zhuǎn)基因棉花選擇標(biāo)記基因NPTII編碼區(qū)段的PCR擴(kuò)增結(jié)果（M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，C為非轉(zhuǎn)基因植株（陰性對(duì)照），P為質(zhì)粒對(duì)照（陽(yáng)性對(duì)照），1-20為轉(zhuǎn)基因植株） Southern雜交(Southern blotting)將DNA用限制性酶酶切酶切DNA電泳變性轉(zhuǎn)移到膜上經(jīng)過(guò)標(biāo)記的DNA探針與膜上的DNA片段雜交洗去膜上非特異性結(jié)合的探針檢測(cè)雜交信號(hào) 。如果轉(zhuǎn)移的膜上具有與雜交探針相同或部分同源的序列，就會(huì)檢測(cè)到雜交帶信號(hào)。Agarose gel with DNA fragments after electrophoresis Gel with smear DNAMembrane fi

25、lterCapilary transfer(虹吸轉(zhuǎn)移）Electronic transfer（電轉(zhuǎn)移）Cathode - Anode +Gel with smear DNAFilterSouthern blot: invisible DNA bands now on filter500gSouthern雜交Block with nonspecific DNA, then incubate with labeled probePositive band“l(fā)ights up”Photographic detectionDiagram of RFLP：First, DNA fragments wer

26、e separated in an agarose gel by electrophoresis. Next, denature the DNA with base (e.g. NaOH solution) and transfer the single-stranded DNA fragments from the gel to a sheet of nitrocellulose or nylon membrane. One can do this in two ways: by diffusion, in which buffer passes through the gel, carry

27、ing the DNA with it (left), or by electrophoresis (right). Next, hybridize the blot to a labeled probe and detect the labeled bands by autoradiography.M 1 2 3 4 5 6 7 8 9kb23.1-9.4 -6.6 -4.4 -2.3 -2.0 -轉(zhuǎn)基因棉花的Southern雜交檢測(cè)（M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，1為陽(yáng)性對(duì)照，2為陰性對(duì)照，3-8為轉(zhuǎn)基因植株） Northern雜交是一種RNA-DNA雜交。將提取的植物總RNA或mRNA用變性凝膠電泳分

28、離，則不同的RNA分子將按分子量大小依次排布在凝膠上；將它們?cè)晦D(zhuǎn)移到固相膜上；在適宜的離子強(qiáng)度及溫度條件下，用探針與膜雜交；然后通過(guò)探針的標(biāo)記性質(zhì)檢出雜交體。Northern雜交從轉(zhuǎn)基因植物中提取總蛋白質(zhì)，經(jīng)純化處理后，進(jìn)行SDS(十二烷基磺酸鈉)聚丙烯酰胺凝膠電泳使蛋白質(zhì)按分子量大小分離，將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，按特定的程序與抗體雜交，對(duì)雜交結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)便可得知被檢植物組織內(nèi)目的蛋白表達(dá)與否及其表達(dá)量。Western雜交Flower Leaf Stem Root鑒定轉(zhuǎn)移的目的基因、選擇標(biāo)記基因是否表達(dá)。觀察是否發(fā)生外源基因以外的變異。轉(zhuǎn)基因生物還可能因?yàn)榧?xì)胞培養(yǎng)或T-DNA的插入而造成

29、其它性狀的突變。最好選出其它性狀均未改變而僅產(chǎn)生目的基因性狀的轉(zhuǎn)基因材料。但是，不應(yīng)忽視轉(zhuǎn)基因過(guò)程中產(chǎn)生的其它變異的應(yīng)用價(jià)值，如轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的研究中就可篩選到既抗蟲纖維品質(zhì)的某方面也改善的品系。二 生物學(xué)性狀鑒定轉(zhuǎn)基因抗蟲棉非轉(zhuǎn)基因?qū)φ彰揶D(zhuǎn)基因棉花飼喂棉鈴蟲時(shí)被食用情況（左圖為轉(zhuǎn)基因抗蟲棉，右圖為非轉(zhuǎn)基因棉） 第 5節(jié) 基因工程的應(yīng)用 第五節(jié) 基因工程的應(yīng)用一、基因工程的應(yīng)用1、轉(zhuǎn)基因植物抗除草劑、抗蟲、抗病、抗逆的優(yōu)良品系或品種，很多已經(jīng)大面積種植推廣。2002年5000萬(wàn)公頃：大豆、玉米、棉花、水稻、馬鈴薯、番茄、小麥等2、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物：羊、牛轉(zhuǎn)基因動(dòng)物比轉(zhuǎn)基因植物的發(fā)展要緩慢些，這不僅涉及到技術(shù)問(wèn)題，也涉及到倫理和宗教問(wèn)題。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物通常是將目的基因構(gòu)建到載體上，然后用微量注射法將重組DNA導(dǎo)入受體合子細(xì)胞核中，借助母體環(huán)境實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物遇到的技術(shù)難題是動(dòng)物體細(xì)胞再生并不像植物那么容易，而且動(dòng)物的繁殖數(shù)量十分有限。克隆動(dòng)物的成功（1997年克隆羊多利）和轉(zhuǎn)基因魚在生產(chǎn)