核酸的分離與分析課件

1、第三章核酸的分離與分析 第一節(jié) 核酸的分離純化一、核酸分離提取的原則與要求 二、核酸提取的主要步驟 三、質(zhì)粒DNA的分離純化四、基因組DNA的制備 五、RNA的提取六、核酸的定量一、核酸分離提取的原則要求總的原則： 保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性， 防止降解，排除其它分子的污染。 如：防止核酸酶，特別是RNase的污染， 又如：提取DNA分子時，應(yīng)去除RNA分子，反之亦然。 二、核酸提取的主要步驟1. 樣品準(zhǔn)備2. 細(xì)胞破碎3. 分離純化核酸4.核酸的沉淀濃縮1. 樣品準(zhǔn)備 新鮮動植物組織材料：清洗、去掉雜質(zhì)。少量樣品可用液氮凍結(jié)，然后快速碾磨成粉未狀。 動物細(xì)胞：胰酶消化，離心沉淀，PBS液漂洗，

2、收集沉淀的細(xì)胞。 液體培養(yǎng)的微生物：直接離心沉淀收集菌體。 2. 細(xì)胞破碎物理方法、化學(xué)方法、酶法等。 物理方法：超聲波法、勻漿法、液氮破碎法等。 （注意：物理方法容易導(dǎo)致DNA鏈的斷裂） 化學(xué)方法和酶法：去污劑（SDS 0.5%1.25%）和溶菌酶或蛋白酶K溫和裂解。 EDTA（5mmol/L)作用：與Mg2+結(jié)合，抑制核酸水解酶.除去RNA，可加入適量RNA酶。 3. 分離純化核酸 關(guān)鍵步驟是去除蛋白質(zhì)，還要避免核酸的降解。 酚/氯仿抽提法： 酚、氯仿: 兩種不同的蛋白質(zhì)變性劑。氯仿還能加速有機相與液相分層，去除植物色素和蔗糖。 異戊醇: 減少蛋白質(zhì)變性操作過程中產(chǎn)生的氣泡。 細(xì)胞破碎酚/

3、氯仿水相（DNA、小分子RNA）界面（絮狀蛋白質(zhì)沉淀）有機相（色素、脂類、糖類）酚/氯仿提取除蛋白質(zhì)原理示意圖細(xì)胞懸浮液細(xì)胞抽提物4.核酸的沉淀濃縮 乙醇沉淀法：無水乙醇結(jié)合核酸分子所結(jié)合的水，使核酸沉淀。 微量的DNA，可加入中等濃度的單價陽離子促進沉淀。如Na+，中和DNA分子上的負(fù)電荷，減少了DNA分子間的同性電荷相斥力。三、質(zhì)粒DNA的分離純化重點考慮如何與基因組DNA相互分開。 利用質(zhì)粒分子量小和閉合環(huán)狀超螺旋結(jié)構(gòu)性質(zhì)。分離方法：堿裂解法、煮沸法、去污劑（Triton/SDS）裂解法、CsCl-EB（氯化銫-溴乙錠）密度梯度平衡離心法、羥基磷灰石柱層析法等。1. 堿裂解法： 小量制備

4、DNA較好的方法。 基本原理：在堿性pH（12-12.5）下，DNA分子均變性，恢復(fù)中性時，線性染色體DNA由于兩條鏈分開且基因組分子量大，單鏈互相無規(guī)則纏繞，不能準(zhǔn)確復(fù)性而沉淀；質(zhì)粒DNA分子因緊密纏繞在一起，能準(zhǔn)確復(fù)性而留于上清溶液中。2.煮沸法 利用DNA加熱變性原理，結(jié)合不同DNA復(fù)性的差異進行分離。復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子以溶解狀態(tài)存在液相中，通過高速離心（12,000g）可實現(xiàn)分離。 適于快速提取質(zhì)粒DNA并進行鑒定，也適用于大量提取，對純度要求高的，可做進一步純化處理。3. CsCl-EB密度梯度平衡離心 CsCl是一種大分子量的重金屬鹽，長時間超速離心時，在管中形成11.80

5、52g/cm3自上而下增加的密度梯度。染色體DNA、質(zhì)粒DNA、RNA以及蛋白質(zhì)等，可在離心管內(nèi)不同位置形成區(qū)帶。RNA可與Cs+結(jié)合，因此密度最大，沉積管底，蛋白質(zhì)漂浮于液面上。四、基因組DNA的制備基因組DNA分子量大，受熱易變性，復(fù)性困難，受剪切力作用易斷裂，因此要采用較溫和的條件和方法。如SDS加上蛋白酶K溫和裂解方法。雜蛋白質(zhì)的去除可用酚/氯仿萃取法。對植物基因組可能需要注意的是糖類的除去，可選用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）選擇性沉淀RNA或DNA，也可用四或三甲基溴化銨（TEAB）加上50%乙醇沉淀多糖。五、RNA的提取細(xì)胞中的rRNA、tRNA和mRNA不容易完全分開，可先制

6、得細(xì)胞核、線粒體、核糖體等細(xì)胞器和細(xì)胞質(zhì)，然后再從中分離某一類RNA。mRNA分子種類繁多，分子量大小不均一、含量少、易降解，分離較為困難。可利用寡聚脫氧胸苷酸（oligo dT)親和色譜柱分離。RNA的提取要點： 樣品細(xì)胞或組織的有效破碎； 核蛋白復(fù)合體變性解離，釋放出RNA； 對RNA酶的有效抑制； 將RNA從DNA和蛋白質(zhì)混合物中分離； 多糖含量高的樣品還要采取措施有效去除多糖雜質(zhì)。 最關(guān)鍵的是抑制RNA酶的活性。 六、核酸的定量核酸定性定量分析是指導(dǎo)核酸分離純化的重要手段。常見的方法：紫外分光光度法、熒光分光光度法。紫外分光光度法核酸的最大吸收波長是260nm，吸收波谷在230nm。根

7、據(jù)測定，在波長260nm時，1 OD值的光密度相當(dāng)于雙鏈DNA濃度為50gmL；單鏈DNA或RNA為40gmL；單鏈寡核苷酸為20gmL?？梢源藖碛嬎愫怂針悠返臐舛?，檢測最低限為0.51.0gmL。通過測定在260nm和280nm的紫外吸收值的比值來估計核酸的純度。 DNA的比值為1.8，RNA的比值為2.0。若A樣品的比值高于1.8，說明其中的RNA尚未除盡，比值小于1.8則說明殘留酚或蛋白質(zhì)。 熒光分光光度法DNA、RNA本身并不產(chǎn)生熒光，但在熒光染料溴化乙錠（EB）嵌入堿基平面之間后，DNA樣品在紫外線照射激發(fā)下，可以發(fā)出紅色熒光，其熒光強度與核酸含量成正比。由此可建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定未知

8、樣品的濃度。 第二節(jié) 核酸的凝膠電泳 電泳：是利用帶電荷物質(zhì)的電場中的遷移速率的不同而將其分離的方法。凝膠電泳：利用了支持介質(zhì)形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)使不同大小的大分子物質(zhì)得以分離并在保留于凝膠中，在不同位置形成條帶。電泳遷移率的大小與物質(zhì)的帶電量與分子量的比值（荷質(zhì)比）相關(guān)。 在中性pH或堿性緩沖液中，核酸分子骨架上的磷酸基團在水中的解離帶有負(fù)電荷，在電場中由負(fù)極向正極遷移。 在均一的凝膠網(wǎng)絡(luò)中，核酸的遷移速率只與分子的大小相關(guān)，使不同分子量者分開，而相同分子量聚集形成條帶。 一、瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠作為電泳基質(zhì)有如下優(yōu)點：形成的凝膠具有大量微孔，其孔徑尺寸取決于它的濃度，如0.75%瓊脂糖的孔徑

9、為800 nm，1%瓊脂糖孔徑為150nm；透明，無紫外吸收；無毒，熱熔冷凝，制膠方便；熱可逆性，具有一定強度。 瓊脂糖凝膠的制備： 將瓊脂糖在所需緩沖液中熔化成清澈、透明的溶液。然后將熔化液倒入膠模中，令其固化。凝固后，瓊脂糖形成一種固體基質(zhì)，其密度取決于瓊脂糖的濃度。 不同濃度瓊脂糖凝膠的分離范圍瓊脂糖濃度（%）分離線狀DNA分子的范圍（kbp）0.35600.61200.70.8100.90.571.20.461.50.242.00.13凝膠電泳成像圖譜二、聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺（acrylamide，簡稱Acr）和交聯(lián)劑（crosslinker）N，N-甲叉雙

10、丙烯酰胺（methylene-bisacrylamide，簡稱Bis）交聯(lián)成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。該凝膠孔徑小、透明、彈性好、無紫外吸收，可用于DNA、蛋白質(zhì)等的分離。DNA在聚丙烯酰胺凝膠中的有效分離范圍聚丙烯酰胺濃度（%）有效分離范圍（bp）3.510010005.0805008.06040012.04020020.010100三、凝膠電泳分離后核酸片段的回收及純化方法：電泳洗脫法、DEAE纖維素膜插片法、低熔點瓊脂糖凝膠電泳挖塊法、凍融法、玻璃奶法、QIAEX法等。DEAE纖維素膜插片法簡便易行，回收率、純度都很高，對回收500bp5kb左右大小的DNA片段效果很好。電泳洗脫法對大于5k

11、b的DNA片段較適合。凍融法、SDS溶液浸出法等方法都極為簡便，但純度與回收率較差。將低熔點瓊脂糖挖塊與玻璃奶法結(jié)合，可回收到質(zhì)量較好的DNA片段。 第三節(jié) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction， PCR）概念: 在引物存在的條件下、以DNA為模板、由DNA聚合酶催化的對特定基因或DNA序列進行體外快速擴增的反應(yīng)，故又稱為基因的體外擴增法。 美國Cetus公司科學(xué)家K.B.Mullis于1983年發(fā)明 一、PCR技術(shù)的基本原理及特點雙鏈DNA分子在臨近沸點的溫度下便會分離成兩條單鏈的DNA分子，當(dāng)溫度降低時，DNA聚合酶以單鏈DNA為模板并利用反應(yīng)混合物中的引物和

12、四種脫氧核苷三磷酸（dNTPs）合成新生的DNA互補鏈。 PCR擴增能力是十分驚人的，理論上講經(jīng)過30次的循環(huán)反應(yīng)，便可使靶DNA得到109倍的擴增，但實際上大約是106107倍的擴增。 正因為PCR技術(shù)具有如此高的擴增敏感性，意味著分子生物學(xué)分析只需要含有痕量DNA的樣品，包括一根頭發(fā)、血跡等。這對于法醫(yī)學(xué)鑒定具有特別的應(yīng)用價值。同時，應(yīng)當(dāng)注意，任何DNA樣品或?qū)嶒炘噭┚鶓?yīng)仔細(xì)避免發(fā)生污染，確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確、可靠。二、PCR反應(yīng)體系與條件優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系：50l 100l體積，包括：模板DNA，底物（dNTP），Taq DNA聚合酶（2.5U），2條引物（各0.25mol/L），K

13、Cl（50 mmol/L），TrisHCl（10 mmol/L，pH8.4），MgCl2（1.5 mmol/L），明膠或牛血清白蛋白（BSA）（1g/ml）。1. PCR反應(yīng)模板（1）種類：可來自任何生物的單鏈或雙鏈DNA，也可以是用化學(xué)方法合成的。（2）數(shù)量：一般而言，PCR檢測可以用納克（ng）級的DNA克隆模板或微克（g）級的基因組DNA，或者是拷貝數(shù)為105的目的DNA片段。（3）純度：對樣本純度的最基本要求：一是要含有至少一個包含有待擴增片段的完整的分子，二是其他的不純物的濃度不會抑制酶的活性。傳統(tǒng)的DNA純化方法完全可以滿足PCR反應(yīng)要求。2. PCR反應(yīng)的緩沖液PCR反應(yīng)中緩沖液

14、是一個重要的影響因素。Mg2濃度非常重要，它是PCR反應(yīng)中DNA聚合酶的輔助因子。反應(yīng)體系中許多成分都結(jié)合Mg2，包括引物、模板、PCR產(chǎn)物和dNTP。通常，Mg2的總濃度必須超過dNTP的總濃度。在一般的PCR反應(yīng)中，1.52.0 mmol/L Mg2是比較合適的（對應(yīng)dNTP濃度為200 mol/L左右）。 3. 底物（脫氧核糖核苷三磷酸，dNTPs）濃度PCR反應(yīng)中，dNTP濃度應(yīng)在20200mol/L，高濃度dNTP可加快反應(yīng)速度，但同時會增加堿基的錯誤摻入率和實驗成本；低濃度dNTP雖會導(dǎo)致反應(yīng)速度下降，但可提高實驗的精確性。4種dNTP在使用時必須以等當(dāng)量濃度配制，以減少錯配誤差。

15、此外，由于dNTP可能與Mg2+結(jié)合，因此應(yīng)注意二者濃度之間的關(guān)系。4. PCR反應(yīng)的DNA聚合酶100l反應(yīng)體系中，一般所需Taq DNA聚合酶的用量為0.55U。根據(jù)擴增片段的長短及其復(fù)雜程度（GC含量）不同而有所區(qū)別。使用Taq DNA聚合酶濃度過高，會引起非特異產(chǎn)物的擴增；濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。5. PCR反應(yīng)的引物（1）引物設(shè)計原則PCR引物通常長1525堿基，其中GC約占50%。引物之間不能互配形成雙鏈結(jié)構(gòu)，引物內(nèi)部也不能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。引物的3末端必須與目的片段完全相配。引物的5末端可以不與目的片段互補，可以包含內(nèi)切酶位點或啟動子序列，但在下一輪反應(yīng)中，這些序列會被同樣合成。（

16、2）引物Tm加熱可以打開雙鏈結(jié)構(gòu)，當(dāng)一半分子為單鏈而另外一半分子仍處于雙鏈狀態(tài)時的溫度稱為該雙鏈DNA的熔解溫度，即Tm。由于GC堿基對間的氫鍵數(shù)較AT堿基對間的多，故GC含量高的DNA的Tm值也較高。PCR反應(yīng)中引物濃度一般為0.10.5mol/L，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性產(chǎn)物擴增，同時會增加引物之間形二聚體的幾率。 6. PCR反應(yīng)條件的選擇94，30秒可使各種復(fù)雜的DNA分子完全變性。復(fù)性溫度的選擇，可以根據(jù)引物的長度及其GC含量確定。長度在1525bp之間時，退火溫度可通過Tm=4（GC）2（AT）計算得到。退火時間設(shè)置為30秒鐘。PCR反應(yīng)的延伸溫度建議選擇的72，此時，Ta

17、q DNA聚合酶具有最高活性。PCR延伸反應(yīng)的時間，可根據(jù)待擴增片段的長度而定，一般1kb以內(nèi)的片段，延伸時間1分鐘即可，擴增10kb片段時，其延伸時間可達到15分鐘。PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。理論上2025次循環(huán)之后，PCR產(chǎn)物的積累即可達到最大值 。三、PCR技術(shù)拓展與應(yīng)用包括：錨定PCR（anchored PCR），反向PCR（reverse PCR），不對稱PCR（asymmetric PCR），RT-PCR，多重PCR（multiplex PCR）等。1. 反向PCR （reverse PCR）反向PCR用于擴增位于靶DNA區(qū)段之外的兩側(cè)的未知DNA序列。2. 不對稱

18、PCR （asymmetric PCR）不對稱PCR技術(shù)（asymmetric PCR）可用于制備單鏈模板DNA。方法中的兩種引物濃度相差100倍，其它方面與標(biāo)準(zhǔn)PCR并沒有本質(zhì)的區(qū)別。低濃度引物的叫限制引物，一般為0.51.0 pmol。在限制引物被用完之前，PCR擴增產(chǎn)物當(dāng)中主要是雙鏈DNA，而且以指數(shù)方式上升。大約25個循環(huán)后，只剩下的高濃度的引物。此時的PCR擴增產(chǎn)物則只有雙鏈DNA中的某一條鏈，以線性而非指數(shù)方式增加。 3. RT-PCRPCR技術(shù)用于擴增被反轉(zhuǎn)錄成cDNA形式的特定RNA序列，稱為RT-PCR。 4. 多重PCR（multiplex PCR）同一反應(yīng)體系中加入多對引

19、物，擴增同一模板的幾個區(qū)域。 主要應(yīng)用領(lǐng)域是檢測特定序列的存在或缺失。若待檢測的基因片段存在，經(jīng)PCR可以產(chǎn)生擴增區(qū)帶；而如果該段缺失，則PCR反應(yīng)后不出現(xiàn)擴增區(qū)帶。第四節(jié) 核酸分子雜交技術(shù)根據(jù)核酸變性和復(fù)性的性質(zhì)，應(yīng)用核酸探針檢測靶基因或靶序列的技術(shù)方法，是分子生物學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)之一。具有靈敏度高、快捷、簡便易行等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于基因克隆的篩選、酶切圖譜的制作、基因序列的定量和定性分析以及基因突變的檢測等。一、核酸雜交的原理 利用具有同源性的兩條核酸單鏈在一定的條件下退火，可按堿基互補原則形成雙鏈，如果這兩條鏈的來源不同，則形成雜交分子。 核酸分子雜交實驗通常包括兩步： 核酸印跡

20、（nucleic acid blotting）轉(zhuǎn)移：將核酸樣品轉(zhuǎn)移到固體支持物濾膜上。主要有電泳凝膠核酸印跡法、斑點和狹線印跡法（dot and slot blotting）、菌落和噬菌斑印跡法（colony and plaque blotting）； 雜交反應(yīng)：將具有核酸印跡的濾膜與帶有放射性標(biāo)記或其它標(biāo)記的DNA或RNA探針進行雜交。 所以有時也稱這類核酸分子雜交為印跡雜交。二、核酸探針的制備核酸分子探針: 是指特定的已知核酸片段，能與互補核酸序列退火雜交，因此可以用于待測核酸樣品中特定基因順序的探測。要實現(xiàn)對核酸探針分子的有效探測，必須將探針分子用一定的示蹤物（即標(biāo)記物）進行標(biāo)記。 探針

21、的種類及其選擇 根據(jù)來源及其性質(zhì): 基因組DNA探針： cDNA探針： RNA探針： 人工合成的寡核苷酸探針 注意: 并不是任意一段核酸片度都可以作為探針的。探針的選擇正確與否，會直接影響雜交結(jié)果的分析。 各種標(biāo)記物及其選擇一種理想的探針標(biāo)記物，應(yīng)具備以下幾種特性： 標(biāo)記前后探針的基本結(jié)構(gòu)不變，標(biāo)記物不影響探針的化學(xué)性質(zhì)、雜交特異性、Tm值等； 可以通過采取一定措施達到較高的靈敏度（如延長曝光時間或用增感屏來增加訊號的強度）； 特異性強、本底低，重復(fù)性好，并且操作簡單、省時； 穩(wěn)定、安全、經(jīng)濟、無污染。目前用于分子雜交的探針標(biāo)記物已有20多種，可分為放射性和非放射性兩大類。 容易造成放射性污染

22、； 當(dāng)標(biāo)記活性極高時，放射線會造成核酸分子結(jié)構(gòu)的破壞； 多數(shù)放射性核素的半衰期都比較短，必須隨用隨標(biāo)記，標(biāo)記后立即使用，不能長期存放（3H與14C除外）。 1. 放射性核素 放射性核素的靈敏度極高，可檢測到1041018g的物質(zhì)，但存在以下缺點：2. 非放射性標(biāo)記物 生物素（biotin）、地高辛配基（digoxigenin）、熒光素等 多數(shù)非放射性標(biāo)記探針的敏感性較差，但穩(wěn)定性好、分辨力高、檢測所需的時間短，尤其是操作過程中不需要放射性防護設(shè)備，在安全方面大大優(yōu)于放射性標(biāo)記探針。 （三）探針的標(biāo)記方法放射性標(biāo)記分為體內(nèi)標(biāo)記法及體外標(biāo)記法兩種，而基因工程中常用體外標(biāo)記。體外標(biāo)記法又分為化學(xué)法和

23、酶法兩種?；瘜W(xué)法是通過標(biāo)記物的活性基團與核酸分子中的某種基團發(fā)生化學(xué)反應(yīng)進行標(biāo)記，標(biāo)記物直接與核酸分子相連。酶法標(biāo)記是先將標(biāo)記物標(biāo)記在核苷酸上，然后在通過酶促聚合反應(yīng)使帶有標(biāo)記的核苷酸摻入到核酸序列中，產(chǎn)生標(biāo)記核酸探針。 常用的酶法標(biāo)記有切口平移法（nick translation）和隨機引物法（random priming），這兩種方法均為均一標(biāo)記。此外還有一種是利用多核苷酸激酶的末端標(biāo)記法，為不均勻標(biāo)記。 1. 切口平移法2. 隨機引物法隨機引物法優(yōu)點： 模板的純度不需很高即可標(biāo)記； 反應(yīng)比較穩(wěn)定，可通過延長反應(yīng)時間來增加探針產(chǎn)量； 標(biāo)記探針的比活較高，可達到4109cpm/g； 該法可以

24、在低熔點的瓊脂糖中進行。 3末端標(biāo)記可使用末端轉(zhuǎn)移酶， -32PdNTP加到寡核苷酸的3末端，可以加上單個或多個標(biāo)記物，多個標(biāo)記物的加入可以提高探針的比活。 5端標(biāo)記，標(biāo)記物常用-32PATP。T4多聚核苷酸激酶3. 末端標(biāo)記法非放射性標(biāo)記探針的檢出 目前大多數(shù)非放射性探針的制備都是采用分子雜交與酶反應(yīng)結(jié)合的策略，雜交信號的檢出依賴于酶反應(yīng)，其中酶直接標(biāo)記的探針可直接通過酶反應(yīng)檢測。三、核酸雜交種類與方法（1）固相雜交，也稱為膜上印跡雜交，包括Southern印跡雜交、Northern印跡雜交、斑點雜交及狹縫印跡雜交。（2）細(xì)胞原位雜交，標(biāo)記已知序列的核酸，與細(xì)胞或組織切片中的核酸進行雜交，并

25、對其進行檢測的方法。（3）液相雜交。膜上印跡雜交膜上印跡雜交是指將待測核酸序列片段結(jié)合到一定的固相支持物上，然后與存在于液相中標(biāo)記的核酸探針進行雜交的過程，是目前最常用的一種核酸分子雜交方法。這種膜上印跡雜交的技術(shù)也稱印跡技術(shù)。根據(jù)核酸分子的種類不同，印跡技術(shù)（或方法）分為Southern印跡和Northern印跡。 根據(jù)核酸轉(zhuǎn)移方式的不同也有不同的印跡方法： 斑點或狹縫印跡法；虹吸轉(zhuǎn)移印跡方法； 電轉(zhuǎn)移印跡方法；真空轉(zhuǎn)移印跡方法。印跡雜交實驗中，選擇有效的轉(zhuǎn)移方法和良好的固相支持物此項技術(shù)成敗的關(guān)鍵。 1. 固相支持物的選擇固相支持物種類很多，一種良好的固相支持物應(yīng)具備以下幾個特點： 具有較

26、強的結(jié)合核酸分子的能力； 與核酸分子結(jié)合后，應(yīng)不影響與探針分子的雜交反應(yīng)； 與核酸分子的結(jié)合穩(wěn)定牢固，能經(jīng)受雜交、洗膜等操作而不致于脫落或脫落極少； 非特異性吸附少，在洗膜條件下能將非特異性吸附在其表面的探針分子洗脫掉； 具有良好的機械性能，如柔軟性好、韌性強等，以便于操作。 2. Southern印跡雜交（1）原理 Southern印跡是由Southern于1975年發(fā)明建立， 是指將電泳分離的DNA從凝膠中轉(zhuǎn)移到固相支持物上的過程。（2）Southern印跡雜交流程Southern印跡雜交分析主要包括以下主要步驟： 酶解。 電泳。 轉(zhuǎn)膜。 預(yù)雜交。 探針標(biāo)記。 雜交。 雜交檢出。（1）No

27、rthern印跡雜交的原理提取植物總RNA或mRNA，用變性凝膠電泳分離，不同的RNA分子將按分子量大小依次排布在凝膠上，原位轉(zhuǎn)移至固相膜，在適宜的離子強度及溫度條件下，探針與膜上的同源序列雜交形成RNADNA雜交雙鏈，通過探針的標(biāo)記性質(zhì)可以檢出雜交體。根據(jù)雜交體在膜上的位置可進一步分析雜交RNA的大小。若經(jīng)過上述雜交操作膜上沒有出現(xiàn)雜交帶，說明外源基因雖然已整合到植物染色體上，但在該取材部位及生理狀態(tài)下并未有效表達。3. Northern印跡雜交細(xì)胞總RNA或mRNA與探針的雜交的印跡過程。（2）Northern印跡雜交程序基本程序與Southern印跡雜交一樣，只是電泳分離有較大差別，So

28、uthern印跡雜交是用普通瓊脂糖凝膠分離DNA分子，而Northern印跡雜交則是用變性凝膠電泳來分離RNA分子。RNA電泳時必須注意兩個問題： 防止單鏈RNA形成高級結(jié)構(gòu)，所以必須采用變性凝膠； 電泳過程中始終要有效抑制RNA酶的作用。 4斑點雜交斑點雜交是將被檢標(biāo)本點到膜上，烘烤固定。這種方法耗時短，可做半定量分析。一張膜上可同時檢測多個樣品，為使點樣準(zhǔn)確方便，市售有多種多管吸印儀，在負(fù)壓下就會流到膜上呈斑點狀或狹縫狀。反復(fù)沖洗進樣孔，取出膜烤干或紫外線照射以固定標(biāo)本，這時的膜就可以進行雜交。（二）菌落原位雜交 菌落原位雜交是DNA探針與菌落DNA的雜交，于1975年，由M. Gruns

29、yein和D. Hogness提出。具體做法是把菌落或噬菌斑轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，使溶菌變性的DNA與濾膜原位結(jié)合，因為生長在培養(yǎng)基平板上的菌落或噬菌斑是按照原來的位置不變地轉(zhuǎn)移到濾膜上，并在原位發(fā)生溶菌、DNA變性和雜交作用，故稱為菌落原位雜交。 檢測重組體克隆的菌落原位雜交技術(shù)（a）將濾膜鋪放在生長著轉(zhuǎn)化菌落的平板表面，使其中的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)移到濾膜上；（b）取出濾膜，作溶菌、堿變性、酸中和等處理后，置80烤干；（c）帶有DNA印跡的濾膜與標(biāo)記的探針雜交，以檢測帶有重組質(zhì)粒（含有目的DNA插入片段）的陽性菌落；（d）將放射自顯影的X光片與原菌落平板對照，從中挑出陽性菌落。（三）組織原位雜交

30、組織原位雜交（Tissue in situ hybridization）簡稱原位雜交，指組織或細(xì)胞的原位雜交，它與菌落原位雜交不同，菌落原位雜交需裂解細(xì)菌釋出DNA，然后進行雜交，而組織原位雜交是經(jīng)適當(dāng)處理后，使細(xì)胞通透性增加，讓探針進入細(xì)胞內(nèi)與DNA或RNA雜交，因此組織原位雜交可以確定探針互補序列在胞內(nèi)的空間位置，這一點具有重要的生物學(xué)和病理學(xué)意義。 （四）固相夾心雜交固相夾心雜交需要兩個靠近而又互相重疊的探針，一個做固相吸附探針，另一個作標(biāo)記檢測探針，樣品基因組內(nèi)核酸只有使這兩個探針緊密相連才能形成夾心結(jié)構(gòu)，需要注意的是兩探針必須分別亞克隆進入兩個分離的非同源載體內(nèi)，以避免產(chǎn)生高的本底信

31、號。夾心雜交法比直接濾膜雜交法有兩個主要的優(yōu)點：（1）樣品不需固定，對粗制樣品能做出可靠的檢測；（2）用夾心雜交法比直接濾膜雜交法特異性強，因為只有兩個雜交物都雜交才能產(chǎn)生可檢測的信號。 （五）液相核酸分子雜交類型1. 吸附雜交 （1）HAP吸附雜交，羥基磷灰石層析或吸附是液相雜交中最早使用的方法，在液相中雜交后，DNADNA雜交雙鏈在低鹽條件可特異地吸附到HAP上，通過離心使吸附有核酸雙鏈HAP沉淀，再用緩沖液離心漂洗幾次HAP，然后將HAP置于計數(shù)器上進行放射性計數(shù)。（2）親和吸附雜交：生物素標(biāo)記DNA探針與溶液中過量的靶RNA雜交，雜交物吸附到?；H和素包被的固相支持物（如小球）上，用特

32、異性抗DNARNA雜交物的酶標(biāo)單克隆抗體與固相支持物上的雜交物反應(yīng)，加入酶顯色底物。這個系統(tǒng)可快速（2h）檢測RNA。（3）磁珠吸附雜交：Gen-Probe公司最近應(yīng)用丫啶翁酯（Acridinium ester）標(biāo)記DNA探針、這種試劑可用更敏感的化學(xué)方法來檢測，探針和靶DNA雜交后，雜交物可特異地吸附在磁化的有孔小珠（陽離子磁化微球體）上，溶液中的磁性小珠可用磁鐵吸出，經(jīng)過簡單的漂洗步驟，吸附探針的小珠可用化學(xué)發(fā)光測定。 2. 發(fā)光液相雜交 （1）能量的傳遞法 Heller等設(shè)計用兩個緊接的探針，一個探針的一端用化學(xué)發(fā)光基團（供體）標(biāo)記，另一個探針的一端用熒光物質(zhì)標(biāo)記，并且這兩個探針靠得很近，兩個靠得很近的探針用不同的物質(zhì)標(biāo)記（光發(fā)射標(biāo)記）。當(dāng)探針與特異的靶雜交后，這些標(biāo)記物靠得很近，一種標(biāo)記物發(fā)射的光被另一種標(biāo)記物吸收，并重新發(fā)出不同波長的光，調(diào)節(jié)檢測器使自動記錄第二次發(fā)射光的波長，只有在兩個探針分子靠得很近時，才能產(chǎn)生激發(fā)光，因此這種方法具有較好的特異性。（2）丫啶翁酯標(biāo)記法 丫啶翁酯標(biāo)記探針與靶核酸雜交后，未雜交的標(biāo)記探針分子上的丫啶翁酯可以用專門的方法選擇性除去，所以雜交探針的化學(xué)發(fā)光是