動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)染基礎(chǔ)知識(shí)大全(共37頁)

1、轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染(transfection)指真核細(xì)胞由于外源DNA摻入而獲得新的遺傳(ychun)標(biāo)志的過程。轉(zhuǎn)染方法(fngf)的分類對外源基因轉(zhuǎn)染方法的要求包括：轉(zhuǎn)移效率高，不影響(yngxing)細(xì)胞正常生理活動(dòng)，低毒性，容易使用，重復(fù)性好，易獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子.根據(jù)轉(zhuǎn)染的機(jī)制不同可劃分為化學(xué)轉(zhuǎn)染法和物理轉(zhuǎn)染法兩大類.一、化學(xué)轉(zhuǎn)染法1.DEAE-葡聚糖法DEAE葡聚是最早應(yīng)用哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑之一，DEAE-葡聚糖是陽離子多聚物，它與帶負(fù)電的核酸結(jié)合后接近細(xì)胞膜而被攝取，用DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染成功地用用于瞬時(shí)表達(dá)的研究，但用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染卻不是十分可靠。2.磷酸鈣法磷酸鈣法是磷酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)染法，因?yàn)?/p>

2、試劑易取得，價(jià)格便宜而被廣泛用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的研究，先將DNA和氯化鈣混合，然后加入到PBS中慢慢形成DNA磷酸鈣沉淀，最后把含有(hn yu)沉淀的混懸液加到培養(yǎng)的細(xì)胞上，通過細(xì)胞胞膜的內(nèi)吞作用攝入DNA。磷酸鈣似乎還通過抑制血清中和細(xì)胞內(nèi)的核酸酶活性而保護(hù)外源DNA 免受降解.3.人工(rngng)脂質(zhì)體法人工脂質(zhì)體法采用陽離子脂質(zhì)體，具有較高的轉(zhuǎn)染效率，不但可以轉(zhuǎn)染其他化學(xué)方法(fngf)不易轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系，而且還能轉(zhuǎn)染從寡核苷酸到人工酵母染色體不同長度的DNA，以及RNA和蛋白質(zhì)。此外，脂質(zhì)體體外轉(zhuǎn)染同時(shí)適用于瞬時(shí)表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)，與以往不同的是脂質(zhì)體還可以介導(dǎo)DNA和RNA 轉(zhuǎn)入動(dòng)

3、物和人的體內(nèi)用于基因治療。人工合成的陽離子脂質(zhì)體和帶負(fù)電荷的核酸結(jié)合后形成復(fù)合物，當(dāng)復(fù)合物接近細(xì)胞膜時(shí)被內(nèi)吞成為內(nèi)體進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，隨后DNA 復(fù)合物被釋放進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，至于DNA 是如何穿過核膜的，其機(jī)理目前還不十分清楚。二、物理(wl)方法1.顯微注射顯微注射雖然費(fèi)力(fi l)，但是非常有效的將核酸導(dǎo)入細(xì)胞或細(xì)胞核的方法。2.電穿孔這種方法常用來制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，但卻不適用于需要大量轉(zhuǎn)染細(xì)胞的研究。電穿孔法常用來轉(zhuǎn)染如植物園生智體這樣的常規(guī)方法不容易轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。電穿孔靠脈沖電流在細(xì)胞膜上打孔而將核酸導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。導(dǎo)入的效率與脈沖的強(qiáng)度(qingd)和持續(xù)時(shí)間有關(guān)系。3.基因槍法基因槍依靠攜帶了核

4、酸的高速粒子而將核酸導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，這種方法適用于培養(yǎng)的細(xì)胞核在體內(nèi)的細(xì)胞。如何提高(t go)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)成功率【組織培養(yǎng)試劑(shj)】一般提示：優(yōu)化您的細(xì)胞生長條件。只使用(shyng)新鮮配制的培養(yǎng)基和添加劑，并經(jīng)可能減少所用試劑的變更?；A(chǔ)培養(yǎng)基目前所使用的各種市售培養(yǎng)基（如，RPMI 1640和DMEM）。培養(yǎng)基的成分包括營養(yǎng)物質(zhì)（氨基酸，葡萄糖），維生素，無機(jī)鹽和緩沖物質(zhì)。有些成分非常不穩(wěn)定，因此如果不在使用時(shí)新鮮加入就可能會(huì)產(chǎn)生問題。務(wù)必要使培養(yǎng)基避光保存。因?yàn)橐阎幸恍┙M分和緩沖物質(zhì)，如HEPES，當(dāng)暴露于光照下就會(huì)分解產(chǎn)生細(xì)胞毒性物質(zhì)。酚紅試劑可保護(hù)細(xì)胞免受一些HEPES降解所產(chǎn)生

5、的毒性效應(yīng)，但在使用未加酚紅試劑的培養(yǎng)基的應(yīng)用場合下，如熒光素酶的測定，細(xì)胞毒性則仍然是一個(gè)問題。胎牛血清血清是一種含有白蛋白、球蛋白、生長促進(jìn)因子和生長抑制因子的極為復(fù)雜的混和物。采集血清所用動(dòng)物的年齡、營養(yǎng)水平、和健康狀況可影響到血清中這些成分的數(shù)量和質(zhì)量。因此血清易受顯著生物學(xué)變異的影響。添加劑某些細(xì)胞的生長(shngzhng)依賴于一些對生命力或細(xì)胞分裂必不可少的物質(zhì)（如，生長因子，微量元素，必需代謝物和蛋白等）。 CO2培養(yǎng)箱細(xì)胞生長(shngzhng)所需環(huán)境為37、相對濕度(xingdu shd)為95的CO2培養(yǎng)箱。用CO2是為了控制pH值。細(xì)胞生理對pH的變化非常敏感，因此多

6、數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)基都含有碳酸氫鹽緩沖體系。有些培養(yǎng)基需要CO2濃度為5來有效控制pH值，而另一些則需要10的CO2。需要向您的培養(yǎng)基供應(yīng)者核對一下適當(dāng)?shù)腃O2濃度。如果培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)條件與所需條件不一致（溫度、濕度和CO2）則會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的板間變異性。來自于培養(yǎng)箱內(nèi)的污染物、化學(xué)物質(zhì)，或真菌細(xì)胞的污染也都可能影響到細(xì)胞生理?！炯?xì)胞】一般提示：密切觀察您的細(xì)胞；確保它們狀態(tài)良好。在開始轉(zhuǎn)染細(xì)胞之前，先制定一個(gè)適當(dāng)?shù)姆N板方案，使細(xì)胞密度從轉(zhuǎn)染開始到結(jié)束都保持最佳狀態(tài)。增加成功幾率細(xì)胞是轉(zhuǎn)染過程中的一個(gè)關(guān)鍵元素，它可以是影響結(jié)果的一致性和質(zhì)量的最重要的變量。分裂細(xì)胞相比較(bjio)非分裂細(xì)胞分裂細(xì)胞(x

7、bo)往往要比靜止細(xì)胞更易于攝取并表達(dá)外源DNA。因此對大多數(shù)轉(zhuǎn)染操作而言，細(xì)胞都在轉(zhuǎn)染當(dāng)天或前一天種板。同樣重要的是細(xì)胞在種板進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)不應(yīng)處于生長過度的狀態(tài)。由于FuGENE 6和HD轉(zhuǎn)染試劑對于細(xì)胞作用溫和，可同時(shí)(tngsh)進(jìn)行貼壁細(xì)胞的種板和轉(zhuǎn)染。此外，還常用促有絲分裂刺激物（如，病毒轉(zhuǎn)化，生長因子，條件培養(yǎng)基，以及滋養(yǎng)細(xì)胞）來活化原代培養(yǎng)細(xì)胞。貼壁細(xì)胞相比較懸浮細(xì)胞在轉(zhuǎn)染效率方面貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞之間的差異顯著。天生趨于懸浮的細(xì)胞（如HL 60，Jurkat）非常難以轉(zhuǎn)染；相反，天生為貼壁的細(xì)胞（如HEK，CHO）則可適應(yīng)懸浮生長的條件。那些天然懸浮的和那些適應(yīng)懸浮的細(xì)胞的漿膜是

8、不一樣的。據(jù)推測轉(zhuǎn)染過程中的一個(gè)限制步驟就是通過內(nèi)吞作用攝取轉(zhuǎn)染分子（DNA或RNA與轉(zhuǎn)染試劑的復(fù)合物）；然而，目前對此尚未有分子水平上的合理機(jī)制的解釋。細(xì)胞間膜結(jié)構(gòu)的差異可能是某些細(xì)胞類型天生難以轉(zhuǎn)染的部分原因。所以，尋找更有效轉(zhuǎn)染試劑的工作目前還主要是經(jīng)驗(yàn)性的，尤其對于那些天生為懸浮的細(xì)胞而言更是如此。這常常是在不含血清而含有抑制轉(zhuǎn)染的特殊添加劑的培養(yǎng)基中發(fā)生。經(jīng)小心處理后，這些細(xì)胞可適應(yīng)于在沒有添加劑的環(huán)境中懸浮生長。如果這些適應(yīng)于懸浮生長的貼壁細(xì)胞在沒有這些添加劑的環(huán)境中生長，那么它們就可以被轉(zhuǎn)染。分批方案(fng n)在對培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行(jnxng)分批傳代培養(yǎng)之前，必須把貼壁細(xì)胞用胰

9、蛋白酶消化使之脫離培養(yǎng)基質(zhì)。這個(gè)常規(guī)操作可導(dǎo)致正常細(xì)胞功能受到嚴(yán)重?fù)p害。因此分批方案的不同（如，胰蛋白酶消化時(shí)間的延長，胰蛋白酶的失活，以及消化后直到轉(zhuǎn)染開始的時(shí)間）都可能對轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)有所影響。如果在轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞過于密集，那么種到培養(yǎng)板上的就會(huì)是細(xì)胞團(tuán)塊而非單個(gè)細(xì)胞。對于某些細(xì)胞試劑組合而言，漿膜狀態(tài)被改變后有可能會(huì)影響到所用試劑和DNA的最佳配用量和配比。傳代(chun di)次數(shù)傳代次數(shù)是指對一個(gè)細(xì)胞系進(jìn)行分批傳代的頻度（通常在一個(gè)實(shí)驗(yàn)室范圍內(nèi)）。在某些情況下，自建立細(xì)胞系起的確切傳代次數(shù)無法得知。某些細(xì)胞系相比較其他細(xì)胞系而言較不穩(wěn)定，可能會(huì)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而改變，視不同的細(xì)胞系和培養(yǎng)條件

10、而定。培養(yǎng)條件的不同可引起克隆選擇。因此名稱相同的同一細(xì)胞系有關(guān)其生理學(xué)和形態(tài)學(xué)（以及轉(zhuǎn)染能力）性質(zhì)可能會(huì)有很大的差異。一般而言，細(xì)胞在凍存復(fù)蘇后的一兩代之內(nèi)或直到它們完全復(fù)蘇之前都很難轉(zhuǎn)染。在不同細(xì)胞系之間轉(zhuǎn)染效率的變化很大。某些細(xì)胞系在傳代很大次后仍能保持穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染效率，而其他一些則傳代很少次數(shù)就表現(xiàn)出轉(zhuǎn)染效率的差異。細(xì)胞數(shù)量(shling)（匯聚度）只要培養(yǎng)基質(zhì)（組織培養(yǎng)皿）尚有空間，細(xì)胞就會(huì)按指數(shù)規(guī)律分裂。對于正常細(xì)胞而言，細(xì)胞生長的速度受細(xì)胞密度大小的抑制(yzh)（接觸抑制），但癌細(xì)胞則不受此限制而會(huì)繼續(xù)生長并可互相疊加。營養(yǎng)物質(zhì)的耗竭以及代謝廢物的積聚會(huì)影響所有的細(xì)胞生長。細(xì)胞會(huì)

11、因受到營養(yǎng)物質(zhì)匱乏的壓力而不適于轉(zhuǎn)染。報(bào)告基因的表達(dá)率與轉(zhuǎn)染開始時(shí)的細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞健康以及它們隨后直到細(xì)胞溶解之前的生長情況相關(guān)。培養(yǎng)(piyng)物污染培養(yǎng)物可被細(xì)菌、酵母、真菌、病毒、支原體、甚至其他細(xì)胞種類所污染。各種污染都會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生錯(cuò)誤的結(jié)果。支原體污染支原體污染在所有培養(yǎng)細(xì)胞中的比例為5-35，它可改變細(xì)胞生長特性，酶的作用途徑，細(xì)胞膜的組成，染色體結(jié)構(gòu)，以及轉(zhuǎn)染效率。特別是，支原體對采用脂質(zhì)、DEAE-右旋糖酐、磷酸鈣或腺病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)有所干擾，其結(jié)果致使轉(zhuǎn)染效率偏低或非典型。這些效應(yīng)會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不可靠以及時(shí)間和珍貴細(xì)胞系的損失。和細(xì)菌及真菌不同，支原體污染無法通過視覺檢查

12、發(fā)現(xiàn)。它們非常小甚至能夠通過大多數(shù)的無菌濾膜；它們還對常用抗生素有抗藥性。所以必需進(jìn)行支原體污染的常規(guī)篩查。交叉(jioch)污染如果同一個(gè)實(shí)驗(yàn)室同時(shí)培養(yǎng)不同種類的細(xì)胞，那就有可能發(fā)生交叉污染，即使遵循最嚴(yán)格的分離操作規(guī)程這種情況也有可能發(fā)生。和其他細(xì)胞系之間的交叉污染不總是能通過鏡檢發(fā)現(xiàn)。如果有少量某種生長快速的細(xì)胞摻入到培養(yǎng)細(xì)胞種，幾個(gè)月過后它們就會(huì)完全取代目標(biāo)培養(yǎng)物。這種變化是逐漸發(fā)生的；而您可能甚至(shnzh)還未發(fā)現(xiàn)。建立細(xì)胞系鑒定的檢測標(biāo)準(zhǔn)。例如，對于人類細(xì)胞系而言，STR（短串聯(lián)重復(fù)序列）圖譜就是一種可靠的鑒定方法。或者更簡單的解決方案就是，當(dāng)懷疑有交叉污染時(shí)，如果有可能，就換

13、用新鮮的，傳代次數(shù)少的細(xì)胞源?！据d體(zit)DNA】一般提示：對您純化所得的載體進(jìn)行質(zhì)量檢查。確定支持其正常功能的基因序列是否適合于您的細(xì)胞體系。在對您細(xì)胞體系的參數(shù)進(jìn)行測定時(shí)，一定要選用一種您已知具有功能的對照載體。載體(zit)的完整性種載體是否具有功能取決于它結(jié)構(gòu)的完整性。轉(zhuǎn)染效率受到質(zhì)粒制備物的超螺旋結(jié)構(gòu)和舒展結(jié)構(gòu)之間比例、雙螺旋中斷、核酸酶的降解，以及來自(li z)于儲(chǔ)存和處理過程中的物理壓力的影響。載體制備物各種載體是按照不同(b tn)的方案在細(xì)菌體系中制備并純化。制備產(chǎn)物中殘余的污染物（如CsCl，內(nèi)毒素）可能會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率。載體構(gòu)造（啟動(dòng)子增強(qiáng)子ORI）轉(zhuǎn)染體系通常用帶有

14、強(qiáng)病毒調(diào)節(jié)元件（如，RSV，CMV，和 SV40）的對照載體進(jìn)行優(yōu)化和比較。然而，病毒啟動(dòng)子增強(qiáng)子體系的相對有效性在不同細(xì)胞系間的差異可大到兩個(gè)數(shù)量級(jí)。例如，在某些細(xì)胞系中，由于自發(fā)的質(zhì)粒擴(kuò)增，SV40體系可高效表達(dá) large T抗原（如，COS）；而在其他許多細(xì)胞系中，則是CMV啟動(dòng)子更為有效。除此之外，各種CMV載體的表達(dá)率也會(huì)有超過一個(gè)數(shù)量級(jí)的差異，這部分是由于載體中其他調(diào)節(jié)元件所引起的?！巨D(zhuǎn)染方案(fng n)】一般(ybn)提示：建立一套適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)染方案；首先從一種標(biāo)準(zhǔn)方案開始，然后通過改變試劑DNA的配比和形成復(fù)合物的數(shù)量進(jìn)行優(yōu)化。轉(zhuǎn)染復(fù)合物的制備(zhbi)諸如轉(zhuǎn)染試劑DNA配比

15、，離子強(qiáng)度，緩沖液pH值，以及溫度等變量都會(huì)影響到轉(zhuǎn)染復(fù)合物的組成和功能。質(zhì)粒既可在無菌水又可在TE緩沖液中稀釋。如果您要使用一種市售的轉(zhuǎn)染試劑，就應(yīng)當(dāng)仔細(xì)閱讀該試劑所提供的使用說明。需要對試劑提供方給予一定的信賴；除非您有很好的理由支持您做出改變，否則就應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格按照他們所推薦的轉(zhuǎn)染方案。在不含血清或其他蛋白的培養(yǎng)基中制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物；如果制備復(fù)合物所使用的培養(yǎng)基含有血清，它就會(huì)對轉(zhuǎn)染產(chǎn)生抑制。制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物的最佳孵育時(shí)間是一個(gè)非常關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，對于不同的轉(zhuǎn)染試劑而言可能差別很大。轉(zhuǎn)染試劑DNA配比（負(fù)載比）所有的轉(zhuǎn)染試劑都會(huì)在某一個(gè)試劑DNA配比時(shí)最為有效。有時(shí)候這種最佳配比的所在范圍非常狹窄；

16、而且對于每種實(shí)驗(yàn)體系都必須進(jìn)行優(yōu)化才能得到最佳配比。為了尋找這種最佳配比往往會(huì)花費(fèi)大量的時(shí)間和金錢。除了配比的重要性之外，所加入轉(zhuǎn)染復(fù)合物量的多少也非常關(guān)鍵。形成(xngchng)轉(zhuǎn)染復(fù)合物所用的稀釋劑對于(duy)多數(shù)試劑而言，很關(guān)鍵的一點(diǎn)是要使轉(zhuǎn)染復(fù)合物能在普通基礎(chǔ)培養(yǎng)基和鹽溶液中形成。復(fù)合物數(shù)量(shling)對轉(zhuǎn)染細(xì)胞所用的轉(zhuǎn)染試劑DNA復(fù)合物的量也應(yīng)當(dāng)進(jìn)行優(yōu)化。如果用量太少，那么轉(zhuǎn)染DNA的表達(dá)就太弱；如果用量太多，則可能由于細(xì)胞毒性或其他作用反而降低蛋白的表達(dá)。最佳用量通常都必須進(jìn)行實(shí)驗(yàn)來確定。所需要的轉(zhuǎn)染復(fù)合物用量與所用細(xì)胞的數(shù)量相關(guān)。轉(zhuǎn)染細(xì)胞越少，所需復(fù)合物就越少。轉(zhuǎn)染復(fù)合物的

17、加入有兩種替換方法可用來漿轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入轉(zhuǎn)染細(xì)胞：1. 將復(fù)合物濃縮液逐滴加入培養(yǎng)基，或者2. 將轉(zhuǎn)染復(fù)合物先用培養(yǎng)基稀釋，然后進(jìn)行培養(yǎng)基更換操作。第一種方法更簡便，而第二種方法則更因?yàn)楸苊饬嗽噭┰诰植繚饩鄱a(chǎn)生毒性，所以會(huì)使結(jié)果的一致性更好。轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染過程中所使用的培養(yǎng)基對轉(zhuǎn)染效率可能會(huì)有正面或負(fù)面的影響。甚至對于基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方而言也是如此，尤其是在培養(yǎng)基中加入牛血清的情況下。胎牛血清的存在會(huì)使多種轉(zhuǎn)染試劑的轉(zhuǎn)染效率降低。某些公司還提供可與轉(zhuǎn)染試劑配合使用的優(yōu)化無血清轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基。而由羅氏應(yīng)用科學(xué)部所提供的轉(zhuǎn)染試劑則無論是否存在血清都能有效轉(zhuǎn)染。FuGENE H D是獨(dú)一無二的能夠轉(zhuǎn)染保存

18、在100血清中腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)染試劑。如果有抗生素（如，青霉素、鏈霉素、或兩性霉素B）存在的情況下培養(yǎng)細(xì)胞，則轉(zhuǎn)染有效性會(huì)降低至25。因此，對于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，我們建議使用不加抗生素的培養(yǎng)基。【時(shí)間(shjin)進(jìn)度】一般提示：要確保最終結(jié)果的成功；建立一個(gè)合適的時(shí)間進(jìn)度進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)以保證您所需要的目標(biāo)蛋白能得到最佳(zu ji)表達(dá)。轉(zhuǎn)染的開始(kish)在轉(zhuǎn)染前12小時(shí)，將細(xì)胞分種于培養(yǎng)板中。在轉(zhuǎn)染開始時(shí)，培養(yǎng)物應(yīng)當(dāng)有約50-80匯聚，這樣就可以使它們在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)達(dá)到接近100的匯聚。如果在轉(zhuǎn)染中去掉血清，細(xì)胞可能會(huì)暫時(shí)停止生長。細(xì)胞對轉(zhuǎn)染復(fù)合物的攝取通常在0.5-6小時(shí)的時(shí)間內(nèi)完成。在這段時(shí)間后，

19、就不會(huì)再發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率有所增長。培養(yǎng)基更換(gnhun)某些轉(zhuǎn)染試劑在攝取階段之后需要更換培養(yǎng)基。如果轉(zhuǎn)染必須(bx)在沒有胎牛血清存在的條件下進(jìn)行，那么這一步驟就必不可少。至于可在血清存在的情況下使用的無毒性轉(zhuǎn)染試劑（如，F(xiàn)uGENE 6 轉(zhuǎn)染試劑(shj)或FuGENE HD 轉(zhuǎn)染試劑）時(shí)，如果有足夠的培養(yǎng)基用于后續(xù)表達(dá)階段，就可以省略這一步。如果將轉(zhuǎn)染復(fù)合物留在細(xì)胞中直到進(jìn)行檢測，那么對有些細(xì)胞系而言轉(zhuǎn)染效率會(huì)有所提高，而另外一些細(xì)胞在轉(zhuǎn)染開始幾個(gè)小時(shí)之后其轉(zhuǎn)染效率就不會(huì)再有升高。雖然在轉(zhuǎn)染步驟之后轉(zhuǎn)染試劑DNA復(fù)合物通常不一定要從培養(yǎng)體系中清除，但在此后的長期生長階段換用新鮮的培養(yǎng)基卻是

20、必須的。如果轉(zhuǎn)染細(xì)胞需要生長3-7天，換培養(yǎng)基就尤其重要，這樣一來就使它們有時(shí)間達(dá)到最高的蛋白表達(dá)量。時(shí)間測定通常在轉(zhuǎn)染開始后的24-48小時(shí)間分析報(bào)告基因的表達(dá)。在這一時(shí)間段內(nèi)，報(bào)告基因產(chǎn)物的濃度逐漸增加；而這種增加取決于增強(qiáng)子的強(qiáng)度、在表達(dá)外源蛋白中所涉及的細(xì)胞反應(yīng)，存活細(xì)胞的健康狀態(tài)，以及營養(yǎng)因素等。如果您要收集蛋白進(jìn)行純化，在轉(zhuǎn)染后等待3-7天就更為常見了。在收集蛋白時(shí)，培養(yǎng)基中加入COMPLETE完全蛋白酶抑制劑（如，目錄編號(hào)，11697498001；11836145001，可從羅氏應(yīng)用科學(xué)部獲得）用來防止蛋白降解是一個(gè)很好的措施?！居醒?xuqng)時(shí)的轉(zhuǎn)染】 血清一度曾被認(rèn)為會(huì)

21、降低轉(zhuǎn)染效率，但只要在DNA-陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物形成時(shí)不含血清，在轉(zhuǎn)染過程中是可以使用血清的。轉(zhuǎn)染過程在兩步中需要使用培養(yǎng)基做為稀釋液：在DNA-陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物準(zhǔn)備過程以及復(fù)合物同細(xì)胞接觸過程。在開始準(zhǔn)備DNA和陽離子脂質(zhì)體試劑稀釋液時(shí)要使用無血清的培養(yǎng)基，因?yàn)檠鍟?huì)影響(yngxing)復(fù)合物的形成。但在復(fù)合物形成后，在加入細(xì)胞中前可以加入血清。陽離子脂質(zhì)體和DNA的最佳量在使用血清時(shí)會(huì)有所不同，因此如果你想在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中加入血清需要對條件進(jìn)行優(yōu)化。大部分細(xì)胞可以在無血清培養(yǎng)基中幾個(gè)小時(shí)內(nèi)保持健康。對于對血清缺乏比較敏感的細(xì)胞，可以使用OPTI-MEM培養(yǎng)基，一種營養(yǎng)豐富的無血清培養(yǎng)基，

22、或者(huzh)在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中使用血清。對于對血清缺乏比較敏感的貼壁細(xì)胞，建議使用LIPOFECTAMINE 2000。 【培養(yǎng)基中的抗生素】 抗生素，比如青霉素和鏈霉素，是影響轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基添加物。這些抗生素一般對于真核細(xì)胞無毒，但陽離子脂質(zhì)體試劑增加了細(xì)胞的通透性，使抗生素可以進(jìn)入細(xì)胞。這降低了細(xì)胞的活性，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低。所以，在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中不能使用抗生素，甚至在準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染前進(jìn)行細(xì)胞鋪板時(shí)也要避免使用抗生素。這樣，在轉(zhuǎn)染前也不必潤洗細(xì)胞。對于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，不要在選擇性培養(yǎng)基中使用青霉素和鏈霉素，因?yàn)檫@些抗生素是GENETICIN選擇性抗生素的競爭性抑制劑。另外，為了保證無血清(xuqng)培養(yǎng)基中

23、細(xì)胞的健康生長，使用比含血清培養(yǎng)基更少的抗生素量?！炯?xì)胞維護(hù)(wih)和培養(yǎng)的演變】可以通過常規(guī)的次培養(yǎng)步驟保持(boch)轉(zhuǎn)染鋪板前的細(xì)胞健康。每周傳代一到兩次，稀釋程度使得下次傳代前細(xì)胞幾乎融合。不要使細(xì)胞保持融合超過24小時(shí)。 大多數(shù)已建立的細(xì)胞系都是非整倍體，原代培養(yǎng)包括了表達(dá)不同基因組合的細(xì)胞的混合物。細(xì)胞培養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)室中保存數(shù)月和數(shù)年后會(huì)經(jīng)歷突變，總?cè)旧w重組或基因調(diào)控變化等而演化。這會(huì)導(dǎo)致和轉(zhuǎn)染相關(guān)的細(xì)胞行為的變化。如果隨時(shí)間發(fā)現(xiàn)這種變化，融化一管新鮮的細(xì)胞可能會(huì)恢復(fù)原先的轉(zhuǎn)染活性。比如，新鮮融化的NIH 3T3細(xì)胞比傳代8次的細(xì)胞表現(xiàn)出更高的轉(zhuǎn)染效率。融化細(xì)胞的進(jìn)一步傳代并沒有降

24、低轉(zhuǎn)染效率。因此，如果觀察到轉(zhuǎn)染效率降低，可以試著轉(zhuǎn)染新鮮培養(yǎng)的細(xì)胞以恢復(fù)最佳結(jié)果?；蛘?，幾種來源于經(jīng)篩選，轉(zhuǎn)染效率較高細(xì)胞亞系的細(xì)胞系現(xiàn)在有售。 【細(xì)胞鋪板(pbn)密度】 用于轉(zhuǎn)染的最佳細(xì)胞(xbo)密度根據(jù)不同的細(xì)胞類型或應(yīng)用而異。一般轉(zhuǎn)染時(shí)，貼壁細(xì)胞密度為70%-90%，懸浮細(xì)胞密度為2106-4106細(xì)胞/ml時(shí)效果較好。確保轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞沒有長滿或處于靜止期。因?yàn)檗D(zhuǎn)染效率對細(xì)胞密度很敏感，所以在不同實(shí)驗(yàn)間保持一個(gè)基本的傳代步驟很重要。鋪板細(xì)胞數(shù)目的增加可以增加轉(zhuǎn)染活性和細(xì)胞產(chǎn)量。在三種不同密度進(jìn)行細(xì)胞鋪板的比較表明鋪板密度最高的，CAT活性也最高。得到最高活性所需的LIPOFECTAM

25、INE試劑的量也相應(yīng)增加了。這些結(jié)果說明，對于轉(zhuǎn)染相同(xin tn)量的DNA所需的最佳陽離子脂質(zhì)體試劑的量會(huì)因細(xì)胞密度而異。 【啟動(dòng)子的選擇】 獲得高轉(zhuǎn)染活性所需選擇的啟動(dòng)子依賴于選用的細(xì)胞系和要表達(dá)的蛋白。CMV啟動(dòng)子在大多數(shù)細(xì)胞類型中可以獲得高表達(dá)活性。同其他啟動(dòng)子，如SV40和RSV（勞斯肉瘤病毒）相比，在BHK-21中其活性最高。這三種病毒啟動(dòng)子在T細(xì)胞來源的細(xì)胞系，如Jurkat中組成表達(dá)水平較低。轉(zhuǎn)染后在培養(yǎng)基中加入PHA-L和PMA可以激活Jurkat細(xì)胞中CMV啟動(dòng)子，而單PMA就足以激活KG1和K562（人骨髓瘤白細(xì)胞）中的CMV啟動(dòng)子。SV40啟動(dòng)子的表達(dá)在含有大T抗原

26、（存在于COS-1和COS-7）時(shí)會(huì)提高，因?yàn)榇骉抗原可以刺激染色體外的合成。 【DNA量】 高質(zhì)量的DNA對于進(jìn)行高效的轉(zhuǎn)染至關(guān)重要。以前研究者使用(shyng)CsCl梯度離心得到的DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染，但是這種方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力。其他的質(zhì)粒純化技術(shù)如Marligen的High Purity Plasmid Purification System使用獨(dú)特的陰離子交換樹脂純化DNA，可以得到用于轉(zhuǎn)染的高質(zhì)量DNA。另外，Marligen的純化系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)步驟很簡單，可以在2小時(shí)內(nèi)完成。 【瞬時(shí)(shn sh)和穩(wěn)定表達(dá)】 DNA轉(zhuǎn)染后，轉(zhuǎn)入基因的表達(dá)可以在14天內(nèi)檢測到。僅有一部分轉(zhuǎn)入細(xì)胞的DNA被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)

27、胞核內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄并最終輸出mRNA到細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行蛋白合成。幾天內(nèi)，大部分外源DNA會(huì)被核酸酶降解或隨細(xì)胞分裂而稀釋；一周后就檢測不到其存在了。瞬時(shí)表達(dá)分析檢測未重組質(zhì)粒DNA上基因的表達(dá)。因此，表達(dá)水平與位置無關(guān)，不會(huì)受到周圍(zhuwi)染色體元件的影響。瞬時(shí)表達(dá)分析所需的人力和時(shí)間比穩(wěn)定表達(dá)少，但因?yàn)镈NA攝入效率和表達(dá)水平在不同實(shí)驗(yàn)中差異較大，實(shí)驗(yàn)必須很小心。為了進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)，轉(zhuǎn)入的基因必須能和細(xì)胞同步復(fù)制。在轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒自發(fā)整合到宿主基因組上時(shí)就會(huì)如此。在一小部分轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，加入的DNA通過重組整合到基因組上。包含整合DNA的細(xì)胞很少，必須通過對藥物的抗性篩選進(jìn)行擴(kuò)增或通過表型變化進(jìn)行鑒定

28、。穩(wěn)定基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)需要數(shù)周，如果需要驗(yàn)證蛋白產(chǎn)量，所需的時(shí)間更長。但得到的細(xì)胞系可以做為蛋白生產(chǎn)的穩(wěn)定來源或用于得到轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。 【瞬時(shí)(shn sh)轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染效率的監(jiān)測】 基因的瞬時(shí)表達(dá)在24-72小時(shí)內(nèi)就結(jié)束了。這種快速的瞬時(shí)表達(dá)非常適用于驗(yàn)證質(zhì)粒表達(dá)和監(jiān)測轉(zhuǎn)染步驟的效率?？梢允褂脠?bào)告基因來確定優(yōu)化條件，其表達(dá)蛋白易檢測，在目的細(xì)胞中不含此蛋白或水平很低。常用的報(bào)告基因包括氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（CAT），綠色熒光蛋白（GFP），熒光素酶（Lux或Luc）以及b- 半乳糖苷酶（b-gal）?？梢允褂煤唵蔚姆峭凰胤椒z測b-gal的表達(dá)以測定轉(zhuǎn)染效率和活性。pCMV-SPORT- bgal質(zhì)粒

29、包含CMV啟動(dòng)子調(diào)控下的LacZ基因，轉(zhuǎn)染入真核細(xì)胞內(nèi)后可以直接表達(dá)bgal。結(jié)合簡單的檢測步驟，可以做為監(jiān)測轉(zhuǎn)染條件的一種方便靈敏的方法。 【穩(wěn)定(wndng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的篩選】 連同帶有藥物抗性的篩選標(biāo)記基因一起轉(zhuǎn)染目的基因是建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系最常用的方法。氨基糖苷磷酸(ln sun)轉(zhuǎn)移酶基因（APH或neor）可以合成APH酶，通過磷酸化使藥物失活，從而提供對GENETCIN選擇性抗生素（G418 Sulfate）的抗性?？股乜剐曰蚩梢耘c目的基因在同一個(gè)質(zhì)粒上，也可以在不同的質(zhì)粒上。如果兩個(gè)不同的質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)染，兩個(gè)質(zhì)粒都可能整合形成穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子。對于兩種不同質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染，帶有目的基因

30、的質(zhì)粒和帶有篩選標(biāo)記的質(zhì)粒間的比例為3:1或更高以保證抗性克隆(k ln)帶有轉(zhuǎn)染的目的基因。陽離子脂質(zhì)體試劑提供了一種建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株的高效方法。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率的改進(jìn)一般也會(huì)提高穩(wěn)定轉(zhuǎn)染效率。比如，使用LIPOFECTAMINE PLUS試劑得到的NIH 3T3細(xì)胞GENETICIN抗生素抗性克隆的數(shù)目比單獨(dú)使用LIPOFECTAMINE增加了大約3倍。要進(jìn)行穩(wěn)定的表達(dá)分析，在轉(zhuǎn)染后次培養(yǎng)細(xì)胞，低密度鋪板，給予生長空間，在幾天或數(shù)周內(nèi)保持篩選壓力。生長的細(xì)胞比不分裂的細(xì)胞更快的受到GENETICIN抗生素的影響。轉(zhuǎn)染后，在開始篩選前等待48-72小時(shí)，使細(xì)胞表達(dá)足夠量的抗性酶，保證在開始篩選時(shí)可

31、以自我保護(hù)。轉(zhuǎn)染后48-72小時(shí)倒掉培養(yǎng)基，加入含有GENETICIN抗生素的培養(yǎng)基，抗生素的濃度根據(jù)劑量反應(yīng)曲線確定，足夠殺死未轉(zhuǎn)染細(xì)胞。因?yàn)樵S多因子影響到篩選所需的GENETICIN抗生素的最佳濃度，包括細(xì)胞類型，培養(yǎng)基和血清濃度等，所以有必要對每種細(xì)胞作一個(gè)劑量反應(yīng)曲線，確定最佳濃度（參見第7章實(shí)驗(yàn)步驟）。篩選最多可能需要一周時(shí)間，因?yàn)樵谥滤绖┝康腉ENETICIN抗生素存在條件下，細(xì)胞會(huì)分裂1-2次。在次培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)使用較低劑量的抗生素，一般是篩選劑量的一半。篩選后的細(xì)胞一般是離散的克隆，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌梢苑謩e純化（克?。占M(jìn)行大量培養(yǎng)或染色并進(jìn)行抗性克隆的計(jì)數(shù)。 【蛋白表達(dá)(b

32、iod)和培養(yǎng)基的選擇】 哺乳動(dòng)物細(xì)胞系合成可溶的，翻譯后修飾的蛋白，比細(xì)菌，真菌或昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的蛋白更有可能有生物活性。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可以合成大量的重組蛋白，而瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞可以快速表達(dá)，迅速地合成小量蛋白。常用的細(xì)胞系包括CHO，293和COS-7。Invitrogen提供克隆的293-F，293-H，COS-7和CHO-S細(xì)胞，來源于經(jīng)篩選轉(zhuǎn)染效率更高的亞細(xì)胞系。這些細(xì)胞也可用于無血清(xuqng)和限定化學(xué)成分培養(yǎng)基。重組蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)一般在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的懸浮細(xì)胞中進(jìn)行。這些細(xì)胞易于生長到高密度并合成更多蛋白。使用基質(zhì)珠做為固相支持可以使貼壁細(xì)胞懸浮生長。用于蛋白生產(chǎn)的細(xì)胞的轉(zhuǎn)染可以在添

33、加有血清或無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行。但更傾向于使用無血清培養(yǎng)基表達(dá)蛋白，因?yàn)檠宓鞍讜?huì)干擾下游表達(dá)蛋白的純化。無血清培養(yǎng)基一般針對某一特定細(xì)胞類型優(yōu)化并有幾類無血清培養(yǎng)基不需要添加血清，一般含有不均一的或大量的蛋白（但比添加血清的培養(yǎng)基低得多）。無蛋白培養(yǎng)基不含蛋白但可能含有不明成分的抽提物。限定化學(xué)成分的培養(yǎng)基不含有蛋白或未知組成的成分。多種多樣的配方使您可以選擇最適合您應(yīng)用的一種。在含血清時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可以適應(yīng)無血清培養(yǎng)基，無蛋白培養(yǎng)基或限定化學(xué)成分的培養(yǎng)基。在部分情況下（如293-F，293-H，COS-7和CHO-S），對于已適應(yīng)無血清或無蛋白培養(yǎng)基的細(xì)胞，可以使用其培養(yǎng)基進(jìn)行轉(zhuǎn)染。其他一些無

34、血清培養(yǎng)基包含抑制陰離子脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染的成分。在這些情況下，有必要在諸如D-MEM或OPTI-MEM等培養(yǎng)基中進(jìn)行(jnxng)培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染。 脂質(zhì)體介導(dǎo)DNA轉(zhuǎn)染法脂質(zhì)體(lipofectin regeant,LR)試劑是陽離子脂質(zhì)體N-1-2，3-Dioleyoxy, Propyl-n, n,n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA)和Dioleoyl photidye-thanolamine(DOPE)的混合物1:1(w/w)。它適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮(xunf)或貼壁培養(yǎng)細(xì)胞中，是目前條件下最方便的轉(zhuǎn)染方法之一。轉(zhuǎn)染率高，優(yōu)于磷酸鈣法，比它高5100倍，能把

35、DNA和RNA轉(zhuǎn)染到各種細(xì)胞。 用LR進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)，首先需優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，應(yīng)找出該批LR對轉(zhuǎn)染某一特定細(xì)胞適合(shh)的用量、作用時(shí)間等，對每批LR都要做：第一，先要固定一個(gè)DNA的量和DNA/LR混合物與細(xì)胞相互作用的時(shí)間，DNA可從15g和孵育時(shí)間6小時(shí)開始，按這兩個(gè)參數(shù)繪出相應(yīng)LR需用量的曲線，再選用LR和DNA兩者最佳(zu ji)的劑量，確定出轉(zhuǎn)染時(shí)間(224小時(shí))。因LR對細(xì)胞有一定的毒性，轉(zhuǎn)染時(shí)間以不超過24小時(shí)為宜。 細(xì)胞種類：COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何(rnh)一種細(xì)胞均可作為受體細(xì)胞。 1、操作步驟方法(fngf)一： (1)：取6孔培養(yǎng)(

36、piyng)板(或用35mm培養(yǎng)皿)，向每孔中加入2mL含12105個(gè)液，37CO2培養(yǎng)至40%60%匯合時(shí)(匯合過分，轉(zhuǎn)染后不利篩選細(xì)胞)。 (2)轉(zhuǎn)染液制備：在聚苯乙稀管中制備以下兩液(為轉(zhuǎn)染每一個(gè)孔細(xì)胞所用的量)A液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋1-10g DNA，終量100L，B液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋2-50gLR，終量100L,輕輕混合A、B液，室溫中置10-15分鐘，稍后會(huì)出現(xiàn)微濁現(xiàn)象，但并不妨礙轉(zhuǎn)染(如出現(xiàn)沉淀可能因LR或DNA濃度過高所致，應(yīng)酌情減量)。 (3)轉(zhuǎn)染準(zhǔn)備：用2mL不含血清培養(yǎng)液漂洗兩次，再加入1mL不含血清培養(yǎng)液。 (4)轉(zhuǎn)染：把A/B復(fù)合物緩緩加入培養(yǎng)液中，搖勻，3

37、7溫箱置624小時(shí)，吸除無血清轉(zhuǎn)染液，換入正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。 (5)其余處理如觀察、篩選、檢測等與其它轉(zhuǎn)染法相同。 注意：轉(zhuǎn)染時(shí)切勿加血清，血清對轉(zhuǎn)染效率有很大影響。 2、快速脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法操作步驟如下(rxi)方法二： (1)以5105細(xì)胞(xbo)/孔接種6孔板(或35mm培養(yǎng)皿)培養(yǎng)24小時(shí)(xiosh)，使其達(dá)到5060%板底面積。 (2)在試管中配制DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物方法如下： 在1mL無血清DMEM中稀釋PSV2-neo質(zhì)粒DNA或供體DNA。 旋轉(zhuǎn)1秒鐘，再加入脂質(zhì)體懸液，旋轉(zhuǎn)。 室溫下放置510分鐘，使DNA結(jié)合在脂質(zhì)體上。 (3)棄去細(xì)胞中的舊液，用1mL無血清DMEM洗細(xì)

38、胞一次后棄去，向每孔中直接加入1mL DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物，37培養(yǎng)35小時(shí)。 (4)再于每孔中加入20%FCS的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)1424小時(shí)， (5)吸出DMEM/DNA/脂質(zhì)體混合物加入新鮮10%FCS的DMEM，2mL/孔，再培養(yǎng)2448小時(shí)。(6)用細(xì)胞刮或消化法收集細(xì)胞，以備分析鑒定。 穩(wěn)定的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法如下： (1)接種細(xì)胞同前，細(xì)胞長至50%板底面積可用于轉(zhuǎn)染。 (2)DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物制備轉(zhuǎn)染細(xì)胞同前(2)、(3)步驟。 (3)在每孔中加入1mL、20%FCS的DMEM，37培養(yǎng)48小時(shí)。 (4)吸出DMEM，用G418選擇培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞，使細(xì)胞生長一定時(shí)間，篩選轉(zhuǎn)染克隆

39、，方法參照(cnzho)細(xì)胞篩選法進(jìn)行。轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)(shyn)要注意的一些事項(xiàng)DNA轉(zhuǎn)染后，轉(zhuǎn)入(zhun r)基因的表達(dá)可以在14天內(nèi)檢測到僅有一部分轉(zhuǎn)入細(xì)胞的DNA被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄并最終輸出mRNA到細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行蛋白合成。幾天內(nèi)，大部分外源DNA會(huì)被核酸酶降解或隨細(xì)胞分裂而稀釋；一周后就檢測不到其存在了。因此轉(zhuǎn)染也可以分為瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染（transient transfection）指的是轉(zhuǎn)染的核酸不整合到染色體上，結(jié)果是短暫的高水平表達(dá)，可在2496小時(shí)內(nèi)檢測表達(dá)效果，表達(dá)水平與位置無關(guān)，不會(huì)受到周圍染色體元件的影響。瞬時(shí)表達(dá)分析所需的人力和時(shí)間比穩(wěn)定表達(dá)少，但因?yàn)镈N

40、A攝入效率和表達(dá)水平在不同實(shí)驗(yàn)中差異較大，不長久也不穩(wěn)定。超螺旋質(zhì)粒轉(zhuǎn)染更傾向于瞬時(shí)表達(dá)。瞬時(shí)表達(dá)適合研究啟動(dòng)子等調(diào)控元件不過，誘導(dǎo)型的啟動(dòng)子除外。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，就是轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒DNA整合到染色體上，或者相當(dāng)于附加子（episome）可持續(xù)存在，使得轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可長期表達(dá)。外源基因整合的幾率很小，要獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株，通常需要有篩選標(biāo)記（比如抗性基因）共同轉(zhuǎn)染，通過選擇壓力維持表達(dá)的穩(wěn)定不行的統(tǒng)統(tǒng)槍斃了。質(zhì)粒整合到染色體上本來就是件稀罕事兒，平均萬分之一的幾率，如果是線性化DNA轉(zhuǎn)染，那整合的幾率就高多了。不過怎么整合也就是一個(gè)或者有限的幾個(gè)拷貝，所以表達(dá)量往往比較不高的。但是，“壓倒一切的是穩(wěn)定”

41、，很多時(shí)候，轉(zhuǎn)染后往往要進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)的篩選。成功(chnggng)轉(zhuǎn)染第一步：細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng) 細(xì)胞系的選擇通常不是我們說了算的。有時(shí)是實(shí)驗(yàn)的需要，有時(shí)是實(shí)驗(yàn)室條件的限制。如果有選擇的余地當(dāng)然挑個(gè)容易做的。越是接近體內(nèi)的真實(shí)情況的原代細(xì)胞，通常越是難于伺候。反之亦然。此外細(xì)胞本身的特性也是需要考慮的因素。有時(shí)需要根據(jù)細(xì)胞系來選擇合適的轉(zhuǎn)染方法；而有時(shí)一些啟動(dòng)子在不同的細(xì)胞系中表現(xiàn)的功能也不同。這些都是設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)需要考慮的因素，姑且不論。不過因?yàn)?yn wi)受限于特定的細(xì)胞，如何選擇合適的轉(zhuǎn)染方法就值得考究了。因?yàn)椴煌募?xì)胞可能適用不同的轉(zhuǎn)染試劑和轉(zhuǎn)染條件。如果實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立了全套方法，照做可

42、也。如果是個(gè)新來的細(xì)胞株，最好查查資料看哪些成功轉(zhuǎn)染案例。每種轉(zhuǎn)染試劑都會(huì)提供一些已經(jīng)成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株列表和文獻(xiàn)，看看其中是否有你的新對手這個(gè)FuGENE 6 比較有優(yōu)勢(yush)，已有750多種細(xì)胞系成功轉(zhuǎn)染的資料可供參考。當(dāng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行到轉(zhuǎn)染這一步時(shí)需要注意(zh y)的因素有哪些呢？一、健康而茁壯成長(zhu zhung chng zhng)的細(xì)胞 轉(zhuǎn)染前細(xì)胞最好(zu ho)經(jīng)過12次傳代，以保證細(xì)胞生長旺盛，容易轉(zhuǎn)染。注意，貼壁細(xì)胞生長到幾乎匯片時(shí)就要趕快進(jìn)行下一次傳代，千萬不要使細(xì)胞保持融合超過24小時(shí)。 大多數(shù)已建立的細(xì)胞系都是非整倍體，細(xì)胞培養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)室中保存數(shù)月和數(shù)年后會(huì)經(jīng)歷突變

43、，總?cè)旧w重組或基因調(diào)控變化等而演化，這會(huì)導(dǎo)致和轉(zhuǎn)染相關(guān)的細(xì)胞行為的變化。如果隨時(shí)間發(fā)現(xiàn)這種變化，融化一管新鮮的細(xì)胞可能會(huì)恢復(fù)原先的轉(zhuǎn)染活性。比如，新鮮融化的NIH 3T3細(xì)胞比傳代8次的細(xì)胞表現(xiàn)出更高的轉(zhuǎn)染效率（融化細(xì)胞的進(jìn)一步傳代不會(huì)馬上降低轉(zhuǎn)染效率）。因此，如果觀察到轉(zhuǎn)染效率降低，可以試著轉(zhuǎn)染新鮮培養(yǎng)的細(xì)胞以恢復(fù)最佳結(jié)果。二、恰到好處的鋪板密度 轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞密度對轉(zhuǎn)染效率影響非常顯著。不同的轉(zhuǎn)染試劑，要求轉(zhuǎn)染時(shí)的最適細(xì)胞密度各不相同，即使同一種試劑，也會(huì)因不同的細(xì)胞類型或應(yīng)用而異。轉(zhuǎn)染時(shí)過高或者過低的細(xì)胞密度會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率降低，乃至表達(dá)水平偏低。因此如果選用新的細(xì)胞系或者新的轉(zhuǎn)染試劑，最

44、好能夠進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)并為以后的實(shí)驗(yàn)建立一個(gè)穩(wěn)定方法，包括適當(dāng)?shù)慕臃N量和培養(yǎng)時(shí)間等等。一般轉(zhuǎn)染時(shí)貼壁細(xì)胞密度為40%-80%，但這個(gè)需要(xyo)參考所選轉(zhuǎn)染試劑的說明書陽離子脂質(zhì)體具有微量的細(xì)胞(xbo)毒性而往往需要更高的鋪板密度或者更多的懸浮細(xì)胞數(shù)，有的要求細(xì)胞90%匯片；而有些多胺或者非脂質(zhì)體的配方則要求在40%80%之間，總之是盡量(jnling)在細(xì)胞最適的生理狀態(tài)下轉(zhuǎn)染，以求最佳的轉(zhuǎn)染效果。 不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊矔?huì)影響轉(zhuǎn)染時(shí)的鋪板密度，比如研究細(xì)胞周期相關(guān)基因等表達(dá)周期長的基因，就需要較低的鋪板密度，所以需要選擇能夠在較低鋪板密度下進(jìn)行轉(zhuǎn)染的試劑。需要特別注意。三、溫暖舒適的培養(yǎng)基 健康

45、的細(xì)胞培養(yǎng)是一切成功(chnggng)轉(zhuǎn)染的基礎(chǔ)。不同的細(xì)胞類型有不同的特性，需要特定的培養(yǎng)基、血清、補(bǔ)充添加劑等等。血清(xuqng) 血清一度曾被認(rèn)為會(huì)降低轉(zhuǎn)染效率，老一代的轉(zhuǎn)染方法往往要求轉(zhuǎn)染前后洗細(xì)胞或者在無血清培養(yǎng)基條件下轉(zhuǎn)染，對于(duy)某些對血清要求敏感的細(xì)胞來說是個(gè)難題。不過轉(zhuǎn)染產(chǎn)品配方幾經(jīng)革新后的今天，對于主流的轉(zhuǎn)染試劑來說，血清的存在已經(jīng)不會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率，甚至還有助于提高轉(zhuǎn)染效率，比如FuGENE6、Effectene和GeneJuice等。對于多數(shù)可以在有血清條件下工作的轉(zhuǎn)染試劑來說，血清的存在會(huì)影響DNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物的形成，但只要在DNA-轉(zhuǎn)染復(fù)合物形成時(shí)用無血清培養(yǎng)基

46、來稀釋DNA和轉(zhuǎn)染試劑就可以了，在轉(zhuǎn)染過程中是可以使用血清的。這些方便好用、可在有血清條件下轉(zhuǎn)染的試劑包括前面介紹的Lipofectamine2000，F(xiàn)uGENE 6，GeneJuice，Effectene，Polyfect等等。最厲害的是Qiagen的2個(gè)產(chǎn)品，Polyfect和Effectene，全程都可以用有血清和抗生素等添加劑的完全培養(yǎng)基來操作，包括稀釋步驟，不用擔(dān)心培養(yǎng)基的變化對細(xì)胞生長有什么不良影響了。這樣，就不再需要在轉(zhuǎn)染前多次洗細(xì)胞，也就減少操作的復(fù)雜程度，更重要的是不必再讓細(xì)胞處于無血清的“悲慘環(huán)境”中轉(zhuǎn)染，不必?fù)?dān)心對血清缺乏很敏感的細(xì)胞受到不必要的麻煩了。嬌貴的細(xì)胞們，你

47、們有福了。不過要特別注意：對于RNA轉(zhuǎn)染，如何消除血清中潛在的RNase污染是值得關(guān)注的。所以血清的質(zhì)量也是需要關(guān)注的。新加培養(yǎng)基的預(yù)熱對細(xì)胞轉(zhuǎn)染很有幫助?？股?支原體、細(xì)菌、真菌污染，無論對于細(xì)胞培養(yǎng)或者轉(zhuǎn)染都可能會(huì)嚴(yán)重影響(yngxing)轉(zhuǎn)染結(jié)果，細(xì)胞培養(yǎng)過程中往往會(huì)添加抗生素來防止污染。但是這些添加劑可能對轉(zhuǎn)染造成麻煩。比如青霉素和鏈霉素，就是影響轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基添加物。這些抗生素一般對于真核細(xì)胞無毒，但陽離子脂質(zhì)體試劑增加了細(xì)胞的通透性，使抗生素可以進(jìn)入細(xì)胞。這可能間接導(dǎo)致細(xì)胞死亡，造成轉(zhuǎn)染效率低。所以，對于選擇Lipofectamine2000系列轉(zhuǎn)染試劑的實(shí)驗(yàn)，要特別注意在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)

48、基中不能使用抗生素，甚至在準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染前進(jìn)行細(xì)胞鋪板時(shí)也要避免使用抗生素。這樣，在轉(zhuǎn)染前也不必潤洗細(xì)胞。對于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，不要在選擇性培養(yǎng)基中使用青霉素和鏈霉素，因?yàn)檫@些抗生素是GENETICIN選擇性抗生素的競爭性抑制劑。另外，為了保證無血清培養(yǎng)基中細(xì)胞的健康生長，使用比含血清培養(yǎng)基更少的抗生素量。這里又要表揚(yáng)Qiagen的2個(gè)產(chǎn)品，Polyfect和Effectene，因?yàn)槿潭伎梢杂糜醒搴涂股氐忍砑觿┑耐耆囵B(yǎng)基來操作，很方便的。對于篩選穩(wěn)定表達(dá)株，要預(yù)留足夠的時(shí)間讓抗性基因表達(dá)后再添加篩選壓力。其他添加物如抗生素，EDTA，檸檬酸鹽，磷酸鹽，RPMI，硫酸軟骨素，透明質(zhì)酸，硫酸葡聚糖或其他

49、硫酸蛋白多糖這些物質(zhì)的存在可能會(huì)干擾DNA和轉(zhuǎn)染試劑(shj)形成復(fù)合物的過程，要盡量避免。一、質(zhì)粒的構(gòu)建(u jin)：啟動(dòng)子的選擇 啟動(dòng)子的選擇對于轉(zhuǎn)染基因的有效表達(dá)是非常重要的。對于轉(zhuǎn)染過程本身雖然(surn)無甚影響，但是對轉(zhuǎn)染結(jié)果卻有著微妙的影響。 啟動(dòng)子可分為2大類：誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是比較精明的，平時(shí)歇著，一旦接到誘導(dǎo)信號(hào)指示就馬上開工干活兒。而組成型啟動(dòng)子比較老實(shí)的，就是從頭到尾不停干活從不閑著的那種比如我們很熟悉的CMV啟動(dòng)子，SV40，pMC1，PGK啟動(dòng)子等等。 獲得高轉(zhuǎn)染活性所需選擇的啟動(dòng)子依賴于選用的細(xì)胞系和要表達(dá)的蛋白。CMV啟動(dòng)子在大多數(shù)細(xì)胞類型中可以獲得高表達(dá)活性。在

50、BHK-21中，CMV啟動(dòng)子活性比其他啟動(dòng)子如SV40和RSV都要高。但這三種病毒(bngd)啟動(dòng)子在T細(xì)胞來源的細(xì)胞系，如Jurkat中組成表達(dá)水平較低。轉(zhuǎn)染后在培養(yǎng)基中加入PHA-L和PMA可以激活Jurkat細(xì)胞中CMV啟動(dòng)子，而單PMA就足以激活KG1和K562（人骨髓瘤白細(xì)胞）中的CMV啟動(dòng)子。SV40啟動(dòng)子的表達(dá)在含有T抗原（存在于COS-1和COS-7）時(shí)會(huì)提高，因?yàn)門抗原可以刺激染色體外的合成。 一個(gè)強(qiáng)悍的高表達(dá)組成(z chn)型啟動(dòng)子是我們做表達(dá)所求之不得的，但是對于轉(zhuǎn)染本身來說卻不一定好因?yàn)槿魏纬掷m(xù)過高表達(dá)外源基因都可能帶來某種程度的細(xì)胞毒性，影響(yngxing)細(xì)胞生

51、長如果外源基因本身對細(xì)胞生長有毒，那更完蛋了，你很可能篩不到轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞株，更別提穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了因?yàn)檫^量表達(dá)本身可能已經(jīng)害死了那個(gè)轉(zhuǎn)染了的細(xì)胞，沒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞又死于篩選壓力。這種時(shí)候一個(gè)不那么“能干”的啟動(dòng)子可能更適合一些。如果你曾經(jīng)遇到原因不明的轉(zhuǎn)染失敗案例，會(huì)不會(huì)是這個(gè)原因呢？過猶不及就是這個(gè)道理咯。 誘導(dǎo)型啟動(dòng)子對于轉(zhuǎn)染來說，特別是穩(wěn)定(wndng)轉(zhuǎn)染，可能是更好的選擇。它使得目的基因的表達(dá)可以受到我們的調(diào)控轉(zhuǎn)染的時(shí)候不表達(dá)，篩選穩(wěn)定表達(dá)株后再誘導(dǎo)表達(dá)，使得表達(dá)有毒性的基因或者精確分析表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)效應(yīng)(xioyng)成為可能。多數(shù)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子在接受某種信號(hào)后“打開(d ki)開關(guān)”開始工作，也有的相反，在缺失某種信號(hào)后打開開關(guān)。Clontech還有個(gè)誘導(dǎo)系統(tǒng)是“劑量依賴的”，就是說不單表達(dá)開關(guān)可控，表達(dá)量多少也可以通過誘導(dǎo)劑的量來調(diào)控。還有一種特殊的啟動(dòng)子很好玩具有時(shí)序性或者組織特異性（空間特異性），會(huì)受到特定的元件調(diào)控，在一定的時(shí)間或者特定組織細(xì)胞中表達(dá)的，比如那個(gè)轉(zhuǎn)基因山羊奶里用的只在泌乳期的乳腺細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子有人說這是組成型的，我覺得應(yīng)該是誘導(dǎo)型的，只不過誘導(dǎo)的因素我們不知道罷了，這類啟動(dòng)子在不同的細(xì)胞中會(huì)有不同的表現(xiàn)，需要注意。誘導(dǎo)系統(tǒng)的問題主要是本底表達(dá)，表達(dá)量有限，以及誘導(dǎo)劑本身對細(xì)胞的影響和如何清除。 轉(zhuǎn)染DNA的