聚丙烯酰胺凝膠電泳課件

1、核酸電泳技術(shù)教學(xué)目的掌握瓊脂糖凝膠電泳分離DNA的基本原理和技術(shù)流程。常用電泳1、瓊脂糖凝膠電泳：一般用于核酸的分離分析。瓊脂糖凝膠孔徑度較大，對大部分蛋白質(zhì)只有很小的分子篩效應(yīng)。2、聚丙烯酰胺凝膠電泳：可用于核酸和蛋白質(zhì)的分離、純化及檢測。其分辨率較高。瓊脂糖和聚丙烯酰胺是目前實(shí)驗(yàn)室最常用的支持介質(zhì) 瓊脂糖核酸凝膠電泳是分子克隆核心技術(shù)之一，用于分離、鑒定和純化DNA或RNA片段 優(yōu)點(diǎn)：1.對蛋白質(zhì)吸附極微，故無拖尾現(xiàn)象。 2.凝膠結(jié)構(gòu)均勻，孔徑較大，可用來分離酶的復(fù)合物、核酸、病毒 等大分子物質(zhì)。 3.透明度較好，可直接或干燥成薄膜后進(jìn)行染色。 4.不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定

2、量測定 5.有熱可逆性瓊脂糖凝膠的特點(diǎn) 缺點(diǎn)：1.瓊脂糖支持層上的區(qū)帶易于擴(kuò)散，電泳后必須立即固定染色。 2.與PAGE相比，分子篩作用小，區(qū)帶少。 瓊脂糖的基本結(jié)構(gòu)是由 1,3 連結(jié)的 -D- 半乳糖和 1,4 連結(jié)的 3,6- 脫水 -L- 半乳糖相間聯(lián)結(jié)而成。瓊脂糖在水中一般加熱到 90 以上溶解，溫度下降到 35 -40 液體形成良好的半固體狀的凝膠。瓊脂糖的凝膠性是由存在的氫鍵所致，凡是能破壞氫鍵的因素都能導(dǎo)致凝膠性的破壞。 1,3 連結(jié)1, 連結(jié)1, 連結(jié)3,6- 脫水3,6- 脫水 核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基團(tuán)，呈負(fù)離子化狀態(tài)；核酸分子在一定的電場強(qiáng)度的電場中，它們會向正電

3、極方向遷移，其遷移速率又受到多方面因素的影響。瓊脂糖凝膠電泳工作原理+-PowerDNA-+電鏡下觀察其顯微結(jié)構(gòu)(11m) 制備好的瓊脂糖凝膠是多孔的，可以使DNA通過 電壓、緩沖液、瓊脂糖濃度、DNA片段的大小、DNA構(gòu)象等均會決定DNA的遷移速率 小片段DNA比大片段DNA在其他條件相同下泳動速率要快 瓊脂糖濃度越低，相同核酸分子遷移越快 同一分子：超螺旋環(huán)狀線狀切口環(huán)狀DNA遷移速率的決定因素+-Power smalllarge 線形DNA分子，其電場中的遷移率與其相對分子質(zhì)量的對數(shù)值成反比不同類型瓊脂糖的性質(zhì) 瓊脂糖類型凝結(jié)溫度/熔化溫度/ 備注 標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖35389095不同廠家生產(chǎn)

4、的不同商品其凝結(jié)溫度和熔化溫度有一定差異40428590 高強(qiáng)度瓊脂糖34438595 修飾的低熔點(diǎn)/ 凝點(diǎn)瓊脂糖253563653565 超低熔點(diǎn)8154045 低黏性低熔點(diǎn)瓊脂糖25307038853075不同類型瓊脂糖分離DNA片段的范圍濃 度（%）標(biāo) 準(zhǔn)(kb)高強(qiáng)度(kb)低熔點(diǎn)(kb)低黏度低溶點(diǎn)(kb)0.31500.50.7250.80.5150.8100.8101.00.25120.480.481.20.1560.370.371.50.0840.240.242.00.130.133.00.0510.514.00.10.56.00.010.1瓊脂糖緩沖液三角燒瓶瓊脂糖凝膠的配制

5、 瓊脂糖的稱量 欲配制100ml 1% 濃度的瓊脂糖凝膠，稱取1g瓊脂糖粉，倒入指定三角瓶中，加入100ml 1TBE 瓊脂糖凝膠電泳的設(shè)備電泳槽電源電泳槽蓋子瓊脂糖凝膠容器梳子 如右圖將梳子佳好，注意觀察梳子的底部應(yīng)不與容器接觸，以免做出的膠漏孔。煮膠瓊脂糖在常溫下是不融的煮化后呈透明狀* 在微波爐中煮化時(shí)要小心不要讓凝膠暴沸，要間歇性煮。待三角瓶冷卻到60 左右時(shí)倒膠，趕走氣泡保證每個(gè)梳子齒均能插入膠5mm左右即可待膠凝固后，小心拔去梳子，拔出時(shí)注意不要破壞膠孔.用刀片切下所需的膠塊，放入加有足夠電泳緩沖液(1TBE)的電泳槽中，緩沖液面高于凝膠表面35mm即可倒膠上樣 電泳操作方法： 可

6、在一干凈手套上點(diǎn)滴適量(13uL)的3溴酚蘭上樣緩沖液(深綠色)，用槍移取適量的樣品(110uL)與滴加好的溴酚蘭上樣緩沖液混合(可觀察到混合液變?yōu)樗{(lán)色)，再將混合液小心加入膠上的樣品孔中。 上樣要迅速準(zhǔn)確，上樣量不要過大以致漫出樣品孔 若樣品要求無污染，可使用新的滅菌槍頭上樣 若樣品無嚴(yán)格要求(如用來做小量酶切鑒定的樣品)，可用一個(gè)槍頭多次上樣，但每次上樣前在電泳緩沖液中洗幾下 電源接對正負(fù)極注意事項(xiàng)：2000bp1200bp 750bp 500bp200bp80bp熒光染料的選擇溴化乙錠（ethidium bromide，EB）SYBR GreenadvantagesInexpensive

7、Less toxicNo UV light requiredNo hazardous waste disposaldisadvantagesLess sensitiveMore DNA needed on gelLonger staining/destaining time花青素屬于酚類化合物中的類黃酮類(flavonoids)。基本結(jié)構(gòu)包含二個(gè)苯環(huán)，并由一3碳的單位連結(jié)(C6- C3-C6)。花青素因所帶羥基數(shù)(-OH)、甲基化(methylation)、醣基化(glycosylation)數(shù)目、醣種類和連接位置等因素而呈現(xiàn)不同顏色。顏色的表現(xiàn)因生化環(huán)境條件的改變，如受花青素濃度、共色作用、

8、液胞中pH値的影響 自然界有超過300種不同的花青素。實(shí)驗(yàn)材料50TBE：用蒸餾水稀釋標(biāo)準(zhǔn)DNA溶液（DNA Marker）：上樣15ul，已加好上樣緩沖液和核酸染料。DNA樣品：PCR產(chǎn)物，已加好上樣緩沖液和核酸染料，上樣10ul。1%瓊脂糖：已用1TBE熔好。實(shí)驗(yàn)流程-1熔好的瓊脂糖冷卻到60度左右（不燙手）倒入到膠槽中，每個(gè)槽約45-50ml。配置500ml電泳緩沖液（1TBE），倒入電泳槽中，調(diào)節(jié)水平。膠凝好后（變成白色）小心拔掉梳子，將膠槽放入電泳槽中，有梳子的一側(cè)朝電泳槽負(fù)極（黑色插頭）。用微量進(jìn)樣器排掉上樣孔中的氣泡。每排（4組）共用一塊膠，DNA樣每組上一個(gè)。DNA Marker一塊膠上兩個(gè)。120V電泳40分