第十一章基于靶點結(jié)構(gòu)的藥物分子設(shè)計[可修改版ppt]

1、第十一章基于靶點結(jié)構(gòu)的藥物分子設(shè)計【學(xué)習(xí)要求】1. 掌握基于靶點結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計、全新藥物設(shè)計、計算機(jī)虛擬篩選、基于片段藥物設(shè)計的基本概念。2. 熟悉蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測法、分子對接方法及分類、基于片段藥物設(shè)計的基本思路、基于片段藥物設(shè)計的優(yōu)點；片段篩選的主要檢測技術(shù)；片段優(yōu)化的常用方法。3. 了解全新藥物設(shè)計的常用方法、磁共振檢測技術(shù)的分類和原理；SAR-by-NMR的原理和應(yīng)用；Tether和二次Tether技術(shù)的原理；結(jié)晶篩選的研究流程?；诎悬c結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計是指一般應(yīng)用由X射線衍射、磁共振或分子模擬（同源建模法等）提供的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息，來輔助設(shè)計具有生物活性的化合物的過程?；谂潴w結(jié)構(gòu)的藥

2、物設(shè)計是從研究一系列藥物分子對同一受體的活性出發(fā)，比較它們的結(jié)構(gòu)變化與生物活性之間的關(guān)系，找到對該受體能發(fā)生結(jié)合并產(chǎn)生活性的最普遍的結(jié)構(gòu)因素，并根據(jù)此結(jié)構(gòu)特征設(shè)計新的藥物分子。以靶點結(jié)構(gòu)為主的藥物設(shè)計可分為三大類全新藥物設(shè)計：根據(jù)靶點活性位點構(gòu)建配體分子對接：以靶點結(jié)構(gòu)來搜尋配體基于片段的藥物設(shè)計：根據(jù)靶點活性位置來構(gòu)建配體片段基于生物大分子靶點結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計方法 第一節(jié) 靶蛋白結(jié)構(gòu)的預(yù)測 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能研究已成為后基因組時代最具挑戰(zhàn)性的研究課題。當(dāng)前測定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的主要方法仍然是X-射線晶體學(xué)方法和多維核磁共振技術(shù)。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的測定速度卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于基因組測序和氨基酸序列的測定速度，無法滿足

3、蛋白組學(xué)及其相關(guān)的學(xué)科需要。 （1）目標(biāo)序列與模板序列的比對；（2）根據(jù)同源蛋白的多重序列比對結(jié)果，確定同源蛋白的結(jié)構(gòu)保守區(qū)以及相應(yīng)的框架結(jié)構(gòu)；（3）目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)保守區(qū)的主鏈建模；（4）目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變異區(qū)的主鏈建模；（5）側(cè)鏈的安裝和優(yōu)化；（6）對模建結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化和評估。 同源模建的主要步驟序列比對序列比對是同源模建的關(guān)鍵，大多數(shù)的序列比對方法都是以目標(biāo)蛋白質(zhì)和模板蛋白質(zhì)序列之間的相似性為基礎(chǔ)的，其準(zhǔn)確性可以通過進(jìn)行多序列比對得到提高。目前常用的序列比對程序有FASTA和BLAST等。許多藥物設(shè)計軟件公司也開發(fā)了同源模建法預(yù)測蛋白的軟件模塊，如Tripos公司的Composer、Accel

4、yrs公司的Homology等。折疊識別（fold recognition） 當(dāng)目標(biāo)蛋白質(zhì)找不到已知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)作模板時，可以采用蛋白質(zhì)折疊識別方法進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測。 折疊識別法就是總結(jié)出已知的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模式作為目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行匹配的模式，然后經(jīng)過現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫的觀察，總結(jié)出可以區(qū)分正誤結(jié)構(gòu)的平均勢函數(shù)作為判別標(biāo)準(zhǔn)，來選擇最佳的匹配方式。 從頭預(yù)測（de novo prediction） 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)從頭預(yù)測是一個尚未成熟的研究領(lǐng)域，但發(fā)展?jié)摿κ志薮?。因為該方法不需要知道任何一個目標(biāo)序列的同源蛋白質(zhì)，僅從蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)預(yù)測其高級結(jié)構(gòu)，一旦從頭預(yù)測的方法獲得重大突破，將有助于人們理解蛋白質(zhì)折疊的過

5、程，影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的因素等基本問題。 活性位點的分析方法通過探針來探測簡單的分子或碎片如何能夠與生物大分子的活性位點很好地結(jié)合。用于分析的探針可以是一些簡單的分子或碎片，例如水或苯環(huán)作為探針，通過分析它們與活性位點的相互作用情況，可以找到這些分子或碎片在活性部位中的可能結(jié)合位置?；钚晕稽c分析法通常不能直接產(chǎn)生完整的配體分子，但它得到的有關(guān)靶點結(jié)合的信息對后面的全新藥物設(shè)計和分子對接等都有很好的指導(dǎo)意義。代表性的活性位點分析方法的軟件有GRID、MCSS和HINT等相關(guān)程序。 GRIDGRID程序由Goodford研究小組開發(fā)，其基本原理是將靶點蛋白的活性部位劃分為有規(guī)則的網(wǎng)格，應(yīng)用分子力

6、場的方法計算探針分子（水分子或甲基等）在不同的格點上與受體活性部位的相互作用能，以此解析探針分子與靶點活性部位的相互作用情況，發(fā)現(xiàn)最佳作用位點。應(yīng)用GRID程序研究流感病毒的重要靶點神經(jīng)氨酸酶時，以氨為探針分子搜尋神經(jīng)氨酸酶結(jié)合位點時發(fā)現(xiàn)用胍基取代抑制劑Neu5Ac2en的4-羥基，得到的化合物扎那米韋（zanamivir）活性大為提高，現(xiàn)已作為抗A型感冒病毒藥物上市。MCSSMCSS是Karplus課題組發(fā)展的一種活性位點分析方法，其基本思路與GRID方法相似，但處理方式更為細(xì)致、深入。例如GRID方法中僅考慮探針和蛋白質(zhì)的非鍵相互作用，而MCSS法進(jìn)一步包括了探子分子片段的構(gòu)象能；GRID

7、計算采用系統(tǒng)搜索法將探針分子片段依次放在每個格點上，而MCSS法將探針分子以多拷貝形式放置在活性口袋中，利用蒙特卡羅模擬結(jié)合分子力學(xué)進(jìn)行優(yōu)化來尋找最佳作用位點。Adlington等應(yīng)用MCSS對前列腺特異性免疫抗原（PSA）的活性位點進(jìn)行了詳細(xì)分析，以此對已有的PSA抑制劑進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，從而得到了迄今為止活性最高的PSA抑制劑，其IC50為（22610）nmol/L。HINTHINT（hydrophobic interaction）是Kellogg等研究的計算分子脂水分配系數(shù)及評價的程序，目前已商業(yè)化并已有SYBYL和Insight下的版本。在SYBYL最新版本中，HINT已作為一個正式模塊推

8、出，并能夠進(jìn)一步計算和顯示疏水場及兩分子間的疏水相互作用，并為CoMFA計算提供疏水場值。第二節(jié) 分子對接與虛擬篩選分子對接（molecular docking）是通過研究小分子配體與靶點生物大分子相互作用，預(yù)測其結(jié)合模式和親和力，進(jìn)而實現(xiàn)基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計的一種重要方法。根據(jù)配體與靶點作用的“鎖鑰原理”，分子對接可以有效地確定與靶受體活性部位空間和電性特征互補(bǔ)匹配的小分子化合物。 一、分子對接 分子對接方法的分類 根據(jù)對接過程中是否考慮研究體系的構(gòu)象變化，可將分子對接方法分為以下三類：剛性對接、半柔性對接和柔性對接。剛性對接是指研究體系的構(gòu)象在對接過程中不發(fā)生變化；半柔性對接是指在對接過程中

9、研究體系中的配體構(gòu)象允許在一定范圍內(nèi)變化；柔性對接是指研究體系在對接過程中構(gòu)象可以自由變化。根據(jù)對接時配體分子的形式還可以將分子對接方法分為兩種基本類型，即整體分子對接法和片段對接法。整體分子對接法是運用特定搜索算法考察配體分子在靶點結(jié)合部位，根據(jù)評分函數(shù)找出最優(yōu)結(jié)合方式。片段對接法是將配體分子視為若干片段結(jié)構(gòu)的集合，先將其中一個或幾個基本片段放入結(jié)合空腔，然后在活性部位構(gòu)建分子的其余部分，最終得到理論上最優(yōu)的結(jié)合方式。 1. DOCK（1）應(yīng)用程序產(chǎn)生一個填充靶點分子表面的口袋或凹槽的球集, 整理成假定結(jié)合位點。（2）在假定結(jié)合位點上，應(yīng)用一組球集表示配體，按照匹配原則確定配體與靶點的作用位

10、點。（3）評價打分，DOCK支持多種評分函數(shù)，可以評價靶點活性部位與配體幾何形狀互補(bǔ)性、范德華作用和靜電作用等。有代表性的分子對接軟件2. FlexX第一步是選擇配體的一個連接基團(tuán)，稱為核心基團(tuán)；第二步是將核心基團(tuán)放置于活性部位，此時不考慮配體的其他部分；最后一步稱為構(gòu)造，通過在已放置好的核心基團(tuán)上逐步增加其他基團(tuán)，構(gòu)造出完整的配體分子。3. Affinity第一步是應(yīng)用蒙特卡羅或模擬退火法計算確定配體分子在靶點活性口袋的可能結(jié)合位置；第二步是通過分子力學(xué)或分子動力學(xué)方法進(jìn)行細(xì)致對接。 DOCK分子對接步驟對配體和靶點結(jié)構(gòu)分別加氫原子、力場參數(shù)和電荷計算蛋白溶劑表面結(jié)合部位模擬計算結(jié)合部分能量

11、網(wǎng)格打分評價尋找最佳匹配位置分子對接應(yīng)用舉例 通過對HIV-1蛋白酶與天門冬氨酸蛋白酶的結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，并借助X-衍射波譜的結(jié)果，人們獲得了高精確度（1. 8nm）的HIV-1蛋白酶的三維結(jié)構(gòu)，并建立起該酶的結(jié)構(gòu)模型。隨后，Desjarlais等人根據(jù)其晶體結(jié)構(gòu)中的酶活性部位，利用DOCK程序?qū)蚓w數(shù)據(jù)庫中的10 000個分子與之進(jìn)行分子對接，按照打分?jǐn)?shù)值的高低排列。然后對打分值最高的200個化合物進(jìn)行嚴(yán)格篩選，評價這些分子能否與酶的Asp25發(fā)生相互作用。最后發(fā)現(xiàn)溴哌醇具有較好的結(jié)合作用，經(jīng)生物學(xué)實驗測試表明，其Ki值為100mol/L，且選擇性很高。溴哌醇高通量篩選的缺陷傳統(tǒng)的高通量篩選

12、遇到許多問題，一方面是藥理測試假陽性結(jié)果，另一方面是化合物樣品來源短缺。盡管已報道的化合物數(shù)量非常龐大，但實際制藥公司和有關(guān)研究機(jī)構(gòu)現(xiàn)有的樣品庫卻數(shù)量有限，這種情況在我國表現(xiàn)更為突出。 二、計算機(jī)虛擬篩選技術(shù) 利用現(xiàn)代計算機(jī)虛擬篩選技術(shù)可以有效克服上述困難，它利用計算機(jī)強(qiáng)大的運算能力，根據(jù)某個靶標(biāo)的相關(guān)信息，利用三維藥效團(tuán)搜索或分子對接的方法，對商業(yè)化的化合物樣品庫進(jìn)行虛擬篩選以尋找可能的活性化合物，發(fā)現(xiàn)潛在的活性分子后，可以向公司或有關(guān)機(jī)構(gòu)定購，然后進(jìn)行藥理測試。與傳統(tǒng)的高通量篩選技術(shù)相比，虛擬篩選不存在樣品的限制，其成本也遠(yuǎn)低于高通量篩選 。小分子三維數(shù)據(jù)庫劍橋結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（Cambridg

13、e structural database，CSD）是由劍橋大學(xué)的劍橋晶體數(shù)據(jù)中心（Cambridge crystallographic data centre）提供的有關(guān)有機(jī)小分子晶體結(jié)構(gòu)信息的三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)。在CSD中，所有這些晶體結(jié)構(gòu)都是通過X-射線或中子散射實驗技術(shù)獲得。目前，CSD包含超過25 700個有機(jī)化合物、金屬有機(jī)化合物以及金屬配合物的晶體結(jié)構(gòu)信息，其中約有89%的分子有明確的三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)。 劍橋結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫國家癌癥研究所數(shù)據(jù)庫 到2000年為止，國家癌癥研究所數(shù)據(jù)庫（national cancer institute database，NCI數(shù)據(jù)庫）共收集了約500 00

14、0個化合物。盡管很多學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)、政府部門及一些非營利組織提交測試的化合物沒有任何限制條件，但是企業(yè)研究所通常要求對它們提供的化合物結(jié)構(gòu)和測試結(jié)果遵守保密協(xié)議。NCI數(shù)據(jù)庫中近一半的保密化合物公眾無法獲得。NCI數(shù)據(jù)庫最大的特點是擁有與之相配套的對公眾開放的實物庫。一般情況下，在NCI數(shù)據(jù)庫中始終有約60%的化合物實物儲備。ACD-3D數(shù)據(jù)庫 ACD-3D數(shù)據(jù)庫是MDL數(shù)據(jù)庫的一種，是用戶檢索化學(xué)品供應(yīng)商和價格信息的一種有效途徑。目前，ACD-3D包含從世界范圍內(nèi)的651種化學(xué)品目錄中收錄的將近40萬個化合物的信息，其中約33萬個具有三維結(jié)構(gòu)，是目前世界上最大的可獲取的商業(yè)化學(xué)品結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫。數(shù)據(jù)庫

15、每半年更新一次。數(shù)據(jù)庫中的信息包含化學(xué)品的純度、類型、等級、劑量和可比價格等。2003年MDL公司為了迎合高通量篩選而開發(fā)了數(shù)據(jù)庫available chemicals directory 3D-screening（ACD-SC）。該庫的數(shù)據(jù)主要來自于42個商業(yè)化學(xué)品供應(yīng)商的產(chǎn)品目錄。這一數(shù)據(jù)庫提供了化學(xué)品供應(yīng)商所能夠提供的超過200萬個化合物的三維結(jié)構(gòu)及相關(guān)信息。ACD-SC可以說是ACD-3D的擴(kuò)展，而且所有的化合物都可以找到相關(guān)購買信息。MDL drug data report 3D（MDDR-3D） MDDR數(shù)據(jù)庫是MDL數(shù)據(jù)庫產(chǎn)品中的一種。它的數(shù)據(jù)來源包括1988年以來11個國際專利

16、部門的資料以及1500種期刊和300種會議論文中出現(xiàn)的約100 000種與生物研究相關(guān)的化合物及其衍生物。該數(shù)據(jù)庫每月更新一次，每年化合物增長規(guī)模在10 000種左右。數(shù)據(jù)庫中收錄信息的特點是包括生物活性和藥理性質(zhì)方面的數(shù)據(jù)。 虛擬篩選的策略 基于分子對接的虛擬篩選流程圖小分子數(shù)據(jù)庫準(zhǔn)備蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)準(zhǔn)備二維分子數(shù)據(jù)庫蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)原子鍵類歸屬三維結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)優(yōu)化原子化電荷歸屬結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化構(gòu)象產(chǎn)生數(shù)據(jù)歸屬結(jié)合位點確定網(wǎng)格構(gòu)造分子對接打分評價選分子類藥性判斷侯選分子虛擬篩選后續(xù)分析高通量篩選和虛擬篩選方法的比較 方法測試化合物數(shù)量IC50100mol/L命中數(shù)量IC5010mol/L命中數(shù)量命中率（%）高通

17、量篩選4 000 0008560. 021基于分子對接的虛擬篩選3651272134. 8Doman等以2型糖尿病的靶點蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B（PTP1B）抑制劑的發(fā)現(xiàn)為例，比較了高通量篩選和虛擬篩選方法。經(jīng)過虛擬篩選后再進(jìn)行生物學(xué)測試，其“命中率”比隨機(jī)的高通量篩選提高了1700倍。 舉例：雌激素受體調(diào)節(jié)劑英國Protherics分子設(shè)計公司發(fā)展了虛擬篩選方法Dock Crunch，以雌激素受體三維結(jié)構(gòu)為靶標(biāo)，篩選了含有100多萬個化合物的MDL/ACD-SC數(shù)據(jù)庫。根據(jù)虛擬篩選結(jié)果，購買了37個化合物。藥理測試顯示，結(jié)合常數(shù)Ki小于100nmol/L的化合物有14個，有兩個化合物活性在nm

18、ol/L級別。這些研究結(jié)果表明，與隨機(jī)篩選相比，虛擬篩選可以成百上千倍地提高篩選效率。因此，用虛擬篩選方法進(jìn)行創(chuàng)新藥物研究無論是在提高新藥研究與開發(fā)的效率，還是在獲得新結(jié)構(gòu)活性化合物的速度方面，均具有十分重要的意義。三、反向分子對接2001年反向分子對接（inverse docking）概 念的提出，無疑為藥物靶點發(fā)現(xiàn)掀起了一場新的革命。繼INVDOCK軟件后，TarFis-Dock、PharmMapper等免費在線服務(wù)器為人們所熟知并逐漸得到認(rèn)可。其方便快捷的預(yù)測功能為藥物靶點的發(fā)現(xiàn)提供了至關(guān)重要的作用，是藥物研究與開發(fā)中不可或缺的重要工具。反向分子對接是將一個生物學(xué)活性已知的化合物與給定蛋

19、白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中的所有結(jié)合位點的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行對接，對于能夠?qū)崿F(xiàn)對接的蛋白質(zhì)，再進(jìn)一步通過實驗方法來驗證其作為該活性已知化合物作用靶點的可能性。該技術(shù)能夠高效、大規(guī)模進(jìn)行靶點的確定和驗證，預(yù)測與毒性相關(guān)的靶點。 根據(jù)配體-靶點之間的匹配程度，反向分子對接可分為藥效團(tuán)模型法（pharmacophore）、配體相似法（ligand similarity）和結(jié)合位點相似法（site similarity）等。反向分子對接流程示意圖第三節(jié) 全新藥物設(shè)計 全新藥物設(shè)計也稱為從頭設(shè)計，它是根據(jù)靶點活性部位的形狀和性質(zhì)要求，通過計算機(jī)自動構(gòu)建出結(jié)構(gòu)與化學(xué)性質(zhì)互補(bǔ)的新配體分子。利用全新藥物設(shè)計的方法通常能夠在分子設(shè)

20、計中引入一些新的化學(xué)結(jié)構(gòu)，從而幫助研究者突破原有的思想束縛，提出全新的先導(dǎo)結(jié)構(gòu)；但一般所設(shè)計的化合物通常需要研究者通過化學(xué)合成得到，因此設(shè)計人員一般也應(yīng)具有很好的有機(jī)化學(xué)和藥物合成背景。全新藥物設(shè)計的分類根據(jù)基本構(gòu)建模塊的產(chǎn)生方法不同，全新藥物設(shè)計方法又進(jìn)一步可細(xì)分為模板定位法、原子生長法、分子碎片法等，其中分子碎片法目前應(yīng)用最為廣泛。模板定位法 模版定位法是指在靶點活性部位用模板構(gòu)建出一個形狀互補(bǔ)的圖形骨架，然后再根據(jù)其他性質(zhì)如靜電、疏水和氫鍵性質(zhì)，把圖形骨架轉(zhuǎn)化為一個個具體分子。 模板定位法設(shè)計配體示意圖 原子生長法 原子生長法是指在靶點活性部位根據(jù)靜電、疏水和氫鍵相互作用，逐個添加原子，

21、最終生長出與靶點活性部位性質(zhì)、形狀互補(bǔ)的分子。 原子生長法已發(fā)展成兩種類型，第一種是從種子原子開始生長原子，該種子原子為靶點活性部位易形成氫鍵的原子，一般以氧、氮等作用起始原子起點；第二種類型是從起始結(jié)構(gòu)開始生長原子，該起始結(jié)構(gòu)可以是已知的底物或底物的一部分，它預(yù)先對接在靶點活性部位上。分子碎片法 分子碎片法是指在靶點分子的活性部位，根據(jù)靜電、疏水和氫鍵相互作用，以碎片為模板，逐步生長出性質(zhì)與形狀互補(bǔ)的分子。這里指的碎片，是由單一官能團(tuán)，如羥基、羰基或苯環(huán)所構(gòu)成。分子碎片法又分為碎片連接法與碎片生長法兩種。分子碎片法進(jìn)行藥物設(shè)計的幾種連接方式：應(yīng)用舉例：FKBP-12配體的發(fā)現(xiàn) Agouroo

22、 Pharrnaoeutioals公司利用LUDI進(jìn)行了FKBP-12配體的設(shè)計工作，以FKBP-FKSO6復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)作為起點，把FKS06從復(fù)合物中刪除，采用LUDI程序來尋找和FRBP的活性位點能形成匹配的分子片段。從LUDI計算所給出的多種可能的分子片段中發(fā)現(xiàn)a能夠很好地填充部分活性口袋，并和受體形成好的幾何匹配和能量匹配。進(jìn)一步的研究表明，配體分子的亞甲基上引入酮基（化合物b）后能與Ile56的氨基形成氫鍵。在此基礎(chǔ)上，再一次利用LUDI對配體分子進(jìn)行生長。發(fā)現(xiàn)通過一個橋原子在化合物b的側(cè)鏈上連接芳香環(huán)有利于提高活性。經(jīng)反復(fù)比較，LUDI的計算結(jié)果顯示在芳香環(huán)的間位連上一個酚羥基

23、能夠和靶點Asp37形成靜電相互作用，有利于提高活性。研究人員合成了化合物c。生物活性測試結(jié)果表明，該化合物具有較好的活性，Ki16mol/L；而芳香環(huán)間位沒有酚羥基取代的化合物d的Ki值僅為116mol/L。 第四節(jié) 基于片段的藥物分子設(shè)計一、基于片段的分子設(shè)計原理與方法基于片段的藥物設(shè)計（fragment-based drug design，F(xiàn)BDD）是一種將隨機(jī)篩選和基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計有機(jī)結(jié)合的藥物發(fā)現(xiàn)新方法?；谄蔚乃幬镌O(shè)計方法首先篩選得到低分子量和低親和力的片段，然后基于藥靶結(jié)構(gòu)信息將片段進(jìn)行優(yōu)化或連接，得到與藥靶親和力高并且類藥性強(qiáng)的新分子。基于片段的藥物設(shè)計是為了克服傳統(tǒng)高通量

24、篩選的缺陷而逐步發(fā)展起來的藥物發(fā)現(xiàn)新方法。缺點：高通量篩選盲目性大，命中率很低，對于部分藥物靶點很難篩選得到理想的化合物，而且命中化合物的類藥性比較差。高通量得到的活性化合物的各個片段往往不能與靶蛋白的活性口袋很好地結(jié)合，而且對其中的單個片段的優(yōu)化往往會影響整個分子，甚至是與靶點結(jié)合位置的改變。高通量篩選和基于片段藥物設(shè)計比較一般來說，基于片段分子的設(shè)計研究可以分成三個階段：片段篩選、片段與藥靶復(fù)合物的結(jié)構(gòu)確證和基于片段構(gòu)建新分子。1. 片段庫的建立 一個高質(zhì)量的片段庫是進(jìn)行基于片段藥物設(shè)計的前提條件。構(gòu)建片段庫需要考慮三個因素：庫容量、化學(xué)結(jié)構(gòu)多樣性和類藥性。2. 結(jié)構(gòu)信息的確定 確定片段與

25、藥靶結(jié)合的結(jié)構(gòu)信息對指導(dǎo)片段轉(zhuǎn)化為先導(dǎo)化合物過程起到至關(guān)重要的作用。3. 基于片段構(gòu)建新分子 基于片段分子設(shè)計的最終目標(biāo)就是要發(fā)現(xiàn)高活性的先導(dǎo)化合物甚至是候選藥物，這就需要利用藥靶活性位點與片段相互作用的結(jié)構(gòu)信息，在片段基礎(chǔ)上進(jìn)一步設(shè)計新的分子，以提高生物活性。二、活性片段的檢測技術(shù)（一）磁共振技術(shù)利用NMR進(jìn)行藥物篩選的基本原理在于配體與生物大分子結(jié)合后，許多NMR參數(shù)（如化學(xué)位移等）會發(fā)生改變，通過檢測并分析這些數(shù)據(jù)，可以來判定配體是否與靶點結(jié)合、結(jié)合的強(qiáng)弱以及結(jié)合的模式。NMR篩選片段的方法一般可分為兩種：檢測配體的篩選（ligand detection based screening，

26、LDBS）和檢測靶點的篩選（target detection based screening，TDBS）。1. 檢測配體的篩選 LDBS法的原理是化合物在強(qiáng)磁場輻射下，核躍遷為激發(fā)態(tài)，然后緩慢回復(fù)到基態(tài)并釋放出相應(yīng)的能量，不同的核恢復(fù)到基態(tài)的時間不同，這個時間叫弛豫時間（relaxation time）。弛豫時間的長短與分子大小成反比，小分子的化合物弛豫時間長，大分子的靶蛋白弛豫時間短，當(dāng)藥物與靶蛋白結(jié)合后就變成大分子，弛豫時間就會變短。用LDBS法進(jìn)行化合物活性篩選時，首先用普通條件測定小分子化合物的NMR譜，然后向小分子化合物中加入靶蛋白，向磁共振儀引入一個適當(dāng)?shù)难訒r使靶蛋白分子不能被檢測

27、到，在這種條件下再檢測一次。如化合物未與靶蛋白結(jié)合，它的NMR譜仍可以被檢測到；如化合物與靶蛋白結(jié)合，就會成為蛋白的一部分，其核的弛豫時間就會縮短而無法檢測到它的NMR譜。根據(jù)加入靶蛋白前后NMR譜的差異可計算出化合物與靶蛋白的結(jié)合率。這種篩選方法不僅可篩選純化合物，而且還可篩選混合物，不管是天然提取的還是組合化學(xué)合成的多組分樣品都可不經(jīng)分離直接進(jìn)行測定。報告配體篩選方法（reporter ligand screening）可在一定程度上克服LDBS方法的缺陷。該方法的原理是在篩選樣品中加入一個已知能與藥靶某一區(qū)域具有弱結(jié)合的分子，稱為報告配體或探針。篩選樣品中的片段分子可競爭性地與報告配體結(jié)

28、合藥靶，親和力高于報告配體的片段分子被檢測出來。這種方法篩選得到片段與報告配體結(jié)合到藥靶相同的區(qū)域，避免檢測到與藥靶的非功能區(qū)域結(jié)合的片段，有效降低了假陽性，具有特異性高的特點。2. 檢測靶點的篩選TDBS法的原理是當(dāng)小分子與靶蛋白結(jié)合后，會改變蛋白質(zhì)結(jié)合位點的局部化學(xué)環(huán)境，通過15N標(biāo)記蛋白的二維N15和H1異核單量子相關(guān)譜（2D heteronuclear single quantum correlation spectra，HSQC），可以找出各酰胺信號15N或1H的化學(xué)位移變化。采用TDBS法的先決條件是必須知道靶蛋白的結(jié)構(gòu)，要求靶蛋白需進(jìn)行15N標(biāo)記，這樣才能保證靶蛋白NMR譜能準(zhǔn)確

29、識別每個酰胺結(jié)合位點的特征峰。TDBS法不僅可用于校正高通量篩選的假陽性結(jié)果，確保測試化合物結(jié)合在準(zhǔn)確的部位；還可指導(dǎo)新化合物的設(shè)計，即把相鄰的幾個結(jié)合于靶蛋白活性位點亞區(qū)域的低親和性配體片段，通過優(yōu)化組裝連接，就可設(shè)計得到所期望的高親和性配體。另外TDBS法還可用于功能未知的新靶蛋白的篩選。TDBS法的優(yōu)點是準(zhǔn)確度高、特異性強(qiáng)，可獲得靶蛋白結(jié)合位點的結(jié)構(gòu)信息。但是，TDBS法在技術(shù)上還有很大的局限性，目前它僅適用于分子量小于40 000的靶蛋白，靶蛋白要進(jìn)行N15標(biāo)記，而且要能制備200mg以上的量，因此其應(yīng)用受到一定限制。3. 磁共振構(gòu)效關(guān)系研究法 SAR-by-NMR法由Fesik小組提

30、出，是目前應(yīng)用最廣的NMR篩選方法。首先，通過二維15N-HSQC譜中15N或1H的化學(xué)位移的變化來檢測是否有小分子與靶蛋白結(jié)合。然后通過對作用于每個亞區(qū)域的片段進(jìn)行優(yōu)化和重新組裝便得到所期望的高親和性配體。Shuker等采用SAR-by-NMR法發(fā)現(xiàn)了親和力達(dá)nmol級的FK506蛋白抑制劑。SAR-by-NMR發(fā)現(xiàn)FK506蛋白抑制劑 （二）質(zhì)譜技術(shù)質(zhì)譜檢測技術(shù)分為非共價結(jié)合方法和共價結(jié)合方法。電噴霧電離質(zhì)譜是非共價結(jié)合檢測的代表方法，Tether技術(shù)是共價結(jié)合檢測的代表方法。1. 電噴霧電離質(zhì)譜方法 （1）電噴霧電離質(zhì)譜方法的原理非共價結(jié)合方法指活性片段和靶蛋白之間靠氫鍵、范德華力、疏水

31、作用等弱結(jié)合力形成片段-靶蛋白復(fù)合物，一般借助電噴霧電離質(zhì)譜（electrospray ionization mass spectrometry，ESI-MS）進(jìn)行分析和檢測。（2）電噴霧電離質(zhì)譜方法的應(yīng)用細(xì)菌23S rRNA的U1061A功能域是一個抗菌靶點，Criffey等采用SAR-by-MS成功發(fā)現(xiàn)了高親和力的配體。 SAR-by-MS方法發(fā)現(xiàn)細(xì)菌U1061A功能域配體2. Tether方法（1）Tether技術(shù)的原理Tether技術(shù)的原理是靶蛋白的半胱氨酸殘基巰基與連有二硫鍵側(cè)鏈的片段形成新的二硫鍵。Tether技術(shù)由Sunesis公司發(fā)明，它是借助質(zhì)譜識別片段來指導(dǎo)藥物設(shè)計。Tet

32、her技術(shù)不僅能檢測片段和靶蛋白是否結(jié)合，而且能夠檢測是否結(jié)合在特定的位點。一般來說，應(yīng)用Tether方法篩選的含有二硫鍵片段由三個部分組成：片段母體、連接基團(tuán)和離去基團(tuán)（一般為2-巰基乙胺）。Tether方法的原理此外，通過二次Tether技術(shù)檢測識別連接毗鄰位點的活性片段，然后將連接兩個片段的二硫鍵以合適的連接子替換，就能得到高活性的化合物。二次Tether方法的原理（2）Tether技術(shù)的優(yōu)點與缺點優(yōu)點：片段與藥靶之間形成了穩(wěn)定并且可逆的二硫鍵，通過熱力學(xué)平衡原理，用質(zhì)譜快速檢測得到與藥靶具有較好契合的片段，降低了假陽性率。片段與藥靶形成二硫鍵后有利于開展分子模擬研究或者測定復(fù)合物的晶體

33、結(jié)構(gòu)，從而精確定位片段在藥靶活性位點的位置，指導(dǎo)片段的優(yōu)化或者連接。缺點：需要用定點突變的技術(shù)在藥靶活性位點引入半胱氨酸殘基，增加了實驗難度。（3）Tether技術(shù)的應(yīng)用實例-淀粉樣前體蛋白裂解酶-1抑制劑的發(fā)現(xiàn)-淀粉樣前體蛋白裂解酶-1（-amyloid precursor protein cleavage enzyme，BACE-1）是治療老年癡呆癥的重要靶點。（4）二次Tether方法的原理及應(yīng)用二次Tether方法（tethering with extenders）的原理是用一個已知的活性片段對靶蛋白進(jìn)行共價修飾，然后將片段潛在的另一個巰基游離出來，用Tether方法去結(jié)合新的片段。在

34、起始階段對靶蛋白共價結(jié)合的活性片段可以是由Tether方法篩選得到，也可以是通過其他手段發(fā)現(xiàn)的，一般具有中度的親和力。然后，將片段脫保護(hù)，游離出巰基，再次用前述的Tether方法篩選含有二硫鍵的片段庫，通過形成新的二硫鍵來識別得到結(jié)合在藥靶毗鄰位點的第二個活性片段。最后，將連接兩個片段的二硫鍵以合適的連接子替換，就能得到了高活性的化合物。利用二次Tether方法發(fā)現(xiàn)高活性的半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）抑制劑。3. X-射線單晶衍射技術(shù)X-射線單晶衍射技術(shù)（X-ray crystallography）是研究分子結(jié)構(gòu)最有效和最精確的方法。早期的X-射線單晶衍射技術(shù)比較落后，測定蛋白質(zhì)晶

35、體結(jié)構(gòu)耗時久、精確度低，不利于大量分子的篩選。隨著X-衍射實驗技術(shù)、儀器自動化程度和計算機(jī)技術(shù)的高速發(fā)展，采用X-射線單晶衍射技術(shù)測定蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)-配體復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)正趨向成熟，目前已經(jīng)有60 000余個蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)被測定。通過共結(jié)晶（co-crystallization）和結(jié)晶浸潤（soaking）技術(shù)，靶蛋白可以快速識別并結(jié)合活性片段形成復(fù)合物，后者的三維結(jié)構(gòu)可通過高通量X-射線衍射技術(shù)快速測定，這種方法稱為結(jié)晶篩選（crystallographic screening）。這種方法不僅可以檢測片段是否有結(jié)合，而且還能精確地檢測出結(jié)合在靶蛋白的具體位置。結(jié)晶篩選是一種比較理想的基于片段

36、藥物設(shè)計方法，它能夠直接測定片段-靶蛋白復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)信息，這不僅大大降低了非特異性結(jié)合和假陽性發(fā)生的概率，而且對后繼的片段優(yōu)化和連接提供了直接的指導(dǎo)信息。結(jié)晶篩選的缺陷在于對技術(shù)和儀器要求很高，不僅需建立高通量蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)測試平臺，而且需要自動化程度較高的實驗機(jī)器人。（1）結(jié)晶篩選技術(shù)的原理用于結(jié)晶篩選的片段庫一般含有1000個左右分子。一般含有1000個分子的片段庫，通常可以發(fā)現(xiàn)1050個活性片段，然后從中選擇45個片段進(jìn)行優(yōu)化。片段選擇主要根據(jù)片段與靶蛋白的作用模式，并結(jié)合合成可行性。片段優(yōu)化一般通過構(gòu)建組合庫，采用組合化學(xué)的方法進(jìn)行平行合成。結(jié)晶篩選過程一般分為四個階段結(jié)晶篩選的研

37、究流程（2）結(jié)晶篩選技術(shù)的應(yīng)用脾臟酪氨酸激酶抑制劑的發(fā)現(xiàn) 結(jié)晶篩選技術(shù)發(fā)現(xiàn)新型脾臟酪氨酸激酶抑制劑三、從活性片段到先導(dǎo)化合物的研究方法上文介紹了各種活性片段檢測技術(shù)，但是從新藥發(fā)現(xiàn)角度而言，發(fā)現(xiàn)活性片段僅僅是研究的第一步，將活性片段轉(zhuǎn)化變?yōu)橄葘?dǎo)化合物甚至是候選藥物才是基于片段藥物設(shè)計研究的最終目的。從片段到先導(dǎo)化合物的設(shè)計方法主要分為以下三種：片段生長（fragment growth）法、片段連接（fragment linking）或片段融合（fragment fusion）法、片段自組裝（fragment self-assembly）法。（一）片段生長法片段生長又稱為片段演化（fragmen

38、t evolution）或片段加工（fragment elaboration），其基本原理如下圖所示。片段生長原理1. 過氧化物酶體增殖物激活受體激動劑過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator activated receptor，PPAR）是治療2型糖尿病的重要靶點，它有三種亞型：PPAR、PPAR和PPAR。Plexxikon公司的科研小組利用結(jié)晶篩選方法篩選小分子片段庫（分子量在150350之間），初步篩選得到170個活性片段。2. 周期素依賴性蛋白激酶2抑制劑周期素依賴性蛋白激酶2（cyclin-dependent kinase 2，CDK2）是細(xì)胞周

39、期的重要調(diào)控元件，也是癌癥治療的重要靶標(biāo)。3. 凝血因子a抑制劑凝血因子a（factor a）是治療凝血障礙的重要靶點。（二）片段連接與融合片段連接的原理如下圖所示，片段a和b分別作用于靶蛋白的不同活性口袋，且兩個活性口袋毗鄰，將兩個片段用合適的連接基團(tuán)連接起來得到親和力增強(qiáng)的新分子。片段連接和融合原理1. Bcl-XL抑制劑 腫瘤的發(fā)生與Bcl-2和Bcl-XL的過表達(dá)相關(guān)。因此，研制Bcl-XL的高效抑制劑對癌癥的治療有重要的意義。2. 基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑 基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）是抗腫瘤藥物的作用靶點。3. 尿激酶（urokinase）抑制劑的抗腫瘤作用靶點（三）片段自組裝片段自組裝可以看作是一種自動的片段連接方法，如下圖所示，在片段篩選過程中，分別結(jié)合在活性位點中相毗鄰的結(jié)合口袋的兩個活性片段a和b含有可相互反應(yīng)的基團(tuán)，這兩個片段可自發(fā)地反應(yīng)連接成為高活性的化合物。片段自組裝原理片段的自組裝一般通過兩種新術(shù)實現(xiàn)：點擊反應(yīng)（click reaction）和動態(tài)組合化學(xué)（dynamic combinatorial ch