流式細(xì)胞術(shù)（flowcytometerFCM）在出血與血栓性疾病中的應(yīng)用

1、流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometer，F(xiàn)CM）在出血與血栓性疾病中的應(yīng)用 FCM在出血與血栓性疾病中的應(yīng)用 集激光、電子物理、光電測量、計(jì)算機(jī)、細(xì)胞熒光化學(xué)及單克隆抗體為一體的新技術(shù)。 對處在快速直線流動狀態(tài)中的細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行快速、靈敏、多參數(shù)定量分析和分選技術(shù)。 開創(chuàng)了對單個(gè)BPC或亞群分析的新途徑。 FCM分析BPC的主要項(xiàng)目血小板計(jì)數(shù)：CD41、CD61射門網(wǎng)織血小板（RNA噻唑橙黃染料）：含RNA的BPC自身抗體:特異性血小板抗體、PAIg、同種抗體免疫表型分析：膜糖蛋白表達(dá): GPIb/IX/V復(fù)合物(CD42a、CD42b、CD42c、CD42d) GPIIb/IIIa復(fù)合

2、物（CD41、CD61）FV、IIIaBPC活化：膜糖蛋白表達(dá)（P-選擇素，CD62p） BPC內(nèi)物質(zhì)，微粒對不同刺激劑的反應(yīng)性：胞質(zhì)鈣流 FCM在出血性疾病中的應(yīng)用1、血小板減少：血小板數(shù)量、網(wǎng)織血小板 2、血小板功能缺陷 血小板無力癥： GPIIb-IIIa（CD41- CD61） 巨大血小板綜合征： GPIb-IX（CD42b-D42a3、血小板抗體： 血小板相關(guān)免疫球蛋白（PAIg） 血小板糖蛋白特異性自身抗體（GP）4 、血小板采集、儲存與輸注的監(jiān)測.出血性疾病的分類 血管壁功能異常 遺傳性（毛細(xì)血管擴(kuò)張癥、家族單純性） 獲得性（過敏性紫癜、血管炎、免疫性） 數(shù)量 遺傳性、 獲得性

3、Aa 、巨核、免疫性、 ITP、DIC 血小板異常 數(shù)量 （ET，CML） 功能異常（GT、BS、顆粒性） 凝血功能障礙 遺傳性（血友病、 VWD、其他凝血因子缺乏） 獲得性（VK缺乏，肝臟病，DIC、藥物） 循環(huán)中病理性抗凝物質(zhì) 凝血因子抑制物 肝素樣抗凝物質(zhì)；狼瘡樣抗凝物 纖維蛋白（原）溶解亢進(jìn) 遺傳（t-PA/u-PA抗纖溶酶） 獲得（DIC，血栓癥） 血小板計(jì)數(shù)BPC直徑1-4m，與RBC，WBC或碎片、免疫復(fù)合物大小相等，影響計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性。 FCM優(yōu)點(diǎn)： 利用各種BPC特異性單克隆抗體直接標(biāo)記熒光素分子 快速、準(zhǔn)確，排除非BPC顆粒干擾，誤差5% ， 尤其適合BPC20X109/L 重

4、復(fù)性好 缺點(diǎn)：技術(shù)條件要求高，費(fèi)用高。 FCM分析血小板原理 利用熒光素標(biāo)記的BPC特異性單抗或與待測成分特異性結(jié)合且能發(fā)熒光的物質(zhì) + 分離BPC或全血去除未反應(yīng)的單抗或熒光物質(zhì); 特異檢測5000-10000 BPC光散射與熒光信號（單色或多色）;獲取, 統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù), 分析,根據(jù)光散射與熒光強(qiáng)弱計(jì)算陽性BPC百分比或所測成分的含量（GP/BPC). FCM分析血小板方法 抗凝血2ul 調(diào)節(jié)BPC 105-106/ml 2-80C 預(yù)冷的1% 多聚甲醛1ml固定，2h BPC特異單抗+熒光劑(異硫氰酸熒光素)(CD42b FITC) +SSC+FSC設(shè)門-特異性選擇BPC. 檢測10000-1

5、00000 BPC表面熒光信號.FCM獲取，分析數(shù)據(jù) 結(jié)果表示: 平均顆粒熒光強(qiáng)度-活化時(shí)GP:Ag量 特異性熒光抗體結(jié)合陽性BPC% -x. 血小板光散射圖 FCM分析血小板的客觀評價(jià)利用各種BPC特異性單克隆抗體直接標(biāo)記熒光素分子優(yōu)點(diǎn)：1、接近生理?xiàng)l件直接測定血小板:2、微量（2ul)3、快速、準(zhǔn)確，排除非BPC顆粒干擾，誤差ELISA (單個(gè)BPC上PAIg) MAIPA（單抗特異性捕獲血小板抗體試驗(yàn)） PAICA（ BPC相關(guān)IgG特異性試驗(yàn)）特異性 MAIPA PAICA 血小板抗體免疫流式檢測法（PAICA) FCM檢測PAIg在診斷ITP中的評價(jià)1、用于嚴(yán)重BPC減少者PAIgG

6、檢測；2、特異性 2倍ITP+出血，提示PMP有止血功能。 PMPS：TTP、TIA、AMI、DM、APL、CPB (心肺旁路術(shù))、ACS. PMPS：罕見、Scott綜合征、PMP形成障礙。 PMP檢測的臨床意義1、肝素引起的血小板減少癥（HIT）/HIT血栓 抗肝素抗體+PF4復(fù)合物+BPC FcrIIa BPC激活PMP血栓2、急性冠狀綜合征：活化BPC PMP 。3、糖尿?。?PMP； DM+腎病PMP ，提示：檢測DM并發(fā)癥。4、PNH+血栓：補(bǔ)體損傷CD55/59 的BPC對凝血酶激活敏感 BPC活化 PMP FCM在血栓性疾病應(yīng)用總結(jié)1、血栓前（高凝）狀態(tài)：BPC“活化”是參與血栓的前提，BPC活化指標(biāo)： TXB2、GP（IIb/IIIa、Ib、V）、-TG、PF4、 GMP-140；2、冠心?。篜-sel；CD41/CD61；sGC均 不穩(wěn)定心絞痛： P-sel，GPV AMI：P-sel，GPV ； 溶栓再通：1