2012CB944900 輔助生殖誘發(fā)胚胎源性疾病的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和機(jī)制研究匯編_第1頁(yè)
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1、項(xiàng)目名稱(chēng):輔助生殖誘發(fā)胚胎源性疾病的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和機(jī)制研究首席科學(xué)家:黃荷鳳浙江大學(xué)起止年限:2012.1至2016.8依托部門(mén):教育部浙江省科技廳一、關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題及研究?jī)?nèi)容(一)關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題面對(duì)嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的重大疾病發(fā)生率高、發(fā)病機(jī)制不清、源頭防治困難的挑戰(zhàn),以及輔助生殖出生子代已成為新人口重要組成部分、遠(yuǎn)期風(fēng)險(xiǎn)亟待評(píng)估的現(xiàn)狀,結(jié)合慢性成年期疾病胚胎起源的新學(xué)說(shuō),依據(jù)小鼠實(shí)驗(yàn)已證實(shí)ART可引起子代高血壓和糖代謝異常,以及ART子代低出生體重和出生缺陷顯著增高的事實(shí),本項(xiàng)目擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題為:人類(lèi)輔助生殖技術(shù)及父/母源性生殖障礙是否干擾配子發(fā)生/胚胎早期發(fā)育而增加子代胚胎源性疾病風(fēng)險(xiǎn)?相關(guān)

2、發(fā)病機(jī)制如何?1、輔助生殖技術(shù)及父/母源性生殖障礙是否干擾配子發(fā)生/胚胎早期發(fā)育?其關(guān)鍵因素、作用時(shí)間窗、作用途徑如何?2、干擾配子發(fā)生/胚胎早期發(fā)育是否增加子代糖尿病、心血管疾病等胚胎源性疾病風(fēng)險(xiǎn)及生育力低下的易感性?相應(yīng)機(jī)制如何?是否存在傳代效應(yīng)?3、胚胎源性疾病是否有相應(yīng)生物預(yù)警標(biāo)記物?消減孕前不良暴露或?qū)嵤┏錾蟾深A(yù)可否降低胚胎源性疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)?(二)研究?jī)?nèi)容:胚胎源性疾病發(fā)病機(jī)制不清,輔助生殖技術(shù)本身的非生理性操作、生殖障礙疾病的不良環(huán)境暴露及這些因素間的相互作用干擾配子發(fā)生和早期胚胎發(fā)育,為研究人類(lèi)成年期疾病的胚胎起源提供了突破口。本項(xiàng)目圍繞關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題,主要研究?jī)?nèi)容為:1、對(duì)人

3、類(lèi)ART子代進(jìn)行健康追蹤研究,評(píng)估ART技術(shù)本身及PCOS和子宮內(nèi)膜異位癥不良生殖內(nèi)環(huán)境增加子代糖尿病、心血管病的風(fēng)險(xiǎn),以及嚴(yán)重少弱畸精癥子代生育力低下的風(fēng)險(xiǎn);結(jié)合動(dòng)物/體外模型研究,鑒別可能誘發(fā)子代胚胎源性疾病的高風(fēng)險(xiǎn)ART技術(shù)(如卵巢刺激、胚胎培養(yǎng)、胚胎凍存)、關(guān)鍵因素(父/母源性不良生殖背景、卵巢局部微環(huán)境、宮內(nèi)環(huán)境等)、作用時(shí)間窗(配子發(fā)生、早期胚胎發(fā)育階段)及傳代效應(yīng),分析不同ART技術(shù)方案誘發(fā)胚胎源性疾病的風(fēng)險(xiǎn)程度。2、利用人類(lèi)ART臨床資源、動(dòng)物模型和體外模型,獲取配子、植入前胚胎、以及動(dòng)物宮內(nèi)至出生后子代各個(gè)時(shí)期靶器官組織標(biāo)本,應(yīng)用基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、表觀遺傳組學(xué)等高通量分子技

4、術(shù)聯(lián)合生物信息分析,研究不同ART方案所致發(fā)育階段特異和組織器官特異的基因/蛋白/表觀遺傳改變,篩選出與子代胚胎源性疾病發(fā)生相關(guān)的重要候選基因、相應(yīng)表觀遺傳改變及生物預(yù)警標(biāo)記物。3、利用ART哺乳類(lèi)動(dòng)物模型和胚胎干細(xì)胞體外分化模型,研究ART致早期胚胎表觀遺傳修飾改變的特性,分析其對(duì)子代的近遠(yuǎn)期影響及與成年期發(fā)病之間的關(guān)系,探索優(yōu)化的ART技術(shù)體系;利用PCOS動(dòng)物模型、條件性基因敲除小鼠模型、轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)模式動(dòng)物,研究干擾配子發(fā)生/胚胎早期發(fā)育誘發(fā)胚胎源性疾病的主要作用途徑、關(guān)鍵信號(hào)通路、表觀遺傳機(jī)制及其他分子機(jī)制,探索消減胚胎源性疾病風(fēng)險(xiǎn)的靶點(diǎn)。二、預(yù)期目標(biāo)(一)總體目標(biāo)瞄準(zhǔn)國(guó)家戰(zhàn)略需求和

5、生殖與發(fā)育研究前沿,圍繞配子發(fā)生和早期胚胎發(fā)育階段的干擾是否誘發(fā)胚胎源性疾病的核心科學(xué)問(wèn)題,以ART和生殖障礙疾病作為主要干擾因素,研究胚胎源性疾病的發(fā)生機(jī)制、病理生理過(guò)程和防控策略。運(yùn)用基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、表觀遺傳組學(xué)和生物信息學(xué)等現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù),系統(tǒng)評(píng)估輔助生殖主流技術(shù)、生殖相關(guān)疾病不良遺傳背景和不良生殖內(nèi)環(huán)境對(duì)配子發(fā)生、早期胚胎發(fā)育干擾所致胚胎源性疾病的風(fēng)險(xiǎn)因素,探明關(guān)鍵窗口期,主要表觀遺傳異常的分子事件和傳代效應(yīng);以糖尿病、心血管疾病等作為候選胚胎源性疾病,通過(guò)探索其發(fā)病過(guò)程中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、表觀遺傳機(jī)制及其他分子機(jī)制,發(fā)現(xiàn)有效的預(yù)警分子標(biāo)記物和易感人群,為源頭防控胚胎源性疾病、減少

6、出生缺陷、優(yōu)化ART提供科學(xué)依據(jù)。通過(guò)本課題的實(shí)施,使發(fā)育源性疾?。ㄈ缣悄虿『托难懿〉热祟?lèi)重大疾?。┰谂渥?胚胎層面有發(fā)病機(jī)制上的理論突破,使ART的遠(yuǎn)期安全性評(píng)估有科學(xué)依據(jù),獲得一批有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的成果,同時(shí)以本項(xiàng)目的實(shí)施為契機(jī),促進(jìn)生殖醫(yī)學(xué)、生殖生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、表觀遺傳學(xué)和代謝病研究的銜接和交叉集成,培養(yǎng)一批臨床應(yīng)用基礎(chǔ)研究與基礎(chǔ)研究相結(jié)合的復(fù)合型人才,使我國(guó)的生殖健康研究領(lǐng)域躋身國(guó)際領(lǐng)先行列。(二)五年預(yù)期目標(biāo)1、通過(guò)ART出生子代健康追蹤研究,篩選發(fā)生低體重、糖/代謝異常和表觀遺傳修飾異常的主要ART干擾因素,明晰輔助生殖技術(shù)本身或合并父/母源性生殖障礙誘發(fā)糖尿病、心血管疾病等胚

7、胎源性疾病的風(fēng)險(xiǎn)度,識(shí)別增加疾病易感性的生殖障礙疾病因素。2、結(jié)合臨床資源、動(dòng)物模型、體外模型和模式動(dòng)物研究,識(shí)別配子發(fā)生/早期胚胎階段至成年期疾病相關(guān)基因/蛋白和表觀遺傳差異,明確引起異常的主要高危ART技術(shù)、關(guān)鍵因素和作用時(shí)間窗,闡明ART相關(guān)干擾對(duì)子代的近遠(yuǎn)期影響以及傳代效應(yīng),3、明確相關(guān)候選基因/蛋白和相應(yīng)表觀遺傳改變與成年期發(fā)生胚胎源性疾病的關(guān)聯(lián)性,確定ART相關(guān)干擾誘發(fā)胚胎源性疾病及生育力低下的主要致病窗口期、主要表觀遺傳異常的分子機(jī)制,建立規(guī)避風(fēng)險(xiǎn)的ART技術(shù)措施和適應(yīng)癥規(guī)范。4、闡明ART相關(guān)干擾所致相關(guān)異常引發(fā)糖尿病、心血管病等胚胎源性疾病的主要作用途徑、具體信號(hào)通路和表觀遺

8、傳修飾機(jī)制,鑒定數(shù)個(gè)疾病相關(guān)的關(guān)鍵基因/蛋白和表觀遺傳異常的分子事件,篩選可進(jìn)行有效疾病預(yù)警的分子標(biāo)記。5、利用疾病預(yù)警分子標(biāo)記,檢出易感人群,建立消減胚胎源性疾病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的出生后飲食/生活方式。6、培養(yǎng)一批生殖與發(fā)育領(lǐng)域具國(guó)際視野的優(yōu)秀人才,取得具有國(guó)際影響的原創(chuàng)性成果;在國(guó)際重要學(xué)術(shù)刊物上發(fā)表SCI論文50篇以上,爭(zhēng)取多篇高影響因子的論文發(fā)表,取得若干項(xiàng)國(guó)際或國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利。建立國(guó)內(nèi)一流、國(guó)際領(lǐng)先的生殖安全研究基地和轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)基地,使我國(guó)的生殖健康研究領(lǐng)域躋身國(guó)際前列。三、研究方案(一)總體研究思路成年期重大疾病的生命早期起源學(xué)說(shuō)自提出之日起就受到了廣大臨床和基礎(chǔ)研究科學(xué)家的高度關(guān)注。然而,由

9、于倫理和技術(shù)限制,對(duì)人類(lèi)發(fā)育源性疾病的在體直接研究非常困難,以往只能借助于流行病學(xué)調(diào)查和動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn),主要研究宮內(nèi)不良環(huán)境所致胎兒源性成人疾病的可能機(jī)制。但更值得關(guān)注的是,疾病的早期起源可以追溯至胚胎甚至配子發(fā)育時(shí)期,因此,闡明干擾配子發(fā)生/胚胎早期發(fā)育引起胚胎源性成人性疾病的發(fā)生機(jī)制,對(duì)于疾病診治前移、源頭防控具有更加重大的意義。隨著輔助生殖技術(shù)的高速發(fā)展,人類(lèi)配子和胚胎在實(shí)驗(yàn)室的可操作性使得在體外模擬人體內(nèi)配子發(fā)生/胚胎發(fā)育的內(nèi)源性(如遺傳、表觀遺傳)和外源性(內(nèi)外環(huán)境)因素成為可能;此外,全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)、MeDIP-chip、Chip-chip、microRNA等新技術(shù)的應(yīng)

10、用極大推動(dòng)了基因組學(xué)包括遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)研究的進(jìn)展。本項(xiàng)目在全世界率先提出和建立以臨床輔助生殖為技術(shù)平臺(tái),以基因組學(xué)包括遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)研究最新技術(shù)在內(nèi)的相關(guān)方法學(xué)為研究手段,以人配子和胚胎為主要研究對(duì)象,以輔助生殖出生子代為成人性疾病發(fā)生結(jié)局的載體,將發(fā)病率高、危害重大的慢性成人性疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制研究的關(guān)注點(diǎn)前移至配子發(fā)生/胚胎早期發(fā)育階段,具有致病機(jī)制研究思路創(chuàng)新性和疾病防治策略的前瞻性。因此,本項(xiàng)目設(shè)計(jì)ART及相關(guān)的生殖障礙疾病干擾配子發(fā)生和胚胎發(fā)育誘發(fā)胚胎源性疾病的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和機(jī)制研究,是生殖與發(fā)育領(lǐng)域前沿的嶄新研究課題。不僅能回答人類(lèi)發(fā)育源性糖尿病、心血管病等發(fā)病機(jī)制方面的重大科學(xué)

11、問(wèn)題,同時(shí)對(duì)促進(jìn)人類(lèi)現(xiàn)代生殖科技的進(jìn)步有重大科學(xué)意義。根據(jù)總體學(xué)術(shù)思路,本項(xiàng)目研究的技術(shù)線路如圖所示。具體而言,本項(xiàng)目將通過(guò)人類(lèi)輔助生殖子代健康追蹤,利用模式動(dòng)物、動(dòng)物模型,與自然妊娠子代比較,研究促超排卵藥物、體外培養(yǎng)和配子胚胎凍融等ART主流技術(shù)出生子代,以及PCOS、子宮內(nèi)膜異位癥、嚴(yán)重少弱精癥等父/母源性生殖障礙患者ART子代的生長(zhǎng)發(fā)育、糖/脂代謝、心血管結(jié)構(gòu)功能、性成熟等表型特征;探索不同ART技術(shù)誘發(fā)上述疾病的風(fēng)險(xiǎn)程度,以及父/母源性生殖障礙疾病背景是否增加疾病的易感性;分析人類(lèi)ART子代與糖尿病、心血管疾病相關(guān)的基因/蛋白表達(dá)調(diào)控的差異。同時(shí)利用動(dòng)物模型和體外模型研究平臺(tái),通過(guò)基

12、因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、表觀遺傳組學(xué)等高通量和生物信息學(xué)分析方法,分析配子發(fā)生/早期胚胎階段的表觀遺傳異常、子代DNA突變、不同發(fā)育階段重要靶器官組織相關(guān)基因/蛋白表達(dá)、重要候選基因調(diào)控區(qū)DNA甲基化、染色質(zhì)組蛋白甲基化/乙?;约靶NA修飾等表觀遺傳修飾異常,探明ART相關(guān)干擾誘發(fā)胚胎源性疾病的關(guān)鍵時(shí)間節(jié)點(diǎn)、致病窗口期、主要風(fēng)險(xiǎn)因素、主要表觀遺傳修飾異常的分子事件,明確相關(guān)干擾對(duì)子代的近遠(yuǎn)期影響以及傳代效應(yīng)。在上述研究工作基礎(chǔ)上,利用模式動(dòng)物、胚胎干細(xì)胞體外分化模型,剖析輔助生殖相關(guān)干擾誘發(fā)糖尿病、心血管病和低生育力的主要候選基因/蛋白和信號(hào)通路,重點(diǎn)研究糖尿病相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子pdx-1、葡萄糖轉(zhuǎn)

13、運(yùn)基因glu-4、信號(hào)通路分子PI3K/PKC/IRS-1,心血管疾病相關(guān)eNOS/NO、PGI2、Endothelin、TXA2以及精子組蛋白泛素化去泛素化(UPP)系統(tǒng)在胚胎源性疾病發(fā)生發(fā)展中的作用,深入闡明輔助生殖干擾配子發(fā)生、早期胚胎發(fā)育所致相關(guān)異常引發(fā)上述胚源性疾病的具體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、重要候選基因表觀遺傳修飾機(jī)制及其他分子機(jī)制,發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的預(yù)警生物分子標(biāo)記物。利用預(yù)警生物標(biāo)記,檢出易感人群,探尋優(yōu)化ART和消減胚胎源性疾病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的技術(shù)措施/營(yíng)養(yǎng)方式,實(shí)現(xiàn)胚胎源性疾病的防治前移。嚴(yán)格遺應(yīng)癥,提商輔助生殖技術(shù)安全性胚胎源性疾病鳳險(xiǎn)評(píng)估技術(shù)疾病子代追蹤研究f異常表塑Z動(dòng)物/體外模型糖尿病、

14、心血管病生育力低下配子發(fā)生/早期胚胎炭育候選基因/高通量分子披術(shù)f蛋韻表觀f遺傳改變分子機(jī)制f胚胎源性疾病發(fā)生機(jī)制生物預(yù)警標(biāo)記胚胎源性疾病的防治前移項(xiàng)目的可行性分析1、項(xiàng)目實(shí)施有堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù):“胎兒源性成人疾病”理論已獲公認(rèn),但與胎兒發(fā)育相比,配子的發(fā)生和成熟受潛在危害的作用時(shí)間更長(zhǎng);受精及胚胎期(受精6周內(nèi))處于表觀遺傳重編程和細(xì)胞快速分化及器官形成期,是環(huán)境干擾致病的最敏感階段。本項(xiàng)目將成人期疾病的發(fā)生關(guān)注點(diǎn)進(jìn)一步前移至配子發(fā)生和胚胎發(fā)育期,具有取得重大理論突破和研究進(jìn)展的可行性。2、具有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依據(jù):小鼠ART模型已證實(shí)ART可引起成年后小鼠高血壓和糖代謝異常,為本項(xiàng)目人類(lèi)ART誘發(fā)胚

15、胎源性疾病研究提供了最直接的支持。3、前期研究基礎(chǔ)扎實(shí):本項(xiàng)目組前期研究已證實(shí)ART子代表觀遺傳修飾異常增加及出現(xiàn)新發(fā)基因突變,而表觀遺傳修飾異常是代謝性疾病的主要發(fā)病機(jī)制之一。因此,在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步進(jìn)行胚胎源性疾病發(fā)生機(jī)制研究有望取得突破性成果。4、ART子代低出生體重為胚胎源性疾病發(fā)生提供切入點(diǎn):已證實(shí)低出生體重是胎兒源性心血管疾病和糖尿病等的獨(dú)立高風(fēng)險(xiǎn)因素。而ART子代低出生體重發(fā)生率顯著增高,因此以低出生體重為切入點(diǎn)研究ART誘發(fā)的胚胎源性疾病發(fā)生機(jī)制研究,極有可能獲得胚胎源性疾病發(fā)病機(jī)制研究的重大突破。5、研究團(tuán)隊(duì)實(shí)力雄厚:項(xiàng)目組匯集了生殖、發(fā)育、代謝性疾病與生物信息學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域的優(yōu)

16、勢(shì)力量,多學(xué)科交叉、優(yōu)勢(shì)互補(bǔ),已建立了長(zhǎng)期合作的協(xié)作關(guān)系;臨床資源豐富、研究平臺(tái)完善,為項(xiàng)目的順利完成提供了可靠的保障。(二)創(chuàng)新點(diǎn)1、本項(xiàng)目瞄準(zhǔn)生命科學(xué)國(guó)際前沿和生殖與發(fā)育學(xué)科的新興領(lǐng)域,從配子發(fā)生和胚胎早期發(fā)育層面探索胚胎源性成人疾病的發(fā)病機(jī)制,將宮內(nèi)“胎兒源性成人疾病”的研究前移到配子和胚胎發(fā)育早期的“胚胎源性成人疾病”,具有學(xué)術(shù)思想的創(chuàng)新性。2、利用人類(lèi)ART的技術(shù)特征和父/母源性生殖障礙疾病致生殖細(xì)胞特異不良內(nèi)環(huán)境暴露作為胚胎源性成人疾病的獨(dú)特研究模型,以表觀遺傳/基因/蛋白組學(xué)為新視角,結(jié)合模式動(dòng)物、體外模型研究,甄別ART誘發(fā)胚胎源性疾病的高危技術(shù)風(fēng)險(xiǎn)和致病易感性、并闡明其傳代效

17、應(yīng),具有研究對(duì)象和技術(shù)途徑的新穎性。3、以發(fā)病率高、危害重大的糖尿病和心血管疾病以及影響人類(lèi)繁衍的生育力異常作為主要候選疾病,通過(guò)鑒定ART誘發(fā)胚胎源性疾病的關(guān)鍵候選蛋白/基因,發(fā)現(xiàn)有效預(yù)警胚胎源性疾病的生物標(biāo)記,探索可行的早期防治策略,為重大疾病防控前移戰(zhàn)略提供新的科學(xué)依據(jù)。(三)課題設(shè)置以及課題間的相互關(guān)系圍繞配子發(fā)生和胚胎發(fā)育階段的ART環(huán)境暴露是否以及如何誘發(fā)胚胎源性疾病的發(fā)生這個(gè)關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題,本項(xiàng)目設(shè)置了三個(gè)課題:課題1:輔助生殖致胚胎源性疾病的技術(shù)風(fēng)險(xiǎn)因素研究主要研究?jī)?nèi)容:1、人類(lèi)ART子代健康追蹤研究以自然妊娠子代為對(duì)照,追蹤超促排卵、胚胎體外培養(yǎng)和胚胎冷凍復(fù)蘇等人類(lèi)輔助生殖主流

18、技術(shù)出生子代,特別是低出生體重(lowbirthweight,LBW)及小于胎齡兒(smallforgestationalage,SGA)的子代,測(cè)定空腹和餐后血糖、胰島素水平、糖耐量試驗(yàn)和胰島素抵抗指數(shù)等糖代謝指標(biāo),評(píng)估罹患糖尿病的風(fēng)險(xiǎn);通過(guò)血壓、主動(dòng)脈及頸動(dòng)脈厚度、內(nèi)膜中層厚度、彈性以及心臟幾何結(jié)構(gòu)和舒張功能等心血管結(jié)構(gòu)與功能指標(biāo),以及血管活性物質(zhì)NO、PGI2、TXA2、Endothelin等血管內(nèi)皮舒縮功能指標(biāo),評(píng)估罹患心血管病風(fēng)險(xiǎn);檢查青春期第二性征、性激素水平等性發(fā)育表型指標(biāo),以及檢測(cè)與配子發(fā)生、成熟和生育力密切相關(guān)的基因(AZF、GDF-9等)突變與表觀遺傳修飾的變化,評(píng)估子代生

19、育力是否受到明顯影響。2、人類(lèi)ART子代胚胎源性疾病相關(guān)基因/蛋白研究獲取ART子代的胎盤(pán)、臍血外周血等臨床資源,將低出生體重ART子代與正常體重ART子代、自然妊娠子代作為同期對(duì)照,進(jìn)一步對(duì)不同促排卵方案、胚胎體外培養(yǎng)環(huán)境、胚胎凍融方式及凍存時(shí)間出生子代進(jìn)行比較,采用基因芯片和蛋白組學(xué)篩選差異表達(dá)基因/蛋白,結(jié)合生物信息學(xué)分析篩選出與糖尿病、心血管疾病和生育力低下等疾病相關(guān)的重要候選基因以及生物預(yù)警標(biāo)記。利用甲基化免疫共沉淀測(cè)序(MeDIP-seq)技術(shù),檢測(cè)全基因組DNA或特定位點(diǎn)的甲基化控制區(qū);利用組蛋白乙?;庖吖渤恋頊y(cè)序(ChlP-seq)技術(shù)檢測(cè)組蛋白修飾(乙?;?甲基化)位點(diǎn)或控

20、制區(qū)域,比較表觀遺傳修飾(DNA甲基化、組蛋白修飾、基因印記)差異,研究ART子代發(fā)生表觀遺傳修飾改變的規(guī)律性,結(jié)合生物信息學(xué)方法,篩選相應(yīng)調(diào)控的基因(包括印記基因及非印記基因),進(jìn)一步驗(yàn)證表觀遺傳修飾改變對(duì)基因表達(dá)的影響。3、ART動(dòng)物模型和體外模型研究建立不同ART技術(shù)的動(dòng)物模型和體外模型,對(duì)超促排卵、胚胎體外培養(yǎng)、胚胎凍融分別進(jìn)行單因素研究,評(píng)估不同ART技術(shù)出生子代體重、生長(zhǎng)發(fā)育、糖脂代謝指標(biāo)、血壓、生育力等,明確罹患糖尿病、心血管疾病和生育力低下等疾病風(fēng)險(xiǎn)。將不同ART方式出生子代與正常妊娠子代相互交配,出生子二代,評(píng)估ART子二代生長(zhǎng)發(fā)育及代謝等相關(guān)指標(biāo),明確ART所致胚胎源性疾病

21、的傳代風(fēng)險(xiǎn)及親源性遺傳特征。獲取ART動(dòng)物不同發(fā)育階段配子、胚胎,結(jié)合體外培養(yǎng)模型,研究促排卵影響卵子發(fā)生過(guò)程表觀遺傳重編程、尤其是基因印記重建時(shí)序性的關(guān)鍵時(shí)間窗,探索胚胎培養(yǎng)、凍存等影響植入前胚胎去甲基化和新發(fā)甲基化等表觀遺傳修飾的關(guān)鍵因素;獲取ART模型不同胎齡的胚胎組織,分析亞穩(wěn)態(tài)表等位基因(metastableepialleles)表達(dá),確定子代受影響的時(shí)間窗;采用高通量技術(shù)比較全基因組甲基化、組蛋白甲基化、乙酰化等表觀遺傳修飾變化,重點(diǎn)研究ART所致的早期胚胎印記丟失(lossofimprinting)或印記松弛(relaxationofimprinting)等基因轉(zhuǎn)錄微環(huán)境的改變;

22、獲取ART動(dòng)物出生后子一代和子二代不同組織器官(胰腺、肝臟、心臟、血管、性腺等)標(biāo)本,篩選糖尿病、心血管疾病和生殖障礙相關(guān)差異基因/蛋白。通過(guò)數(shù)據(jù)挖掘分析,明確ART中高風(fēng)險(xiǎn)技術(shù)因素及相應(yīng)生物預(yù)警分子標(biāo)記。研究目標(biāo):通過(guò)輔助生殖主流技術(shù)誘發(fā)糖尿病、心血管病等胚胎源性疾病的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和干擾配子/胚胎發(fā)育機(jī)制研究,明確ART技術(shù)干擾影響配子發(fā)生和胚胎發(fā)育的高危因素及關(guān)鍵時(shí)間窗;篩選出超促排卵、體外培養(yǎng)和凍融技術(shù)致相關(guān)疾病的靶基因及生物預(yù)警標(biāo)記。承擔(dān)單位:浙江大學(xué)、中南大學(xué)課題負(fù)責(zé)人:黃荷鳳學(xué)術(shù)骨干:盧光琇、金帆、陳新、譚躍球、徐晨明經(jīng)費(fèi)比例:33%課題2:父/母源性生殖障礙誘發(fā)胚胎源性疾病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及

23、機(jī)制研究主要研究?jī)?nèi)容:1、生殖障礙患者ART子代健康追蹤研究以同期匹配的單純輸卵管性不孕ART子代為對(duì)照組,跟蹤觀察生殖障礙(PCOS和子宮內(nèi)膜異位癥)、嚴(yán)重少弱畸精癥患者經(jīng)ART出生子代的健康狀況。通過(guò)孕期B超監(jiān)測(cè)宮內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育,特別關(guān)注胎兒生長(zhǎng)受限(FGR)、LBW及SGA子代;檢測(cè)不同年齡段子代血清糖代謝、脂代謝、血管內(nèi)皮功能、生殖內(nèi)分泌等相關(guān)指標(biāo);無(wú)創(chuàng)性檢查心血管幾何結(jié)構(gòu)和功能,了解血管彈性及內(nèi)皮舒張功能等,評(píng)估父/母源性生殖障礙疾病是否增加胚胎源性疾病的易感性。2、生殖障礙患者ART子代差異基因/蛋白研究獲取PCOS、子宮內(nèi)膜異位癥和嚴(yán)重少弱畸精癥等生殖障礙疾病患者經(jīng)輔助生殖出生子代的

24、臨床標(biāo)本(如絨毛、羊水胎兒細(xì)胞、臍血、胎盤(pán)、外周血、唾液等),利用蛋白組學(xué)及全基因組表達(dá)譜芯片篩選差異表達(dá)的蛋白、印記基因與非印記基因,尤其是亞穩(wěn)態(tài)表等位基因,分析相應(yīng)生物學(xué)功能;應(yīng)用現(xiàn)代生物信息學(xué)技術(shù)進(jìn)行基因集合富集分析(GeneSetEnrichmentAnalysis,GSEA)、分類(lèi)預(yù)測(cè)分析(PredictionAnalysisforMicroarray,PAM)等,篩選發(fā)生顯著性改變的信號(hào)通路或者關(guān)鍵基因集合,遴選出可用于早期診斷及預(yù)警的分子標(biāo)志物。應(yīng)用DNA直接測(cè)序法,檢測(cè)生殖障礙患者ART子代與配子發(fā)生及與(糖尿病、心血管病、生育力低下等)胚胎源性疾病相關(guān)重要候選基因(AZF、G

25、DF-9、INSR等)的單核苷酸多態(tài)性(SNP),分析其與臨床表型的關(guān)聯(lián)性;應(yīng)用SNP芯片、外顯子組測(cè)序等技術(shù),確定嚴(yán)重少弱畸精癥主要基因變異對(duì)關(guān)鍵基因、蛋白的影響,重點(diǎn)研究(精子發(fā)生來(lái)源的、參與組蛋白和p53降解的)泛素化去泛素化(UPP)系統(tǒng)(包括Huwe1,USP2和USP19等分子)在輔助生殖過(guò)程中誘發(fā)胚胎源性疾病的作用和影響,尤其是對(duì)ICSI男性子代生育力的作用和影響。3、生殖障礙疾病模型及傳代效應(yīng)研究建立基于PCOS病理生理變化的動(dòng)物模型和模擬子宮內(nèi)膜異位癥腹腔微環(huán)境的體外模型,結(jié)合模式動(dòng)物和胚胎體外培養(yǎng)模型,觀察子宮內(nèi)膜異位癥盆腔微環(huán)境、PCOS卵巢局部不良微環(huán)境、宮內(nèi)高雄環(huán)境和

26、胰島素抵抗等不良暴露因素誘發(fā)子代胚胎源性糖尿病、心血管病和生育力降低的遠(yuǎn)期效應(yīng),以及對(duì)子二代的隔代遺傳效應(yīng)和親源性遺傳特征;獲取配子、植入前胚胎、以及宮內(nèi)至出生后發(fā)育各個(gè)時(shí)期靶器官組織標(biāo)本(胰腺、肝臟、肌肉、脂肪、心臟、血管、性腺等),動(dòng)態(tài)研究胚胎源性疾病相關(guān)差異基因及蛋白表達(dá)的發(fā)育階段特異性(stagespecificity)和組織器官特異性(tissuespecificity),明確致病關(guān)鍵時(shí)間窗。重點(diǎn)研究父母源性生殖障礙背景對(duì)卵泡發(fā)育、卵子成熟及早期胚胎重編程的干擾,尤其是高雄激素內(nèi)環(huán)境下KNDy、Kisspeptin和NKB信號(hào)系統(tǒng)對(duì)卵泡發(fā)育/成熟的負(fù)面影響。研究目標(biāo):明確排卵障礙性疾

27、病PCOS和子宮內(nèi)膜異位癥、嚴(yán)重少弱畸精癥等父/母源性生殖障礙疾病是否增加輔助生殖誘發(fā)胚胎源性疾病易感性及其關(guān)鍵因素;揭示生殖障礙疾病影響配子發(fā)生和胚胎/胎兒發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期,發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的表觀遺傳修飾改變和相關(guān)重要基因。承擔(dān)單位:南京醫(yī)科大學(xué)、中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所、浙江大學(xué)課題負(fù)責(zé)人:劉嘉茵學(xué)術(shù)骨干:王琳芳、祝輝、葉英輝、朱小明、宋偉經(jīng)費(fèi)比例:28.5%課題3:輔助生殖誘發(fā)胚胎源性疾病的發(fā)生機(jī)制研究主要研究?jī)?nèi)容:1、ART致早期胚胎表觀遺傳修飾改變的機(jī)制研究建立ART哺乳類(lèi)動(dòng)物模型,研究ART對(duì)哺乳類(lèi)動(dòng)物早期胚胎表觀遺傳修飾的影響及其對(duì)子代的近遠(yuǎn)期影響。利用胚胎干細(xì)胞體外分化模型及模式動(dòng)物

28、,結(jié)合差異表達(dá)的基因功能,定性、定量地分析早期胚胎印記丟失對(duì)胎盤(pán)與胎兒發(fā)育、印記基因表達(dá)、新生個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育以及成年期疾病的影響;重點(diǎn)研究體內(nèi)與體外胚胎的差異,識(shí)別可指示早期胚胎質(zhì)量的可溶性生物分子;分析不同生物因素對(duì)早期胚胎表觀遺傳修飾的干擾,探索能降低或避免早期胚胎表觀遺傳修飾改變的ART培養(yǎng)體系和生物因子組合。2、輔助生殖致胚胎源性糖尿病機(jī)制研究建立PCOS-ART動(dòng)物模型和傳代模型,分離低出生體重子代的胰腺和胰島素靶器官(肝臟、肌肉和脂肪),采用高通量和生物信息學(xué)分析方法,篩選影響胰島B細(xì)胞功能、靶器官糖原合成和葡萄糖利用的糖尿病相關(guān)重要候選基因(如調(diào)控B細(xì)胞增殖和分化的轉(zhuǎn)錄因子pdx-

29、1,參與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的基因glu-4,及胰島素下游信號(hào)通路分子PI3K,PKCIRS-1等),并在子一代、子二代進(jìn)行甲基化差異和相應(yīng)重要候選基因的表達(dá)差異驗(yàn)證。結(jié)合體外實(shí)驗(yàn),研究ART相關(guān)干擾對(duì)胰島B細(xì)胞數(shù)量、分泌功能及靶器官葡萄糖攝取、利用和糖原合成的影響,闡明ART出生小鼠子代和子二代發(fā)生糖尿病的風(fēng)險(xiǎn),明確傳代效應(yīng)。建立候選基因的胰島B細(xì)胞系過(guò)表達(dá)或敲減模型,檢測(cè)ERK1/2,PI3K/Akt/Cyclin等參與細(xì)胞增殖的信號(hào)通路,p53、caspase等參與細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路,以及sAC/cAMP等參與胰島素合成和分泌的信號(hào)通路,確定候選基因參與B細(xì)胞增殖/凋亡、胰島素合成/分泌的分子機(jī)制

30、;選擇在效應(yīng)最明顯的胰島素效應(yīng)器官(如肝臟,肌肉或脂肪)的原代培養(yǎng)細(xì)胞或細(xì)胞系中,超表達(dá)或敲減候選基因,檢測(cè)細(xì)胞對(duì)胰島素的應(yīng)答,例如效應(yīng)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取和分泌速率、糖原合成速率、脂肪細(xì)胞的分化和代謝等,并證明候選基因的作用機(jī)制和信號(hào)途徑。3、輔助生殖致胚胎源性心血管病機(jī)制研究結(jié)合課題1,2,確定ART子代出現(xiàn)心血管的年齡、表型,研究不同ART動(dòng)物模型所致子代心血管系統(tǒng)改變,探索ART方案及父母健康異常對(duì)子代心血管系統(tǒng)的影響,通過(guò)比較心血管指標(biāo)異常ART子代與正常子代血管(內(nèi)皮細(xì)胞,平滑肌細(xì)胞),心肌細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑(包括關(guān)鍵因子基因調(diào)控)的異同,驗(yàn)證在ART子代人群中篩選出候選體液調(diào)節(jié)因子

31、和基因調(diào)控因子,闡明ART子代心血管異常發(fā)生機(jī)制。結(jié)合體外實(shí)驗(yàn),在細(xì)胞水平研究ART藥物、ART實(shí)施時(shí)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境因素對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞,血管平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)遷移,血管內(nèi)皮細(xì)胞源性舒縮血管因子(NO,ET等),血管平滑肌舒縮的影響極其機(jī)制;研究ART子代候選體液調(diào)節(jié)因子、基因調(diào)控因子及表觀遺傳改變所致心血管異常高危險(xiǎn)的可能性極其機(jī)制。4、胚胎源性糖尿病、心血管病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)消減研究建立基于低出生體重的ART子代小鼠糖尿病/心血管病的誘導(dǎo)模型。在子代出生后,通過(guò)控制哺乳母鼠和斷奶小鼠的蛋白質(zhì)、糖、脂肪含量等的攝入量,觀察出生后營(yíng)養(yǎng)對(duì)ART子代糖尿病和心血管病相關(guān)指標(biāo)(空腹和餐后血糖水平、胰島素水平、糖耐量和

32、胰島素抵抗指數(shù)以及血壓、血管結(jié)構(gòu)和動(dòng)脈血管舒縮功能等)的影響,比較不同營(yíng)養(yǎng)模式ART子代糖尿病和心血管病的發(fā)病率,以及重要候選基因和相關(guān)信號(hào)通路分子的表達(dá),分析不同營(yíng)養(yǎng)模式、重要候選基因及關(guān)鍵信號(hào)分子表達(dá)水平和發(fā)病之間的關(guān)聯(lián)性,探索消減胚胎源性疾病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的營(yíng)養(yǎng)方式/生活方式,驗(yàn)證預(yù)測(cè)發(fā)病的分子標(biāo)記物。5、ART子代生育力降低機(jī)制研究SNP基因芯片分析臨床嚴(yán)重少弱畸精癥患者的血液、精子樣本及其ART子代臍血,調(diào)查其子代生育力降低的基因突變、拷貝數(shù)異常等遺傳變異,研究這些變異與表觀遺傳學(xué)變化的關(guān)系,明確ART技術(shù)是否會(huì)造成遺傳缺陷的累積傳遞。對(duì)于鑒定出的變異,通過(guò)模式生物(如轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú))識(shí)別這

33、類(lèi)遺傳變異是否是胚胎源性疾病的危險(xiǎn)因子。結(jié)合課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)的與精子組蛋白泛素化相關(guān)的重要蛋白Huwel、TRIM69,利用條件性基因敲除HuwelUSP2,USP19的小鼠模型,深入研究泛素化連接酶Huwel、TRIM69在精子發(fā)生、早期胚胎發(fā)育和DNA修復(fù)復(fù)合物泛素化調(diào)節(jié)中的作用,闡明ART相關(guān)干擾能否引起此類(lèi)蛋白功能異常,詮釋Huwel、TRIM69在子代精子功能、基因突變和表觀遺傳學(xué)改變中所起的作用,闡明ART相關(guān)干擾致子代生育力降低的可能分子機(jī)制。研究目標(biāo):揭示重要候選基因在胚胎源性糖尿病、心血管病和生育力低下發(fā)病中的作用和機(jī)制,重點(diǎn)闡明表觀遺傳學(xué)修飾機(jī)制在ART誘發(fā)的胚胎源性疾

34、病中作用,通過(guò)建立有效預(yù)警的生物標(biāo)志物,提出優(yōu)化ART和早期防控胚胎源性疾病的策略。承擔(dān)單位:浙江大學(xué)、中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所、四川大學(xué)課題負(fù)責(zé)人:楊衛(wèi)軍學(xué)術(shù)骨干:陳小章、孫方臻、趙正言、盛建中、董旻岳、許文明、黃衛(wèi)紅經(jīng)費(fèi)比例:38.5%課題間的相互關(guān)系本項(xiàng)目的三個(gè)課題分別從ART技術(shù)因素、生殖障礙相關(guān)疾病因素對(duì)配子和胚胎的影響,以及相關(guān)胚胎源性疾病發(fā)生機(jī)制三個(gè)方面進(jìn)行深入系統(tǒng)的研究,最終為胚胎源性疾病的防治和ART的優(yōu)化提供科學(xué)依據(jù)。三個(gè)子課題以輔助生殖誘發(fā)胚胎源性疾病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及發(fā)病機(jī)制研究為主線,在三個(gè)方面展開(kāi)研究:課題1和課題2為并列關(guān)系,課題1以自然妊娠出生子代為對(duì)照,研究A

35、RT誘發(fā)胚胎源性疾病的技術(shù)風(fēng)險(xiǎn)因素;課題2結(jié)合課題1以輸卵管阻塞性不孕ART子代為對(duì)照,研究母親PCOS、子宮內(nèi)膜異位癥及父親嚴(yán)重少弱畸精癥是否增加ART誘導(dǎo)胚胎源性疾病和子代生育力低下的機(jī)率;課題3是對(duì)課題1,2的深入,進(jìn)一步研究胚胎源性糖尿病和心血管疾病等以及ART致子代生育力降低的發(fā)生機(jī)制和傳代效應(yīng)。結(jié)合三個(gè)課題的研究結(jié)果,完成對(duì)發(fā)育源性疾病發(fā)病機(jī)制理論研究的突破,研究結(jié)果可為源頭防控胚胎源性疾病、優(yōu)化ART提供科學(xué)依據(jù)。五年目標(biāo)為總體目標(biāo)的分解,前兩年完成主要科學(xué)發(fā)現(xiàn),尤其關(guān)注臨床助孕技術(shù)安全性的基礎(chǔ)研究以及對(duì)子代隨訪資料的科學(xué)性和完整性進(jìn)行完善,并對(duì)研究?jī)?nèi)容進(jìn)行適當(dāng)修正以保證后三年深

36、入的機(jī)制研究的進(jìn)行。四、年度計(jì)劃年度計(jì)劃內(nèi)容和目標(biāo)研究?jī)?nèi)容預(yù)期目標(biāo)第年1、開(kāi)展人類(lèi)ART主流技術(shù)及PCOS、子宮內(nèi)膜異位癥患者ART出生子代的生長(zhǎng)發(fā)育、糖脂代謝和心血管結(jié)構(gòu)功能的健康追綜調(diào)查;收集子代臍血/外周血/組織標(biāo)本,整理流行病學(xué)資料2、建立ART及生殖障礙疾病的動(dòng)物模型和體外模型,研究ART技術(shù)對(duì)配子/胚胎/胎兒組織的表觀遺傳重編程的影響;分析出生子代及子二代的出生體重和成年后糖尿病、心血管病相關(guān)指標(biāo)3、通過(guò)高通量基因芯片分析,尋找ART子代動(dòng)物表達(dá)差異的基因,篩查ART導(dǎo)致表達(dá)異常的糖尿病、心血管相關(guān)基因1、建立并完善各類(lèi)ART技術(shù)及生殖障礙患者ART子代標(biāo)本庫(kù);制定出樣品采集、子代健康追蹤的標(biāo)準(zhǔn)化操作流程2、明確ART出生子代出現(xiàn)心血管、代謝異常的指標(biāo)、年齡、相關(guān)表型及表觀遺傳修飾機(jī)制;初步評(píng)估ART與子代糖尿病、心血管病的相關(guān)性及生殖障礙疾病致胚胎源性疾病的易感性3、篩選出ART相關(guān)

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