原代腫瘤細胞的分離培養(yǎng)(共9頁)

1、原代腫瘤細胞(xbo)的分離培養(yǎng)實驗(shyn)目的：從新鮮人體標本中分離(fnl)腫瘤細胞實驗器材：新鮮人體乳腺癌組織膠原酶（、型膠原酶干粉溶解于DF12培養(yǎng)基，濃度1mg/ml），DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清，PBS，雙抗（青鏈霉素，100）手術(shù)器械，培養(yǎng)皿，培養(yǎng)瓶，離心管，恒溫搖床，離心機，倒置顯微鏡，細胞培養(yǎng)箱實驗原理：酶消化法是把組織剪切成較小團塊（或糊狀），應(yīng)用酶的生化作用進一步使細胞間的橋連結(jié)構(gòu)松動，使團塊膨松，由塊狀變成絮狀，此時再采用機械法，用吸管吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩，使細胞團塊得以較充分的分散，制成少量細胞群團和大量單個細胞的細胞懸液，接種培養(yǎng)后，細胞容易貼壁生長

2、。酶消化分離法常采用胰蛋白酶和膠原酶。胰蛋白酶是一種胰臟制品，主要作用于賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵，使細胞間質(zhì)中的蛋白質(zhì)水解而使細胞分散開，適于消化細胞間質(zhì)較少的軟組織，能有效地分離肝、腎、甲狀腺、羊膜、胚胎組織、上皮組織等。膠原酶是一種從細菌中提取出來的酶，對膠原有很強的消化作用，適于消化纖維性組織、上皮組織以及癌組織，如乳腺、滑膜、子宮、纖維肉瘤、腫瘤組織等，它對細胞間質(zhì)有較好的消化作用，對細胞本身影響不大，可使細胞與膠原成分脫離而不受傷害。本實驗就使用、型膠原酶對乳腺癌組織進行消化，以獲取原代乳腺癌細胞。實驗步驟：將新鮮乳腺癌組織置于培養(yǎng)皿中，加入適量，使用眼科鑷和眼科剪去除組織上的血液

3、（血塊）、脂肪、壞死組織及結(jié)締組織，保留腫瘤細胞豐富的區(qū)域，并用清洗兩遍。將癌組織放入新的培養(yǎng)皿中，加入少量DMEM培養(yǎng)基，使用眼科剪將組織剪成約1mm3大小的碎塊。轉(zhuǎn)入15ml離心管中，用PBS沖洗數(shù)遍，組織塊自動下沉后，除去PBS。將組織塊轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中，加入5ml膠原酶和雙抗（稀釋至2），吹散組織碎塊，置于恒溫搖床上消化組織，調(diào)節(jié)速度150r/min，每隔30min于鏡下觀察一次。待組織塊鏡下透光性良好，呈絮狀時，轉(zhuǎn)入15ml離心管中，1300r/min離心5min，棄上清。加入PBS洗滌數(shù)次，反復(fù)吹打后，1300r/min離心5min，棄上清。加入DMEM完全培養(yǎng)基（含1雙抗），反復(fù)吹打

4、，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中，鏡下可見單個細胞及細胞團，細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。注意事項：全程嚴格(yng)無菌操作。取材(qci)要注意新鮮和保鮮。取材和原代細胞制作時，要用鋒利的器械，盡可能減少對細胞的機械(jxi)損傷，切碎組織時應(yīng)避免組織干燥。若組織在消化時間較長時仍未散開，可采用多次提取消化法以減少酶對已消化下來的細胞的損傷?；罴毎ぷ髡痉治黾夹g(shù)一、 本顯微鏡主要觀察方法簡介明場：適合常規(guī)鏡檢、病理、染色樣品的觀察方法。此觀察方法優(yōu)點是視野亮度高、均勻，應(yīng)用范圍廣，操作簡單。缺點是：透明標本對比度低，標本沒有立體感。相差：利用被檢物體的光程（折射率x 厚度）差進行鏡檢，即利用干涉現(xiàn)象，將相位差變?yōu)槿搜劭梢?/p>

5、分辨的振幅差。鑒定活體細胞最實用、最經(jīng)濟的方法。熒光：物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時釋放出的光，是非溫度輻射光冷光。即：物質(zhì)吸收短波光，發(fā)射出的長波光。熒光顯微鏡利用熒光光源激發(fā)樣品中的熒光物質(zhì)，檢測激發(fā)光的情況以上各種觀察方法配合活細胞孵育裝置，即可完成對活細胞的各種觀察要求?；罴毎跤b置通過軟件或TFT觸摸屏中Incubation模塊進行精細的調(diào)節(jié)。二、系統(tǒng)開關(guān)機開機順序打開顯微鏡電源總開關(guān)打開顯微鏡開關(guān)拍熒光時打開熒光光源打開電腦及軟件關(guān)機順序先關(guān)軟件，然后是熒光光源、顯微鏡開關(guān)、電源開關(guān)！三、明場觀察成像操作流程1. 開總電源,顯微鏡開關(guān)(“ON/

6、OFF”) 孵育裝置及電腦2. 打開鹵素燈的光閘“TL” 使光線透過聚光鏡穿透樣品3. 調(diào)節(jié)光強，光路100%轉(zhuǎn)到眼睛4. 聚光鏡打到H 位5. 反射鏡轉(zhuǎn)輪打到BF明場位置6. 低倍（如10X倍）下觀察樣品，通過X/Y拉桿移動載物臺至目標位置，并通過粗細調(diào)焦旋鈕聚焦，然后再調(diào)至高倍7. 準備(zhnbi)拍照了，首先光路切換至相機8. 打開(d ki)軟件，點開Live 按鈕9. 先曝光(bo gung)Exposure對照Live結(jié)果進一步精細聚焦調(diào)節(jié)曝光時間如果彩色模式拍照需要做自動或互動式白平衡（White balance，Interactive）再次曝光后Snap成像保存Save 10

7、. 拍照完畢，先關(guān)軟件，再關(guān)顯微鏡，孵育裝置及電腦四、相差觀察成像操作流程1. 開總電源,顯微鏡開關(guān)(“ON/OFF”) 孵育裝置及電腦2. 打開鹵素燈的光閘“TL” 使光線透過聚光鏡穿透樣品3. 調(diào)節(jié)光強，光路100%轉(zhuǎn)到眼睛4. 聚光鏡根據(jù)物鏡后面的Ph標注打到Ph 1/ Ph 2 或Ph3位5. 反射鏡轉(zhuǎn)輪打到BF位6. 低倍（如10X倍）下觀察樣品，通過X/Y拉桿移動載物臺至目標位置，并通過粗細調(diào)焦旋鈕聚焦，進而轉(zhuǎn)到高倍，根據(jù)個人不同需求7. 準備拍照了，首先光路切換至相機8. 打開軟件，點開Live 按鈕9. 先曝光Exposure對照Live結(jié)果進一步精細聚焦調(diào)節(jié)曝光時間彩色模式下

8、做白平衡再次曝光后Snap成像保存Save 10. 拍照完畢，先關(guān)軟件，再關(guān)顯微鏡，孵育裝置及電腦五、熒光觀察成像操作流程1. 開總電源,顯微鏡開關(guān)(“ON/OFF”)，熒光光源，孵育裝置及電腦2. 先按明場或相差觀察方法找到陽性信號3. 關(guān)閉鹵素燈光閘”TL”，打開熒光燈光閘“RL”4. 反射鏡轉(zhuǎn)輪根據(jù)標記探針的顏色打到GFP，Rhod或DAPI 5. 準備拍照了，首先光路切換至相機6. 打開軟件，點開Live 按鈕7. 先曝光Exposure對照Live結(jié)果進一步精細聚焦調(diào)節(jié)曝光時間Snap成像保存Save 8. 拍照完畢，先關(guān)軟件，再關(guān)顯微鏡，孵育裝置及電腦六、活細胞時序連拍流程時序模塊

9、可用于獲取一定時間內(nèi)的一系列圖像，如活細胞長時間的觀察和拍攝，生成的圖像就是一個時間序列，可用于分析隨時間變化的過程。首先放好樣品，調(diào)好曝光時間和焦距。恒溫孵育裝置的各參數(shù)通過軟件調(diào)節(jié)，在工作區(qū)找到Incubator可以對活細胞的環(huán)境條件：溫度，CO2- 或 O2的濃度進行精細調(diào)解。在工作區(qū)激活Multidimensional Acquisition下的屬性頁。在Experiment屬性頁選擇Time lapse功能。輸入需要的時間間隔，例如2分鐘。時間單位可以從下拉菜單中選擇。然后輸入想要獲取的圖像(t xin)數(shù)目（# Cycles）。從這兩個(lin )數(shù)字可以計算出總的實驗時間。用戶也

10、可以輸入時間間隔和總的持續(xù)時間，系統(tǒng)會自動計算圖像數(shù)目。選擇需要(xyo)計算的功能，也可以直接在輸入?yún)^(qū)輸入數(shù)值，然后單擊鍵進行計算。單擊start開始取圖。取圖進度通過一個進度條顯示。單擊Cancel即可取消取圖。生成的圖像顯示在圖像區(qū)，在這里可以用播放器對它進行操作。該圖象還未被保存，這時可以看見圖象名字是*號。最后保存或者導(dǎo)出圖象即可完成一份時序連拍圖。腫瘤干細胞分選與鑒定技術(shù)原理 腫瘤干細胞是腫瘤組織中少數(shù)具有無限增殖潛能的細胞，有很強的遷移、浸潤、轉(zhuǎn)移能力，能驅(qū)動腫瘤的形成和生長。腫瘤干細胞純化和培養(yǎng)是研究腫瘤干細胞各種生物學特性的基本手段。目前腫瘤干細胞一般有以下幾種分離方法：（1

11、）懸浮成球法（2）磁珠分選法（3）流式分選法。流式分選法以其高敏感性和高特異性被廣泛的應(yīng)用于腫瘤干細胞的分選。本實驗我們利用EpCAM標記肝癌干細胞并利用moflo XDP將其分離培養(yǎng)。方法與步驟1、細胞準備將huh7細胞消化后離心，用PBS洗兩遍離心并加100ulPBS懸?。?抗體孵育30min；用PBS清洗兩遍，離心后用PBS重懸等待上機。儀器調(diào)試準備（1）開機，將液流調(diào)試好后，用Beads矯正好儀器;（2）清洗儀器，按照無菌水、酒精、無菌水的先后順序各沖洗10min;（3）沖洗好儀器后，用儀器自帶軟件計算drop dealy ;（4）儀器準備好后，在軟件上畫好圖。3、分選（1）成球分選將

12、96孔板加入200ul成球培養(yǎng)基，用流式分別將1個與10個EpCAM+/EpCAM- 細胞加入96孔板?？寺⌒纬煞诌x將24孔板加入500ul成球培養(yǎng)基，用流式分別將50個與100個EpCAM+/EpCAM- 細胞加入24孔板。增殖分選將96孔板加入200ul成球培養(yǎng)基，用流式分別將1000個EpCAM+/EpCAM- 細胞加入96孔板。其他(qt)實驗分選 將其剩余(shngy)的細胞兩路分選入接收管中。注意事項消化細胞的過程中防止細胞消化過度(gud)。如果消化過度會造成DNA外露造成 細胞粘連成團，堵塞儀器。上機分選前，細胞懸液中加入7AAD以排除死細胞。死細胞可以從以下三個方面影響分選純

13、度 = 1 * GB3 * MERGEFORMAT 死細胞容易結(jié)合抗體，使肝癌干細胞的比例升高； = 2 * GB3 * MERGEFORMAT 死細胞的抗原表位容易發(fā)生變化可以特異性的結(jié)合抗體； = 3 * GB3 * MERGEFORMAT 死細胞的本底熒光高，影響抗體的表達量。用表面maker標記腫瘤干細胞時，我們往往選擇抗體表達量高的群體。分選細胞中的雙聯(lián)體或多聯(lián)體可以結(jié)合更多的熒光抗體，因此分選細胞時要將這部分細胞除去。無菌操作。Western操作步驟收集細胞，加入100l裂解液和1l蛋白酶抑制劑（比例100:1），置于冰上30min；4離心，15000rpm，15min；吸上清液于

14、新EP管中（約6080l）；按BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒操作說明測蛋白質(zhì)濃度；加入電泳加樣緩沖液（與吸取的上清比例為1:4），煮沸10min，緩慢恢復(fù)室溫后，稍離心，可置于-20保存，實驗時取出；制備凝膠：將洗凈且干燥的兩塊玻璃板底端對齊后安放在灌膠支架上，參照分離膠配制體系依次加入各個組分，混勻。將配置好的凝膠，沿玻璃板的一角小心緩慢注入，防止產(chǎn)生氣泡。根據(jù)梳子深度確定灌制高度，通常距離矮板至少2cm，灌好后，注入酒精或水封膠。此時可按照配方配制5%濃縮膠，注意TEMED在灌膠前再加入。靜置一段時間待凝膠聚合（約30min）。凝膠聚合后，棄去封膠溶液，并用吸水紙吸干。往濃縮膠里加入適量TEMED

15、，混勻后緩慢灌入到膠槽至矮板頂部，插上梳子，操作時避免產(chǎn)生氣泡。靜置一段時間（約30min）至凝膠聚合。8、上樣及電泳：安裝電泳槽，注意確保內(nèi)槽不漏緩沖液，往電泳槽加入足量電泳緩沖液，緩沖液要淹沒過玻璃板和凝膠。吸取適量樣品和分子量標準Marker，緩慢加入至膠孔。注意：加樣太快會使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出；加入下一個樣品時，要注意更換槍頭，以免交叉污染。上樣完畢后，蓋上電泳槽蓋子，接通電源，設(shè)置電泳條件，恒壓100-120V（可以先80V，待跑過濃縮膠后加至100V或以上）。電泳至溴酚蘭剛跑出即可關(guān)閉電泳儀停止電泳。9、轉(zhuǎn)膜：將玻璃板從電泳槽中取出，用塑料切膠器在玻璃板的兩邊

16、輕輕撬動，至到小玻璃板開始(kish)松動。除去小玻璃板后，將濃縮膠輕輕刮去，注意不要把分離膠刮破。PVDF膜預(yù)先用甲醇(ji chn)浸泡5min，然后(rnhu)將轉(zhuǎn)印膜、印跡濾紙和海綿墊浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液中10min。膜和印跡濾紙的大小應(yīng)裁剪至與膠的大小相當。在黑色面板上放置一層海綿墊，并依次放置至少3層印跡濾紙、凝膠、轉(zhuǎn)印膜和至少3層印跡濾紙。放置膜時盡量一次性準確放置，凝膠與轉(zhuǎn)印膜一旦接觸就不要再移動，并記住膜與膠的接觸面。玻璃試管輕輕滾壓濾紙擠出氣泡，并用海綿覆蓋。關(guān)上轉(zhuǎn)印夾，合上鎖扣。安裝好的轉(zhuǎn)印夾應(yīng)該使膠緊密地與PVDF膜接觸而不被擠壓。將組裝好的夾子裝入轉(zhuǎn)移電泳槽中，要使夾子的

17、黑面對槽的黑面。添加電轉(zhuǎn)緩沖液，蓋好蓋子，開啟并設(shè)置電轉(zhuǎn)條件，一般用150mA 1-2h。注意：電泳轉(zhuǎn)移時會產(chǎn)熱，需要在電泳槽的一邊放一些冰來降溫。免疫反應(yīng)：印跡后的PVDF膜用5%脫脂奶粉溶液室溫孵育封閉2h，將抗體用一抗稀釋液稀釋至適當濃度，室溫下孵育PVDF膜過夜。用PBST在室溫下?lián)u床上洗3次，每次15min。將過氧化物酶標記的二抗按照適當比例用PBST稀釋(二抗的種屬應(yīng)和一抗一致)，室溫下孵育PVDF膜2h。用PBST于室溫下?lián)u床上洗3次，每次15min。12、ECL化學發(fā)光與X光片定影：加入顯色底物后按常規(guī)X光片顯影方法將轉(zhuǎn)印膜上的信號轉(zhuǎn)移至X光片上。Real Time PCR操作

18、步驟RNA抽提1.所需材料試劑：(1).TaKaRa RNAiso Reagent試劑(2).氯仿(3).異丙醇 (4).75%乙醇（DEPC 處理水配制） (5).RNase-free 水（制備方法：使用 RNase-free 的玻璃瓶，向超純水中加入 DEPC 至終濃度 0.01%（v/v），過夜攪拌后，高溫高壓滅菌。(6).盡量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，應(yīng)在使用前按下列方法進行處理。 a） 用 0.1% DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在 37下處理 12 小時。 b） 然后在 120下高壓滅菌 30 分鐘以除去殘留的 DEPC。 RNA 實驗用的器具建議專門使用，不要用于其它實驗

19、。(7).用于 RNA 實驗的試劑，須使用干熱滅菌（180，60 分鐘）或使用上述方法進行 DEPC 水處理滅菌后的玻璃容器盛裝（也可以使用 RNA 實驗用的一次性塑料容器），使用的無菌水須用 0.1%的 DEPC 處理后再進行高溫高壓滅菌。RNA 實驗用的試劑和無菌水都應(yīng)專用，避免混用后交叉污染。RNAiso Reagent 的使用量情況(qngkung)如下2. 實驗樣品的研磨(ynm)和勻漿。 A. 貼壁培養(yǎng)細胞(xbo) 倒出培養(yǎng)液，用 1PBS 清洗一次。 每10 cm2生長的培養(yǎng)細胞中加入 2 ml的RNAiso Reagent，水平放置片刻，使裂解液均勻分布于 細胞表面并裂解細胞

20、，然后使用移液槍吹打細胞使其脫落（對于貼壁牢固的培養(yǎng)細胞可用細胞刮勺剝 離細胞）。 將內(nèi)含細胞的裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，用移液槍反復(fù)吹吸直至裂解液中無明顯沉淀。 室溫靜置 5 分鐘。 B. 懸浮培養(yǎng)細胞 將懸浮培養(yǎng)細胞連同培養(yǎng)液一起倒入離心管中，8,000 g 4離心 2 分鐘，棄上清。 向每 5106個細胞中加入l ml的RNAiso Reagent。 用移液槍反復(fù)吹吸直至裂解液中無明顯沉淀。 室溫靜置 5 分鐘。 C. 動物組織、植物材料樣品 將超低溫凍結(jié)的 RNA 提取樣品稱量后迅速轉(zhuǎn)移至用液氮預(yù)冷的研缽中，用研杵研磨組織，其間不斷加入液氮，直至研磨成粉末狀（無明顯的可見顆粒，如果沒有研磨

21、徹底會影響 RNA 的收率和質(zhì)量）。 對于普通的 RNA 提取樣品，可以向研缽中加入適量的 RNAiso Reagent，將研磨成粉末狀的樣品完全覆蓋，然后室溫靜置，直至樣品完全融化，再用研杵繼續(xù)研磨至裂解液呈透明狀。 3. 總 RNA 的提取。 向上述步驟 2 的勻漿裂解液中加入氯仿（RNAiso Reagent 的 1/5 體積量），蓋緊離心管蓋，用力震蕩（氯仿沸點低、易揮發(fā)，振蕩時應(yīng)小心離心管蓋突然彈開）。待充分乳化溶液呈乳白狀（無分相現(xiàn)象）后，再室溫靜置1 5 分鐘。 12,000 g 4離心 15 分鐘。 從離心機中小心取出離心管，此時勻漿液分為三層，即：無色的上清液、中間的白色蛋白

22、層及帶有顏色的下層有機相。吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中（切忌吸出白色中間層）。 向上清中加入等體積的異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻后，在室溫靜置 10 分鐘。 12,000 g 4離心 10 分鐘。一般在離心后，試管底部會出現(xiàn)沉淀。4. RNA 沉淀的清洗小心棄去上清，緩慢地沿離心管壁加入 75的乙醇 l ml（切勿觸及沉淀），輕輕上下顛倒洗滌離心管管壁，12,000 g 4離心 5 分鐘后小心棄去乙醇（為了更好地控制 RNA 中的鹽離子含量，應(yīng)盡量除凈乙醇）。 5. RNA 的溶解室溫干燥沉淀 25 分鐘（不可以離心或加熱干燥，否則 RNA 將會很難溶解，有關(guān) RNA 溶解可以參考Troubleshooting 中的相關(guān)說明），加入適量的 RNase-free 水溶解沉淀，必要時可用移液槍輕輕吹打沉淀，待 RNA 沉淀完全溶解后于-80保存。 6. RNA濃度測定 吸取lul抽提的RNA用DEPC水稀釋10倍后在紫外分光光度計上測定RNA濃度，以DE