動(dòng)物組織與細(xì)胞培養(yǎng)

1、關(guān)于動(dòng)物組織和細(xì)胞培養(yǎng)第一張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月一 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件無菌條件：凈化工作室，風(fēng)淋室，傳遞窗，高效過濾器，潔凈層流罩，生物安全柜，超凈工作臺(tái)，紫外燈，電熱干燥箱，高壓滅菌器，抗生素 細(xì)胞生長(zhǎng)條件：純水蒸餾器，純水儀，培養(yǎng)板，培養(yǎng)瓶， CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)基，血清細(xì)胞檢測(cè)條件：倒置顯微鏡，酶標(biāo)儀 ，微孔板震蕩器，高速離心機(jī)，移液器 細(xì)胞保存條件：液氮罐實(shí)驗(yàn)室安全：生物實(shí)驗(yàn)室安全，P1,P2,P3實(shí)驗(yàn)室安全第一節(jié) 細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)知識(shí)第二張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月(一) 無菌條件凈化工作室，風(fēng)淋室，傳遞窗，高效過濾器，潔凈層流罩，生物安全柜，超凈工

2、作臺(tái)，紫外燈，電熱干燥箱，高壓滅菌器，抗生素.第三張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月1 凈化工作室 - 我國(guó)藥品生產(chǎn)潔凈室（區(qū)）空氣潔凈度標(biāo)準(zhǔn) -潔凈度級(jí)別塵粒最大允許數(shù)/立方米塵粒最大允許數(shù)0.5um5um浮游菌/立方沉降菌/皿1003,50005110,000350,0002,0001003100,0003,500,00020,00050010300,00010,500,00060,000NA15第四張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月風(fēng)淋室是生物潔凈室的理想配套設(shè)備，用于吹除進(jìn)入潔凈廠房的人、物表面附著的塵埃是進(jìn)行人身、物料凈化和防止室外空氣侵入潔凈區(qū)的有效設(shè)備風(fēng)淋室可以配

3、合加熱器，冬天可以加熱，溫度可調(diào)，一般控制溫度在30-35較為適宜。2 風(fēng)淋室:第五張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月該裝置是一種潔凈室的輔助設(shè)備，主要用于潔凈區(qū)與潔凈區(qū)，潔凈區(qū)與非潔凈區(qū)之間小件物品的傳遞，以減少潔凈室的開門次數(shù)，把對(duì)潔凈區(qū)的污染降低到最低程度。3 傳遞窗:第六張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月高效過濾器是用超細(xì)玻璃纖維紙作濾料，膠板紙作分隔板，可與鋁合金框、木框及鍍鋅鋼板框組合而成。 特點(diǎn)：具有低阻高效、輕質(zhì)、容塵量大等特點(diǎn)，適用于常溫常壓常濕條件下環(huán)境空氣的凈化.4 高效過濾器:第七張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月層流罩是可提供局部高潔凈環(huán)境的空

4、氣凈化設(shè)備。潔凈層流罩是將空氣經(jīng)風(fēng)機(jī)以一定的風(fēng)壓通過高效空氣過濾器后，使?jié)崈艨諝獬蚀怪睔饬魉腿牍ぷ鲄^(qū)，從而保證了工作區(qū)內(nèi)達(dá)到工藝所需的高潔凈度。5 潔凈層流罩:第八張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月6 超凈工作臺(tái) 超凈工作臺(tái)的工作原理是利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動(dòng)空氣通過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺(tái)面，使工作臺(tái)內(nèi)構(gòu)成無菌環(huán)境。 第九張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月一種既能使操作造成無菌、無塵的局部空氣環(huán)境，保證檢驗(yàn)、檢測(cè)不受污染，又能保證被研究的對(duì)象（如病菌、細(xì)菌等）不外溢，保護(hù)周圍環(huán)境及操作人員的安全隔離設(shè)備。該設(shè)備可廣泛應(yīng)用于低、中等危險(xiǎn)度的臨床

5、細(xì)菌學(xué)，病毒學(xué)、微生物學(xué)、組織培養(yǎng)、生物學(xué)及生命科學(xué)的研究，加工、檢驗(yàn)部門。7 生物安全柜:第十張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月8 紫外燈 ：紫外線消毒。主要用于培養(yǎng)室空氣、操作臺(tái)、塑料培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等表面消毒 。 9 電熱干燥箱：干熱消毒（160 ，2小時(shí)）。主要用干玻璃器皿消毒 。10蔡氏（ Zeiss）濾器：過濾除菌，濾器中的濾膜一般用0.20.3m孔徑的微 孔濾膜。凡在高溫或射線下易發(fā)生變性或失去功能的物質(zhì)，如人工合成培養(yǎng)液、血清、消化 用胰酶等都須用濾器過濾除菌。 第十一張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月濾 器大容量高壓滅菌器 第十二張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于20

6、22年6月(二) 細(xì)胞生長(zhǎng)條件純水蒸餾器，純水儀，培養(yǎng)板，培養(yǎng)瓶， CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)基，血清第十三張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月1自動(dòng)雙重純水蒸餾器 2 純水儀反滲透 精濾、活性碳吸附 第十四張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月3 標(biāo)準(zhǔn)型細(xì)胞培養(yǎng)板 （Tissue Culture Plates）6孔，12孔，24孔，48孔，96孔 第十五張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月4 培養(yǎng)瓶第十六張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月5 CO2培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱主要由箱體結(jié)構(gòu)件、溫度控制系統(tǒng)和CO2濃度控制系統(tǒng)三部分組成。 CO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37 ，5CO2 。再現(xiàn)

7、活體環(huán)境對(duì)于溫度、PH值CO2濃度、氧分壓（O2濃度）、相對(duì)濕度等細(xì)胞生長(zhǎng)關(guān)鍵的因素， 第十七張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月6 移液器第十八張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月(三) 細(xì)胞檢測(cè)條件：倒置顯微鏡，酶標(biāo)儀 ，微孔板震蕩器，高速離心機(jī)，移液器 第十九張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月15用于微生物、細(xì)胞、細(xì)菌、組織 培養(yǎng)、懸浮體、沉淀物等的觀察，并可將此過程中的任一形態(tài)拍攝下來。 第二十張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月酶標(biāo)儀 微孔板震蕩器23通過自動(dòng)酶標(biāo)儀計(jì)數(shù)來檢測(cè)活細(xì)胞數(shù)量。主要用于酶標(biāo)板、細(xì)胞培養(yǎng)板(如6孔板、12孔板、24孔板、48孔、96

8、孔板等)等溶液的混勻或細(xì)胞的混勻。 第二十一張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月(四) 細(xì)胞保存條件：液氮罐-196 第二十二張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月(五) 實(shí)驗(yàn)室安全：生物實(shí)驗(yàn)室安全，P1,P2,P3實(shí)驗(yàn)室安全第二十三張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月實(shí)驗(yàn)室安全層流凈化細(xì)胞培養(yǎng)室管理規(guī)則一級(jí)生物安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室二級(jí)生物安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室三級(jí)生物安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室四級(jí)生物安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室第二十四張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月層流凈化細(xì)胞培養(yǎng)室的總體要求：經(jīng)濟(jì)、有序、高效、安全。初步制定相關(guān)制度如下：局部小環(huán)境空氣達(dá)到潔凈度等級(jí) 層流凈化細(xì)胞培養(yǎng)室管理規(guī)則 第二十

9、五張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月一級(jí)生物安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)室結(jié)構(gòu)和設(shè)施、安全操作規(guī)程、安全設(shè)備適用于對(duì)健康成年人已知無致病作用的微生物，如用于教學(xué)的普通微生物實(shí)驗(yàn)室等。 實(shí)驗(yàn)室安全級(jí)別第二十六張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月二級(jí)生物安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)室結(jié)構(gòu)和設(shè)施、安全操作規(guī)程、安全設(shè)備適用于對(duì)人或環(huán)境具有中等潛在危害的微生物。 第二十七張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月二級(jí)生物安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室1 可能產(chǎn)生致病微生物氣溶膠或出現(xiàn)濺出的操作均應(yīng)在生物安全柜(級(jí)生物安全柜為宜)或其他物理抑制設(shè)備中進(jìn)行，并使用個(gè)體防護(hù)設(shè)備。2 處理高濃度或大容量感染性材料均必須在生物安全柜

10、(級(jí)生物安全柜為宜)或其他物理抑制設(shè)備中進(jìn)行，并使用個(gè)體防護(hù)設(shè)備。上述材料的離心操作如果使用密封的離心機(jī)轉(zhuǎn)子或安全離心杯，且它們只在生物安全柜中開閉和裝載感染性材料，則可在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。3 當(dāng)微生物的操作不可能在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行而必須采取外部操作時(shí)，為防止感染性材料濺出或霧化危害，必須使用面部保護(hù)裝置(護(hù)目鏡、面罩、個(gè)體呼吸保護(hù)用品或其他防濺出保護(hù)設(shè)備)。4 在實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)穿著工作服或罩衫等防護(hù)服。離開實(shí)驗(yàn)室時(shí)，防護(hù)服必須脫下并留在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)。不得穿著外出，更不能攜帶回家。用過的工作服應(yīng)先在實(shí)驗(yàn)室中消毒，然后統(tǒng)一洗滌或丟棄。5 當(dāng)手可能接觸感染材料、污染的表面或設(shè)備時(shí)應(yīng)戴手套。如可能發(fā)生感染性材料

11、的溢出或?yàn)R出，宜戴兩副手套。不得戴著手套離開實(shí)驗(yàn)室。工作完全結(jié)束后方可除去手套。一次性手套不得清洗和再次使用。第二十八張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月三級(jí)生物安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)室結(jié)構(gòu)和設(shè)施、安全操作規(guī)程、安全設(shè)備適用于主要通過呼吸途徑使人傳染上嚴(yán)重的甚至是致死疾病的致病微生物及其毒素，通常已有預(yù)防傳染的疫苗。例如：艾滋病病毒的研究(血清學(xué)實(shí)驗(yàn)除外)應(yīng)在三級(jí)生物安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。 例如：重癥SARS病人傳染性 較強(qiáng)，這與病人產(chǎn)生的大量呼吸道飛沫有關(guān)。 第二十九張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月三級(jí)生物安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室1 實(shí)驗(yàn)室中必須安裝級(jí)或級(jí)以上生物安全柜。2 所有涉及感染性

12、材料的操作應(yīng)在生物安全柜中進(jìn)行。當(dāng)這類操作不得不在生物安全柜外進(jìn)行時(shí)，必須采用個(gè)體防護(hù)與使用物理抑制設(shè)備的綜合防護(hù)措施。3 在進(jìn)行感染性組織培養(yǎng)、有可能產(chǎn)生感染性氣溶膠的操作時(shí)，必須使用個(gè)體防護(hù)設(shè)備。4 當(dāng)不能安全有效地將氣溶膠限定在一定范圍內(nèi)時(shí)，應(yīng)使用呼吸保護(hù)裝置。5 工作人員在進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室工作區(qū)前，應(yīng)在專用的更衣室(或緩沖間)穿著背開式工作服或其他防護(hù)服。工作完畢必須脫下工作服，不得穿工作服離開實(shí)驗(yàn)室?？稍俅问褂玫墓ぷ鞣仨毾认竞笄逑?。6 工作時(shí)必須戴手套(兩副為宜)。一次性手套必須先消毒后丟棄。7 在實(shí)驗(yàn)室中必須配備有效的消毒劑、眼部清洗劑或生理鹽水，且易于取用?？膳鋫鋺?yīng)急藥品。第三十張

13、，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月四級(jí)生物安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)室結(jié)構(gòu)和設(shè)施、安全操作規(guī)程、安全設(shè)備適用于對(duì)人體具有高度的危險(xiǎn)性，通過氣溶膠途徑傳播或傳播途徑不明，目前尚無有效的疫苗或治療方法的致病微生物及其毒素。與上述情況類似的不明微生物，也必須在四級(jí)生物安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。待有充分?jǐn)?shù)據(jù)后再?zèng)Q定此種微生物或毒素應(yīng)在四級(jí)還是在較低級(jí)別的實(shí)驗(yàn)室中處理。 第三十一張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月1 在實(shí)驗(yàn)室中所有感染性材料的操作都必須在級(jí)生物安全柜中進(jìn)行。如果工作人員穿著整體的由生命維持系統(tǒng)供氣的正壓工作服，則相關(guān)操作可在級(jí)生物安全柜中進(jìn)行。2 所有工作人員進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室時(shí)都必須換上全套

14、實(shí)驗(yàn)室服裝，包括內(nèi)衣、內(nèi)褲、襯衣或連衫褲、鞋和手套等。所有這些實(shí)驗(yàn)室保護(hù)服在淋浴和離開實(shí)驗(yàn)室前均必須在更衣室內(nèi)脫下。第三十二張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月(六) 培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的條件1 細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)需要2 細(xì)胞的生存環(huán)境溫度: 37 ，O2CO2: 5%，CO2 +H2O H2CO3 H+ + HCO3-pH: 7.2-7.43 無污染4 無毒第三十三張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月1 細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制1）水：新鮮配置的三蒸水或去離子水2）平衡鹽溶液：無Ca2+、Mg2+的緩沖液，維持一定滲透壓和pH PBS：NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O

15、 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至1000 ml第三十四張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月3）消化液： 胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，除去細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細(xì)胞骨架，從而使細(xì)胞分離。胰蛋白酶是一種黃白色粉末，用無Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液配制,常用的胰蛋白酶液濃度是0.25 。用濾器過濾除菌。胰蛋白酶液消化時(shí)間：2-10分鐘。第三十五張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月4）培養(yǎng)基：培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細(xì)胞生存和生長(zhǎng)的溶液，分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。天然培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。優(yōu)點(diǎn)：營(yíng)養(yǎng)成分豐富

16、，培養(yǎng)效果好缺點(diǎn)：來源受限 成分復(fù)雜，影響對(duì)某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提取和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。 易發(fā)生支原體污染 第三十六張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月合成培養(yǎng)基：合成培養(yǎng)基是根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。目前已設(shè)計(jì)出許多種培養(yǎng)基，如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機(jī)鹽和其它一些輔助物質(zhì)。優(yōu)點(diǎn)：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對(duì)固定。成本低 。 缺點(diǎn)： 缺少某些成分，不能完全滿足體外細(xì)胞生長(zhǎng)需要。 第三十七張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十八張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十九張

17、，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第四十張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月人工合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存，要想使細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖，還需補(bǔ)充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。血清中含有：多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等） ；多種金屬離子；激素；促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等； 各種生長(zhǎng)因子；轉(zhuǎn)移蛋白；不明成分。第四十一張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月一般說來，含5小牛血清的培養(yǎng)基對(duì)大多數(shù)細(xì)胞可以維持細(xì)胞不死，但支持細(xì)胞生長(zhǎng)一般需加10血清血清中不僅存在促細(xì)胞生長(zhǎng)因子，同對(duì)也存在細(xì)胞生長(zhǎng)抑制因子或毒性因子，因此在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞所反映的生物學(xué)特性是細(xì)胞和復(fù)

18、雜血清因子的綜合反應(yīng)。第四十二張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月無血清培養(yǎng)基:在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中補(bǔ)充各種必需因子，如激素、生長(zhǎng)因子 、結(jié)合蛋白 、貼壁和擴(kuò)展因子 等。無血清培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和替代血清的補(bǔ)充成分組成。無血清細(xì)胞培養(yǎng)基優(yōu)點(diǎn)保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、可重復(fù)性和穩(wěn)定性，減少了細(xì)胞污染，簡(jiǎn)化了提純和鑒定各種細(xì)胞產(chǎn)物的程序。第四十三張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第四十四張，PPT共四十八頁，創(chuàng)作于2022年6月血清質(zhì)量好壞是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。常用血清有胎牛血潔、新生牛血清、小牛血清、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量最好。優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)：透明，淡黃色，無沉淀物，無細(xì)菌、支原體、病毒污染。血清的滅活（消除補(bǔ)體活性）：56 ，30 分鐘血清的消毒：過濾除菌補(bǔ)體是熱敏性的，是機(jī)體免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分，其主要功能是抗感染，補(bǔ)體雖然具備殺死病菌的作用，但有時(shí)