頭孢卡品酯微生物方法驗(yàn)證

1、頭孢卡品酯微生物限度驗(yàn)證方案起草日期分發(fā)部門機(jī)密等級(jí)：機(jī)密目錄（例）1方案批準(zhǔn)文件22驗(yàn)證方案2目的2范圍2概述2職責(zé)6計(jì)劃6測(cè)試項(xiàng)目6實(shí)施步驟6可接受標(biāo)準(zhǔn)6測(cè)試結(jié)果62.10漏項(xiàng)和偏差報(bào)告62.11報(bào)告62.12附件71、方案批準(zhǔn)文件對(duì)頭孢卡品酯的微生物限度檢查法驗(yàn)證試驗(yàn)需要用到的相關(guān)SOP進(jìn)行確認(rèn)微生物實(shí)驗(yàn)室操作管理規(guī)程培養(yǎng)基管理規(guī)程潔凈工作臺(tái)使用、維護(hù)保養(yǎng)操作規(guī)程生化培養(yǎng)箱使用、維護(hù)保養(yǎng)操作規(guī)程立式壓力滅菌器使用、維護(hù)保養(yǎng)操作規(guī)程微生物限度檢驗(yàn)儀使用、維護(hù)保養(yǎng)操作規(guī)程2、驗(yàn)證方案目的：在進(jìn)行常規(guī)的微生物限度檢查之前，需驗(yàn)證在實(shí)際檢驗(yàn)條件下，檢驗(yàn)用物品（包括供試品、稀釋液、培養(yǎng)基以及檢驗(yàn)用

2、具等）及操作程序不得對(duì)可能存在的微生物的生長(zhǎng)造成不良影響。本試驗(yàn)是關(guān)于頭孢卡品酯微生物限度檢查方法的驗(yàn)證。結(jié)果應(yīng)顯示，頭孢卡品酯微生物限度檢查方法符合驗(yàn)證要求。范圍：適用于頭孢卡品酯微生物限度檢查法的離心沉集與薄膜過濾聯(lián)合使用法。概述：由于需要建立本產(chǎn)品的微生物限度檢查方法，因此需要對(duì)本產(chǎn)品進(jìn)行方法的驗(yàn)證，此微生物限度檢查方法驗(yàn)證需要在其它各個(gè)系統(tǒng)（諸如滅菌設(shè)備、公用系統(tǒng)、空調(diào)系統(tǒng)、設(shè)備驗(yàn)證等）驗(yàn)證工作完成的基礎(chǔ)上進(jìn)行的。職責(zé)：質(zhì)量控制部微生物檢驗(yàn)員對(duì)本方案的實(shí)施嚴(yán)格的操作。2.5計(jì)劃：計(jì)劃實(shí)施驗(yàn)證時(shí)間為至2.6測(cè)試項(xiàng)目：頭孢卡品酯微生物限度檢查方法驗(yàn)證。實(shí)施步驟：試驗(yàn)用菌液制備取經(jīng)3035C

3、培養(yǎng)1824h的金黃色葡萄球菌、枯草芽抱桿菌、大腸埃希菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物1ml，用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍稀釋至10-510-7，使成50100CFU/ml，經(jīng)活菌計(jì)數(shù)后備用；取經(jīng)2328C培養(yǎng)2448h的白色念珠菌的改良馬丁液體培養(yǎng)物1ml,用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍稀釋至10-510-6,使成50100CFU/ml,經(jīng)活菌計(jì)數(shù)后備用；取經(jīng)2328C培養(yǎng)57天的黑曲霉改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)物，用0.9%無菌氯化鈉溶液5ml洗下黑曲霉抱子，吸出抱子懸液1ml，加0.9%無菌氯化鈉溶液適量稀釋至與標(biāo)準(zhǔn)比濁管濁度相當(dāng)?shù)谋ё討乙?，取抱子懸?ml，用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍稀釋至10-4,

4、使成50100CFU/ml,經(jīng)活菌計(jì)數(shù)后備用。頭孢卡品酯微生物限度檢查方法驗(yàn)證細(xì)菌計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證2.7.2.1.1樣品試驗(yàn)組取頭抱卡品酯樣品10g，加入200mlpH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，充分振搖，混勻，作為1：20的供試液。取1:20供試液10ml，先以500轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘，取全部上清液混勻作為供試液，取2ml供試液加至4045C90ml的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中混勻過濾，沖洗三次，每次100ml，并在最后一次沖洗液中加入50100cfu/ml大腸埃希菌,濾干后即制得濾膜，每株試驗(yàn)菌平行制備2張濾膜，將濾膜正面朝上貼于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，進(jìn)行培養(yǎng)計(jì)數(shù)。按上述方法同法

5、處理金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌。菌液組取試驗(yàn)用菌液1ml,分別注入平皿，立即傾注冷卻至45C營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，測(cè)定所加的試驗(yàn)菌數(shù)。供試品對(duì)照組取1：20供試液10ml，先以500轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘，取全部上清液混勻作為供試液，取2ml供試液加至4045C90ml的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中混勻過濾，沖洗三次，每次100ml，平行制備2張濾膜，將濾膜正面朝上貼于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，進(jìn)行培養(yǎng)計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)結(jié)果計(jì)算：X=AXK，X為菌數(shù)（cfu/g）；A為菌落平均數(shù)；K=10。稀釋劑對(duì)照組取pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液分別加入試驗(yàn)菌（大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和

6、枯草芽抱桿菌），使最終菌濃度為50100cfu/ml，以此加入試驗(yàn)菌的緩沖液作為供試液。取上述供試液10ml，先以500轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘，取全部上清液混勻作為供試液，取2ml供試液加至4045C90ml的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中混勻過濾，沖洗三次，每次100ml，每株試驗(yàn)菌平行制備2張濾膜，將濾膜正面朝上貼于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，進(jìn)行培養(yǎng)計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)結(jié)果計(jì)算：X=AXK，X為菌數(shù)（cfu/ml）；A為菌落平均數(shù)；K=0.5。培養(yǎng)將上述營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基置于3035C下培養(yǎng)48小時(shí)，計(jì)數(shù)并記錄結(jié)果。2.721.6試驗(yàn)組回收率（）=x100%試驗(yàn)組平均菌落數(shù)-供試品平均菌落數(shù)菌液組平均菌落數(shù)2

7、.7.2.1.7稀釋劑對(duì)照組回收率（）=稀釋劑對(duì)照組平均菌落數(shù)菌液組平均菌落數(shù)X%2.7.2.1.8可接受標(biāo)準(zhǔn)稀釋劑對(duì)照組回收率鼻70%試驗(yàn)組回收率$70%重復(fù)上述操作，直至做完3次，結(jié)果見表2表4。霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證樣品試驗(yàn)組取頭抱卡品酯樣品10g，加入200mlpH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，充分振搖，混勻，作為1：20的供試液。取1:20供試液2ml和含50100cfu/ml白色念珠菌1ml,分別注入平皿中，立即傾注冷卻至45C的玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿,進(jìn)行培養(yǎng)計(jì)數(shù)。按上述方法同法處理黑曲霉。菌液組取試驗(yàn)用菌液1ml，分別注入平皿，立即傾注冷卻至45

8、C玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，測(cè)定所加的試驗(yàn)菌數(shù)。供試品對(duì)照組取1：20供試液2ml注入平皿中，立即傾注冷卻至45C的玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，平行制備2個(gè)平皿，進(jìn)行培養(yǎng)計(jì)數(shù)。培養(yǎng)將上述玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基置于2328C下培養(yǎng)72小時(shí)，計(jì)數(shù)并記錄結(jié)果。2.2.5試驗(yàn)組回收率（）二試驗(yàn)組平均菌落數(shù)-供試品平均菌落數(shù)X100%菌液組平均菌落數(shù)可接受標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組回收率$70%重復(fù)上述操作，直至做完3次，結(jié)果見表5表7。2.7.2.3大腸埃希菌檢測(cè)方法的驗(yàn)證樣品試驗(yàn)組取頭抱卡品酯樣品10g，加入200mlpH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，充分振搖，混勻，作為1：20的供試液。取1:20供

9、試液20ml，先以500轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘，取全部上清液過濾，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗三次，每次100ml，并在最后一次沖洗液中加入10100cfu/ml大腸埃希菌,濾干后取出濾膜，加入到100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基，36C培養(yǎng)18-24小時(shí)，取上述培養(yǎng)物0.2ml，接種至含5mlMUG培養(yǎng)基的試管內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，分別于5h、24h紫外燈下觀察，觀察后沿管壁加入數(shù)滴靛基質(zhì)試劑，觀察顏色變化。陰性對(duì)照組取1:20供試液20ml，先以500轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘，取全部上清液過濾，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗三次，每次100ml，并在最后一次沖洗液中加入10100cfu/ml金黃色

10、葡萄球菌，濾干后取出濾膜，加入到100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基，36C培養(yǎng)18-24小時(shí)，取上述培養(yǎng)物0.2ml，接種至含5mlMUG培養(yǎng)基的試管內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，分別于5h、24h紫外燈下觀察，觀察后沿管壁加入數(shù)滴靛基質(zhì)試劑，觀察顏色變化?？山邮軜?biāo)準(zhǔn)：試驗(yàn)組檢出大腸埃希菌，陰性對(duì)照組未檢出大腸埃希菌。測(cè)試結(jié)果重復(fù)上述操作，直至做完3次，結(jié)果見表8表10。檢測(cè)的全過程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，連續(xù)3批產(chǎn)品的驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果均應(yīng)表明，細(xì)菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證的回收率均應(yīng)$70%；霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證的回收率均應(yīng)$70%；大腸埃希菌檢測(cè)方法驗(yàn)證中所有試驗(yàn)組均應(yīng)檢出大腸埃希菌，陰性對(duì)照組均不得檢出大腸埃希菌。該產(chǎn)品的微生物

11、限度檢查方法才可通過驗(yàn)證。表1實(shí)驗(yàn)用微生物的稀釋和計(jì)數(shù)表2第一次批號(hào)為頭孢卡品酯試驗(yàn)菌回收率驗(yàn)證結(jié)果菌種名稱菌種編號(hào)稀釋度接種量（ml）接種計(jì)數(shù)（CFU/ml）平均濃度（CFU/ml）金黃色匍萄球菌枯草芽抱桿菌大腸埃希菌白色念珠菌黑曲霉操作人/日期：復(fù)核人/日期：取1批生產(chǎn)樣品，批號(hào)為（驗(yàn)菌的回收率見表2表4。），按2.2.1操作進(jìn)行3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)，試試驗(yàn)菌菌數(shù)（cfu）皿1皿2平均回收率試驗(yàn)組稀釋劑組金黃色葡萄球菌菌液組菌數(shù)試驗(yàn)組菌數(shù)供試品對(duì)照組菌數(shù)稀釋劑對(duì)照組枯草芽抱桿菌菌液組菌數(shù)試驗(yàn)組菌數(shù)供試品對(duì)照組菌數(shù)稀釋劑對(duì)照組大腸埃希菌菌液組菌數(shù)試驗(yàn)組菌數(shù)供試品對(duì)照組菌數(shù)稀釋劑對(duì)照組操作人/日

12、期復(fù)核人/日期表3第二次批號(hào)為頭孢卡品酯試驗(yàn)菌回收率驗(yàn)證結(jié)果試驗(yàn)菌菌數(shù)（cfu）皿1皿2平均回收率試驗(yàn)組稀釋劑組金黃色葡萄球菌菌液組菌數(shù)試驗(yàn)組菌數(shù)供試品對(duì)照組菌數(shù)稀釋劑對(duì)照組枯草芽抱桿菌菌液組菌數(shù)試驗(yàn)組菌數(shù)供試品對(duì)照組菌數(shù)稀釋劑對(duì)照組大腸埃希菌菌液組菌數(shù)試驗(yàn)組菌數(shù)供試品對(duì)照組菌數(shù)稀釋劑對(duì)照組操作人/日期復(fù)核人/日期表4第三次批號(hào)為頭孢卡品酯試驗(yàn)菌回收率驗(yàn)證結(jié)果試驗(yàn)菌菌數(shù)（cfu）皿1皿2平均回收率試驗(yàn)組稀釋劑組金黃色葡萄球菌菌液組菌數(shù)試驗(yàn)組菌數(shù)供試品對(duì)照組菌數(shù)稀釋劑對(duì)照組枯草芽抱桿菌菌液組菌數(shù)試驗(yàn)組菌數(shù)供試品對(duì)照組菌數(shù)稀釋劑對(duì)照組大腸埃希菌菌液組菌數(shù)試驗(yàn)組菌數(shù)供試品對(duì)照組菌數(shù)稀釋劑對(duì)照組操作人

13、/日期復(fù)核人/日期），按2.2.2操作進(jìn)行3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)，試取1批生產(chǎn)樣品，批號(hào)為（驗(yàn)菌的回收率見表5表7。表5第一次批號(hào)為頭孢卡品酯試驗(yàn)菌回收率驗(yàn)證結(jié)果試驗(yàn)菌菌數(shù)（cfu）皿1皿2平均回收率試驗(yàn)組稀釋劑組白色念珠菌菌液組菌數(shù)試驗(yàn)組菌數(shù)供試品對(duì)照組菌數(shù)黑曲霉菌液組菌數(shù)試驗(yàn)組菌數(shù)供試品對(duì)照組菌數(shù)操作人/日期復(fù)核人/日期表6第二次批號(hào)為頭孢卡品酯試驗(yàn)菌回收率驗(yàn)證結(jié)果試驗(yàn)菌菌數(shù)（cfu）皿1皿2平均回收率試驗(yàn)組稀釋劑組白色念珠菌菌液組菌數(shù)試驗(yàn)組菌數(shù)供試品對(duì)照組菌數(shù)黑曲霉菌液組菌數(shù)試驗(yàn)組菌數(shù)供試品對(duì)照組菌數(shù)操作人/日期復(fù)核人/日期表7第三次批號(hào)為頭孢卡品酯試驗(yàn)菌回收率驗(yàn)證結(jié)果試驗(yàn)菌菌數(shù)（cfu）皿

14、1皿2平均回收率試驗(yàn)組稀釋劑組白色念珠菌菌液組菌數(shù)試驗(yàn)組菌數(shù)供試品對(duì)照組菌數(shù)黑曲霉菌液組菌數(shù)試驗(yàn)組菌數(shù)供試品對(duì)照組菌數(shù)操作人/日期復(fù)核人/日期由表2表4的結(jié)果可知金黃色葡萄球菌的回收率、枯草芽抱桿菌的回收率、大腸埃希菌的回收率均，均符合規(guī)定。說明頭抱卡品酯采用離心沉集與薄膜過濾聯(lián)合使用的方法能夠有效消除頭孢卡品酯的抑菌活性，并且采用離心沉集與薄膜過濾聯(lián)合使用的方法不干擾細(xì)菌計(jì)數(shù)方法測(cè)定。由表5表7的結(jié)果可知白色念珠菌的回收率、黑曲霉的回收率均，均符合規(guī)定。說明頭孢卡品酯采用離心沉集與薄膜過濾聯(lián)合使用的方法能夠有效消除頭孢卡品酯的抑菌活性，并且采用離心沉集與薄膜過濾聯(lián)合使用的方法不干擾霉菌及酵母

15、菌計(jì)數(shù)方法測(cè)定。取1批生產(chǎn)樣品，批號(hào)為（），按2.2.3操作進(jìn)行3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表8表10。表8第一次批號(hào)為頭孢卡品酯大腸埃希菌驗(yàn)證結(jié)果項(xiàng)目膽鹽乳糖培養(yǎng)基MUG靛基質(zhì)結(jié)論試驗(yàn)組檢出未檢出陰性對(duì)照組檢出未檢出操作人/日期復(fù)核人/日期表9第二次批號(hào)為頭孢卡品酯大腸埃希菌驗(yàn)證結(jié)果項(xiàng)目膽鹽乳糖培養(yǎng)基MUG靛基質(zhì)結(jié)論試驗(yàn)組檢出未檢出陰性對(duì)照組檢出未檢出操作人/日期復(fù)核人/日期表10第三次批號(hào)為頭孢卡品酯大腸埃希菌驗(yàn)證結(jié)果項(xiàng)目膽鹽乳糖培養(yǎng)基MUG靛基質(zhì)結(jié)論試驗(yàn)組檢出未檢出陰性對(duì)照組檢出未檢出操作人/日期復(fù)核人/日期由表8表10的結(jié)果可知,符合規(guī)定。說明頭抱卡品酯采用離心沉集與薄膜過濾聯(lián)合使用的方法能夠有效消除頭抱卡品酯的抑菌活性，并且采用離心沉集與薄膜過濾聯(lián)合使用的方法不干擾控制菌的檢驗(yàn)。2.9.1結(jié)論符合規(guī)定不符合規(guī)定備注：復(fù)核人：日期：漏項(xiàng)和偏差報(bào)告2.10.1.目的記錄在頭孢卡品酯微生物限度檢查方法驗(yàn)證方案實(shí)施過程中發(fā)現(xiàn)的偏差和采取的解決辦法。2.10.2操作對(duì)每一個(gè)出現(xiàn)的偏差，要確認(rèn)解決方法和實(shí)施解決方法所需的步驟（如適用）。把由出現(xiàn)偏差而導(dǎo)致的變更控制表格附