土壤酶研究方法(共6頁)

1、一、水解酶1.蔗糖(zhtng)酶-比色法（1）試劑(shj)配制：a.3,5-二硝基(xio j)水楊酸溶液：稱0.5g二硝基水楊酸，溶于20mL2N氫氧化鈉和50mL水中，再加30g酒石酸鉀鈉，用水稀釋至100mL(不超過7天)。b.pH5.5磷酸緩沖液：1/15M磷酸氫二鈉（11.867gNa2HPO42H2O溶于1L蒸餾水中）0.5mL加1/15M磷酸二氫鉀（9.078gKH2PO4溶于1L蒸餾水中）9.5mL即成。c.8%蔗糖溶液。d.甲苯。e.標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液：將葡萄糖先在50-58條件下，真空干燥至恒重。然后取500mg溶于100mL苯甲酸溶液中（5mg還原糖/mL），即成標(biāo)準(zhǔn)葡萄

2、糖溶液。再用標(biāo)準(zhǔn)液制成1mL含0.01-0.5mg葡萄糖的工作溶液。 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：取1mL不同濃度的工作液，并按與測定蔗糖酶活性同樣的方法進(jìn)行顯色，比色后以光密度值為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。（2）操作步驟：稱5g風(fēng)干土，置于50mL三角瓶中，注入15mL 8%蔗糖溶液，5mLpH5.5磷酸緩沖液和5滴甲苯。搖勻混合物后，放入恒溫箱，在37下培養(yǎng)24h。到時取出，迅速過濾。從中吸取濾液1mL，注入50mL容量瓶中，加3mL 3,5-二硝基水楊酸，并在沸騰的水浴鍋中加熱5min，隨即將容量瓶移至自來水流下冷卻3min。溶液因生成3-氨基-5-硝基水楊酸而呈橙黃色，最后用蒸餾水稀

3、釋至50mL，并在分光光度計上于波長508nm處進(jìn)行比色。為了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖而引起的誤差，每一土樣需做無基質(zhì)對照，整個(zhngg)試驗需做無土壤對照。（3）結(jié)果(ji gu)計算：以24h后1g土壤中葡萄糖的質(zhì)量(zhling)（mg）表示蔗糖酶活性（Suc）:Suc=aVn/m式中：a為由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的葡萄糖濃度（mg/mL）;V為顯色液體積（50mL）；n為分取倍數(shù)；m為烘干土重（g）。2.脲酶-比色法（1）試劑配制：a.pH6.7檸檬酸鹽緩沖液：取368g檸檬酸溶于600mL蒸餾水中，另取295g氫氧化鉀溶于水，再將兩種溶液合并，用1N(1mol/L)氫氧化鈉將pH調(diào)至6

4、.7，并用水稀釋至2L。b.苯酚鈉溶液：稱62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2mL甲醇和18.5mL丙酮，然后用乙醇稀釋至100mL（A液），保存在冰箱中。稱27g氫氧化鈉溶于100mL水中（B液），保存在冰箱中。使用前，取A、B兩液各20mL混合，并用蒸餾水稀釋至100mL備用。c.次氯酸鈉溶液：用水稀釋制劑，至活性氯的濃度為0.9%，溶液穩(wěn)定。d.10%尿素液。e.甲苯。f.氮的標(biāo)準(zhǔn)溶液：精確稱取0.4717g硫酸銨溶于水并稀釋至1000mL，則得1mL含0.1mg氮的標(biāo)準(zhǔn)液。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時，可再將此液稀釋10倍供用。標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：吸取稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液1、3、5、7、9、11、13mL，移于50

5、mL容量瓶中，然后加蒸餾水至20mL。再加4mL苯酚鈉溶液和3mL次氯酸鈉溶液，隨加隨搖勻。20min后顯色，定容。1h內(nèi)在分光光度計上于波長578nm處比色。根據(jù)光密度值與溶液濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（2）操作步驟：取5g風(fēng)干土，置于50mL三角瓶中，加1mL甲苯。15min后加10mL10%尿素液和20mLpH6.7檸檬酸鹽緩沖液。搖勻后在37恒溫箱中培養(yǎng)24h。過濾后取3mL濾液注入50mL容量瓶中，然后按繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線顯色方法進(jìn)行比色測定。（3）結(jié)果(ji gu)計算：以24h后1g土壤(trng)中NH3-N的質(zhì)量(zhling)（mg）表示脲酶活性（Ure）:Ure=aVn/m式中：a為由

6、標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的NH3-N濃度（mg/mL）;V為顯色液體積（50mL）;n為分取倍數(shù)；m為烘干土重（g）。3.磷酸酶-比色法（1）試劑配制：a.0.5%磷酸苯二鈉（用緩沖液配制）。b.pH5醋酸鹽緩沖液，pH7檸檬酸鹽緩沖液，pH9.4硼酸鹽緩沖液。c.氯代二溴對苯醌亞胺試劑：取0.125g 2,6-二溴苯醌氯酰亞胺，用10mL96%乙醇溶解，貯于棕色瓶中，存放在冰箱里。保存的黃色溶液未變褐色之前均可使用。d.酚的標(biāo)準(zhǔn)溶液：酚原液-取1g重蒸酚溶于蒸餾水中，稀釋至1L，貯于棕色瓶中。酚工作液-取10mL酚原液稀釋至1L（每毫升含0.01mg酚）。e.甲苯。f.0.3%硫酸鋁溶液。標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：

7、取1、3、5、7、9、11和13mL酚工作液，置于50mL容量瓶中，每瓶加入5mL緩沖液和4滴氯代二溴對苯醌亞胺試劑，顯色后稀釋至刻度，30min后比色測定。以光密度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪成標(biāo)準(zhǔn)曲線。（2）操作步驟：稱5g風(fēng)干土置于200mL三角瓶中，加2.5mL甲苯，輕搖15min后，加入20mlL0.5%磷酸苯二鈉（酸性磷酸酶用醋酸鹽緩沖液；中性磷酸酶用檸檬酸鹽緩沖液；堿性磷酸酶用硼酸鹽緩沖液），仔細(xì)搖勻后放入恒溫箱，在37下培養(yǎng)24h。后于培養(yǎng)液中加入100mL 0.3%硫酸鋁溶液并過濾。吸取3mL濾液(ly)于50mL容量瓶中，然后按繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線所述方法顯色。用硼酸緩沖液時，呈現(xiàn)藍(lán)色

8、，在分光光度計上于660nm處比色。（3）結(jié)果(ji gu)計算:以24h后1g土壤(trng)中釋出的酚的質(zhì)量（mg）表示磷酸酶活性（Pho）：Pho=aVn/m式中：a為由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的酚濃度（mg/mL）；V為顯色液體積（50mL）；n為分取倍數(shù)；m為烘干土重（g）。二、氧化還原酶1.過氧化氫酶-容量法（1）試劑配制：a.0.3%過氧化氫溶液。b.3N硫酸(1.5mol/L)。c.0.1N高錳酸鉀溶液。（2）操作步驟：取2g風(fēng)干土，置于100mL三角瓶中，并注入40mL蒸餾水和5mL0.3%過氧化氫溶液。將三角瓶放在往復(fù)式振蕩機上，振蕩20min。而后加入5ml 3N硫酸，以穩(wěn)定未分解的

9、過氧化氫。再將瓶中懸液用慢速型濾紙過濾。然后，吸取25mL濾液，用0.1N高錳酸鉀滴定至淡粉紅色終點。（3）結(jié)果計算：用于滴定土壤濾液所消耗的高錳酸鉀量（毫升數(shù)）為B，用于滴定25mL原始的過氧化氫混合液所消耗的高錳酸鉀量（毫升數(shù)）為A。（A-B）T 即為過氧化氫酶活性。以20min后1g土壤的0.1N高錳酸鉀的毫升數(shù)表示(biosh)。式中T為高錳酸鉀滴定度的校正值。胡雷，王長庭“，王根緒2，馬力(ml)，劉偉3，向澤宇4CL.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)(jsh)學(xué)院，四川成都610041;2.中國科學(xué)院水利部成都山地lX害與環(huán)境研究所，四川成都610041; 3.中國科學(xué)院西北高原生物研究

10、所，青海西寧810001;4.中國科學(xué)院水生植物與流域生態(tài)重點實驗室 中國科學(xué)院武漢植物園，湖北武漢430074)摘要:對三江源區(qū)不同退化演替階段的高寒草甸上壤酶活性和微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果表明:1)上壤微生物種類和數(shù)量并不隨著高寒草甸的退化而降低，而是在中度退化階段達(dá)到最高;2)不同退化演替過程，中度退化階段上壤微生物的結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜;3)不同上層中，0-10 cm上壤微生物的多樣性更加豐富，其群落結(jié)構(gòu)能更好地適應(yīng)外界環(huán)境的變化;r1 6種上壤酶的酶活性均隨上層深度的增加而顯著降低(PGO. 06。在不同退化演替階段，堿性磷酸酶的活性隨演替的進(jìn)行而顯著降低(PGO. 05);蛋白酶和多酚

11、氧化酶的酶活性最大值出現(xiàn)在中度退化演替階段，最小值則在未退化階段(原生植被)出現(xiàn);蔗糖酶和眠酶活性在1個演替階段中均無顯著變化(PG0.05)。不同酶活性對外界環(huán)境變化敏感性不同，蛋白酶、堿性磷酸酶和多酚氧化酶具有(jyu)較高的敏感性，而眠酶和蔗糖酶活性的敏感性較低;J)上壤酶活性與上壤微生物在高寒(gohn)草甸不同退化演替階段具有顯著相關(guān)性(PGO. 05)。上壤酶活性、上壤微生物群落結(jié)構(gòu)可以作為一個綜合指標(biāo)，來指示三江源區(qū)高寒草甸的演替階段(jidun)和退化程度。關(guān)鍵詞:高寒草甸;退化演替階段;上壤酶活性;上壤微生物群落;磷脂脂肪酸(PLFA)中圖分類5:S812.2;Q98.15文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A文章編5 :100個5759(201003-0008-12DOI:10.11686/cyx62010302內(nèi)容總結(jié)（1）一、水解酶1.蔗糖酶-比色法（1）試