實(shí)驗(yàn)三ELISA檢測溶血素

1、實(shí)驗(yàn)三 ELISA檢測溶血素1【試劑與器材】綿羊紅細(xì)胞（SRBC）免疫小鼠血清抗SRBC陽性和陰性血清辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的抗甲胎蛋白抗體碳酸鹽緩沖液（PH9.6）磷酸鹽緩沖液（PBS，PH7.4）鄰笨二胺液硫酸（2M）酶標(biāo)反應(yīng)板、微量加樣器、溫箱、冰箱、酶標(biāo)儀等。2【試劑與器材】包被稀釋液（0.05mol/L Na2CO3NaHCO3 緩沖液，PH9.6） Na2CO3 1.5g NaHCO3 2.9g 加雙蒸水至1000ml封閉液（5%小牛血清/PBS 溶液） 小牛血清50ml PBS（PH7.4）950ml洗滌液（PBST，PH7.4） NaCl 8.0g KH2PO4 0.2g

2、 Na2HPO4.12H2O 2.9g KCl 0.2g Tween 20 0.5ml 加雙蒸水至1000ml3【試劑與器材】樣本稀釋液（PBS，PH7.4） NaCl 8.0g KH2PO4 0.2g Na2HPO4.12H2O 2.9g KCl 0.2g 加雙蒸水至1000ml酶標(biāo)第二抗體：羊抗人IgG 標(biāo)記HRP（1：2000）4【試劑與器材】底物液（OPDH2O2） A 液 （0.1mol/L 檸檬酸溶液） 檸檬酸19.2g 加雙蒸水至1000ml B 液 （0.2mol/L Na2HPO4 溶液） Na2HPO4.12H2O 71.7g 加雙蒸水1000ml 臨用前取A 液24.3m

3、l，B 液25.7ml終止液（2mol/LH2SO4 溶液） 雙蒸水600ml，濃硫酸100ml（緩慢滴加并不斷攪拌），加雙蒸水至900ml5【操作方法】（1）包被酶標(biāo)反應(yīng)板用pH9.6 的碳酸鹽緩沖液1：200 稀釋抗體，用之包被聚乙烯塑料板，每孔加0.2ml， 4C 1224h。（2）封閉酶標(biāo)反應(yīng)板棄掉包被液，用PBS 洗滌3 次，甩干后用5%小牛血清/PBS 液封閉。放37C40min（或4C 過夜）。封閉結(jié)束后用洗滌液洗板，并在濾紙上拍干，每孔洗3遍，每遍3min。6ELISA平板包被間接法抗原包被: 將包被液稀釋的抗原（SRBC）BSA （2-10ug/ml）加入96孔酶標(biāo)版中，每孔

4、100ul，4C過夜。吸出上清液，加入封閉液200ul/孔。37C封閉1-1.5小時(shí)或4C過夜。封閉結(jié)束后用洗滌液洗板3次，每次3分鐘。7【操作方法】（3）按圖1-11 所示加入待測樣品及陽性對照（用PBS 稀釋）將稀釋好的待測血清樣品加入酶標(biāo)反應(yīng)板中，每孔0.2ml，陽性對照樣品亦相應(yīng)稀釋。置于37C 溫箱0.51h。棄去孔中液體，用洗滌液洗滌3 遍，每遍3min。（4）加酶標(biāo)二抗 （用PBS 稀釋）加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗甲胎蛋抗體，每孔0.2ml 置于37C 溫箱，3045 min。棄去孔中液體，拍干，每孔洗滌3 遍，每遍3min。8【操作方法】（5）加入底物液取底物液：A 液24.3

5、ml，B 液25.7ml，加雙蒸水50ml 得pH5.0 的磷酸枸緣酸緩沖液100ml。再加入鄰苯二胺40mg，充分溶解，最后加入30% H2O2 0.15ml。每孔加入底物液100l。避光室溫作用510min。（6）終止反應(yīng)當(dāng)陽性對照出現(xiàn)明顯顏色變化后，每孔加入終止液50l 終止反應(yīng)。9【結(jié)果分析】目測：根據(jù)顯色深淺，用（-）為無色，（+）為淺色，（+）為黃色，（+ + +）為棕黃色表示。一般呈+ +以上者為陽性酶標(biāo)儀測定：在492nm 波長下測OD 值（A492） 。當(dāng)待測樣品A492值與陰性對照A492值的比值（P/N）大于2.1時(shí)，或待測樣品A492對照A492值 +3s，即可判斷為陽性。以最大顯色至陽性顯色孔的50%反應(yīng)孔的抗體稀釋倍數(shù)為抗體效價(jià)。x10【注意事項(xiàng)】1.封閉時(shí)注意將封閉液加滿各反應(yīng)