紅花黃色素對(duì)實(shí)驗(yàn)性腎間質(zhì)纖維化大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響

1、紅花黃色素對(duì)實(shí)驗(yàn)性腎間質(zhì)纖維化大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響EffectofsfflowyellowinjectiononpoptosisofRenltubulrcellsInrtswithrenlinterstitilfibrosisGOYn，YUNi-jun，CHENHng，etl.TheffilitedHospitlofHebeiUniversity，Boding，Hebei071000,Chinbstrct】ObjectiveToobservetheeffectndmechnismofSfflowYellow(SY)onpoptosisofrenltubulrcellsinrtswith

2、renlinterstitilfibrosis.Methods45MleSprgue-Dwleyrtswererndomlydivideinto3groups:shm-opertedgroup()，theUUOmodelgroup(B)ndthetretmentgrouptretedwithSfflowYellowinjection(C).SfflowYellowinjection5mg/(kgd)wsdministeredtorts1dybeforeto9dyfterthesurgery.Kidneywerehrvesttdy10.Histologiclchngeswerelsoobserv

3、edbyHEndMssonstin.poptosisofrenltubulrcellswsdetectedbyterminldeoxynucleotidy1trnsfersemediteddUTPnickendlbelingssy(TUNEL).ResultsMrkedrenlinterstitilfibrosischngeswerefoundingroupBndgroupC.thelesionreinkidneysofgroupCsignificntlydecresedcompredwiththtofgroupB(PKeywords】Sfflowyellow;Renlinterstitilf

4、ibrosis;Tubulrepithelilcells;poptosis紅花黃色素是紅花中多種水溶性有效成分的混合物，屬查爾酮類有效部位群。多年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)其具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、抗血栓、抗動(dòng)脈粥樣硬化、降血脂、耐缺氧等藥理作用而應(yīng)用于心腦血管疾病。但有關(guān)紅花黃色素對(duì)腎臟病變的研究報(bào)道較少，且缺乏相應(yīng)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證據(jù)。研究證明，腎小管上皮細(xì)胞的凋亡、轉(zhuǎn)分化及分泌細(xì)胞外基質(zhì)等均參與了腎間質(zhì)纖維化的過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)UUO建立大鼠腎間質(zhì)纖維化模型，觀察紅花黃色素注射液對(duì)腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響，探討其腎臟保護(hù)機(jī)制。材料與方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組清潔健康雄性SD大鼠45只（購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心）體質(zhì)量1

5、80220g。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)周，隨機(jī)分為：假手術(shù)組（組），UUO組（B組），UUO聯(lián)合紅花黃色素治療組（C組）各15只。動(dòng)物模型制備大鼠經(jīng)2%戊巴比妥（50mg/kg）腹腔注射麻醉后，仰臥固定在手術(shù)臺(tái)上，腹部皮膚消毒，鋪無(wú)菌手術(shù)巾。左側(cè)腹腎區(qū)切口2cm，切開(kāi)腹壁各層，進(jìn)入腹腔。在左腹壁辨認(rèn)輸尿管后，分離輸尿管，于腎盞處和腎下級(jí)處分別結(jié)扎輸尿管，但并不離斷輸尿管，使左側(cè)完全梗阻后逐層縫合腹壁切口。假手術(shù)組開(kāi)腹后不結(jié)扎輸尿管，然后縫合腹腔作為對(duì)比1。給藥方法C組在術(shù)前1d開(kāi)始給予紅花黃色素注射液浙江永寧藥業(yè)股份有限公司，5mg/（kgd），放于適量生理鹽水中腹腔注射至術(shù)后第9天，組及B組予等量生理

6、鹽水腹腔注射。實(shí)驗(yàn)期間大鼠自由進(jìn)食水。標(biāo)本收集及制備術(shù)后第10天斷頭處死大鼠，處死后切取左腎，冠狀位剖開(kāi)，置于4%多聚甲醛固定12h，制備石蠟切片。檢測(cè)指標(biāo)及方法腎小管間質(zhì)的病理改變石蠟切片行HE、MSSON染色，光鏡下觀察腎小管間質(zhì)病變程度，測(cè)量皮質(zhì)相對(duì)間質(zhì)容積值。腎小管上皮細(xì)胞凋亡檢測(cè)（原位細(xì)胞死亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自中山生物有限公司）。方法腎組織病理檢查HE染色：切片常規(guī)脫蠟至水。蘇木精染色1min，自來(lái)水沖洗。1%鹽酸分化，自來(lái)水沖洗。伊紅染色2min。常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。MSSON染色：切片常規(guī)脫蠟至水。切片置于麗春紅染液2min。切片入2%冰醋酸水溶液2min。5

7、%磷鉬酸水溶液媒染2min。2%冰醋酸水溶液2min。甲基綠染色3min，自來(lái)水沖洗。95%乙醇分色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。光鏡下觀察其病理改變。腎小管上皮細(xì)胞凋亡檢測(cè)TUNEL實(shí)驗(yàn)步驟：切片經(jīng)二甲苯、梯度酒精脫蠟入水。滴加蛋白酶K、3%H2O2室溫孵育阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，滴加反應(yīng)混合溶液20以l（TdT2以l,熒光素連接的核甘酸混合緩沖液18此在濕盒中37c孵育60min。切片滴加1:2稀釋的轉(zhuǎn)化劑POD（HRP連結(jié)的抗熒光素抗體）20以1,在濕盒中37c孵育30min,進(jìn)行免疫反應(yīng)，擴(kuò)大信號(hào)。DBH2O2顯色。蘇木精復(fù)染。梯度酒精脫水,二甲苯透明,樹(shù)膠封片。圖象分析、結(jié)

8、果判定腎皮質(zhì)相對(duì)間質(zhì)容積及腎皮質(zhì)相對(duì)膠原含量采納真彩色病理圖像分析系統(tǒng)（北航4.0），Msson染色切片在高倍鏡（X200）下隨機(jī)選擇10個(gè)不含腎小球及血管的腎皮質(zhì)視野，以腎間質(zhì)面積占一個(gè)視野場(chǎng)面積的百分比，作為相對(duì)間質(zhì)容積值。Msson染色綠色為膠原纖維，測(cè)定綠色膠原面積占一個(gè)視野面積的百分比，作為腎皮質(zhì)相對(duì)膠原含量。腎小管上皮細(xì)胞凋亡檢測(cè)陰性對(duì)比片為省去TUNEL反應(yīng)液。光鏡下分析結(jié)果。凋亡細(xì)胞胞核呈棕黃色顆粒沉著，應(yīng)用真彩色病理圖像分析系統(tǒng)計(jì)算結(jié)果，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)不含腎小球和小血管的腎皮質(zhì)視野（X400）,計(jì)算每個(gè)視野凋亡陽(yáng)性細(xì)胞總個(gè)數(shù)占統(tǒng)計(jì)場(chǎng)總面積的百分比（數(shù)密度）。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

9、所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。計(jì)量資料采納均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差（xs）表示，組間差異比較采納單因素方差分析，以P結(jié)果腎小管間質(zhì)的病理改變?nèi)庋塾^察，組腎臟組織紅潤(rùn)，無(wú)腫大，B、C組梗阻側(cè)腎臟體積明顯增大，顏色變白，腎皮質(zhì)變薄。HE染色可見(jiàn)組腎臟病理未見(jiàn)改變。B組腎小管擴(kuò)張明顯，間質(zhì)中大量單核與淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。C組與B組相比腎小管擴(kuò)張、 TOC o 1-5 h z 間質(zhì)增寬程度、間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度有顯著降低(P腎小管上皮細(xì)胞凋亡檢測(cè)組未檢測(cè)到明顯的腎小管凋亡細(xì)胞。B組梗阻側(cè)腎臟可檢測(cè)到較多的凋亡細(xì)胞，C組與B組相比腎小管上皮細(xì)胞凋亡顯著降低(P討論紅花黃色素是從紅花中提取的有效成分，屬水溶性黃

10、酮中查爾酮類物質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)其具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、抗血栓、抗動(dòng)脈粥樣硬化、降血脂、耐缺氧等藥理作用而應(yīng)用心腦血管病的治療2，3。但有關(guān)紅花黃色素對(duì)腎臟病變的研究報(bào)道較少，且缺乏相應(yīng)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證據(jù)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)UUO建立大鼠腎間質(zhì)纖維化模型，觀察紅花黃色素對(duì)腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響，旨在探討紅花黃色素對(duì)腎間質(zhì)纖維化的作用機(jī)制。UUO是研究進(jìn)行性小管間質(zhì)纖維化成熟的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。在本研究中，觀察到梗阻后大鼠的腎臟體積增大，腎皮質(zhì)變薄，腎間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小管擴(kuò)張、壞死，腎間質(zhì)面積增寬，膠原成分增加，間質(zhì)纖維化病變突出。提示該模型的建立成功4，5。研究結(jié)果表明，腎臟疾病時(shí)腎小管上皮細(xì)胞增殖與凋亡之間的不平衡，可能是導(dǎo)致腎小管萎縮和腎功能惡化的機(jī)制之一，雖然以往從組織形態(tài)學(xué)和腎功能影響方面對(duì)輸尿管梗阻引起的腎細(xì)胞凋亡進(jìn)行闡述，但從分子水平上研究甚少。TUNEL法是一種分子生物學(xué)與免疫組織化學(xué)相結(jié)合原位檢測(cè)凋亡細(xì)胞DN片段的方法，因其靈敏可靠而被廣泛用于細(xì)胞凋亡的研究。本實(shí)驗(yàn)使用TUNEL法觀察到UUO組腎皮質(zhì)小管上皮細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯增加。與黃凌虹等6的報(bào)道一致。大量腎小