感染性疾病實驗室診斷

1、 感染性疾病(jbng)實驗室診斷 Laboratory Diagnosis of Infectious Diseases 共八十三頁 目的要求1掌握感染性疾病常用的實驗室檢測項目及其臨床意義和評價2熟悉引起血流、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、胃腸道、泌尿系統(tǒng)感染的常見(chn jin)病原體與常見(chn jin)疾病及病原學(xué)檢查3了解當(dāng)今感染病的特點、感染類型共八十三頁 第一節(jié) 概 述感染性疾病(jbng)：病原體 宿主 疾病病原體（細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲 ）共八十三頁一、當(dāng)今感染(gnrn)病的特點1 感染性病原體的種類不斷發(fā)生變遷2 宿主的免疫防御能力下降3 內(nèi)源性感染與條件致病菌的感染增

2、加共八十三頁二、 感染類型（一）按病原體分類(fn li) 1. 傳統(tǒng)病原體感染 細(xì)菌： 病毒： 真菌： 寄生蟲 2. 新發(fā)病原體： SARS冠狀病毒 新甲型H1N1流感病毒 高致病性禽流感病毒共八十三頁(二）按疾病特征分類1. 病原體被清除2. 隱性感染(gnrn)(covert infection)，亦稱亞臨床感染 一般占人群的90或以上 3. 顯性感染(overt infection)又稱為臨床感染 發(fā)病快慢和病程長短：急性感染和慢性感染 感染部位及性質(zhì)：局部感染和全身感染 全身感染： 菌血癥 敗血癥 毒血癥 膿毒血癥共八十三頁(三）按病原體來源(liyun)外源性感染內(nèi)源性感染共八十三

3、頁三、感染性疾病的實驗診斷（一）一般實驗檢測 WBC常規(guī)檢查 C-反應(yīng)蛋白（CRP） 血清降鈣素原（PCT） 器官(qgun)功能改變的檢測共八十三頁（二）病原學(xué)實驗診斷 臨床病原體檢查目的 明確感染病原體 指導(dǎo)治療(zhlio)，預(yù)防，判斷預(yù)后共八十三頁第二節(jié) 感染性疾病的常用(chn yn)病原學(xué)檢測病原學(xué)檢測基本程序 正確、規(guī)范采集和運送標(biāo)本 顯微鏡對標(biāo)本或組織(zzh)中的病原體的形態(tài)學(xué)檢查 病原體的分離培養(yǎng)和鑒定 用免疫學(xué)技術(shù)對病原體抗原或相應(yīng)抗體的檢測 用分子生物學(xué)方法對病原體特異性基因的檢測共八十三頁一 、臨床標(biāo)本(biobn)的采集與處理 （一）標(biāo)本采集的一般原則 1.早期 病

4、程早期、急性期或癥狀典型時 使用抗生素前 2.無菌采集 應(yīng)無污染，嚴(yán)格(yng)進(jìn)行無菌操作 采集的標(biāo)本均應(yīng)盛于無菌容器內(nèi) 3.根據(jù)目的菌的特性用不同的方法采集 4.適量標(biāo)本,不同病程采集不同部位標(biāo)本 5.安全采集做好標(biāo)記共八十三頁（二）標(biāo)本(biobn)的處理 原則：保持病原體活力，保持標(biāo)本不被污染，也不污染環(huán)境1.盡快送檢 對環(huán)境(hunjng)敏感的細(xì)菌應(yīng)保溫立即送檢,其他所有采集后最好在2小時內(nèi)送檢,不能及時送檢,應(yīng)注意保存2. 必須注意安全防護,切勿污染環(huán)境3.厭氧性標(biāo)本應(yīng)放在專門的運送瓶或試管內(nèi)運送，有時可直接用抽取標(biāo)本的注射器運送共八十三頁 二、 檢驗方法查病原體：形態(tài)與結(jié)構(gòu)檢查

5、 分離培養(yǎng)和鑒定檢測病原體成分（抗原和核酸）檢測患者(hunzh)血清中特異性抗體代謝產(chǎn)物 （生化試驗）毒素：外毒素、內(nèi)毒素共八十三頁（一）直接(zhji)顯微鏡檢查（形態(tài)與結(jié)構(gòu)檢查） 1. 染色標(biāo)本檢查法染色標(biāo)本：了解病原體的形態(tài)、染色性或觀察宿主細(xì)胞內(nèi)包涵體臨床意義： 1.鏡檢可以了解有無病原體及大致的量 2.根據(jù)細(xì)菌形態(tài)、結(jié)構(gòu)和染色性有助于對病原體的初步識別和分類 3.通過形態(tài)學(xué)檢查可得到初步診斷，對臨床早期診斷和治療疾病有 一定(ydng)的參考意義 如CSF找到抗酸桿菌，應(yīng)初步考慮結(jié)核分枝桿菌感染共八十三頁 革蘭陽性 革蘭陰性 抗酸染色共八十三頁 培養(yǎng)在McCoy細(xì)胞的沙眼衣原體 吉

6、姆薩染色的McCoy細(xì)胞，含大衣原體包涵(bo hn)體，使部分細(xì)胞核不清楚。（吉姆薩染色,放大1000倍） 狂犬病毒可于細(xì)胞(xbo)漿中可形成嗜酸性包涵體 共八十三頁新生(xnshng)隱球菌假絲酵母菌（白色(bis)念珠菌）革蘭染色 墨汁負(fù)染 共八十三頁 2.不染色(rns)標(biāo)本 1) 檢查生活狀態(tài)下細(xì)菌的動力及運動狀況2） 螺旋體由于不易著色并有形態(tài)特征 對某些病原菌作出初步鑒定，如霍亂弧菌 常用方法 壓片法(壓滴法)或懸滴法 暗視野顯微鏡或相差顯微鏡檢查共八十三頁體癬(t xun)皮屑可見關(guān)節(jié)孢子共八十三頁HAV particles found in fecal extracts b

7、y immunoelectron microscopy HAV形態(tài)(xngti)電鏡圖糞便標(biāo)本負(fù)染 X200000 3. 直接(zhji)電鏡檢測EM 免疫電鏡技術(shù)IEM共八十三頁（二）分離(fnl)培養(yǎng)和鑒定 分離培養(yǎng)是微生物學(xué)診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，是最可靠的傳統(tǒng)(chuntng)診斷技術(shù)臨床意義：1.明確感染病原體2.為臨床提供體外抗微生物藥物敏 感試驗結(jié)果共八十三頁藥物敏感(mngn)試驗標(biāo)本(biobn)培養(yǎng)特征形態(tài)特征生化試驗血清學(xué)試驗毒力試驗普通瓊脂平板？血平板？選擇培養(yǎng)基？1. 細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定共八十三頁培養(yǎng)特征共八十三頁細(xì)菌學(xué)診斷(zhndun)形態(tài)(xngti)特征血清學(xué)鑒定共八

8、十三頁大腸(dchng)埃希菌對照(duzho)-吲哚試驗枸椽酸鹽利用試驗大腸埃希菌甲基紅試驗VP試驗大腸埃希菌大腸埃希菌對照-對照+對照+生化試驗共八十三頁一）病毒分離(fnl)培養(yǎng) 1動物接種（二） 病毒(bngd)的分離與鑒定 2雞胚培養(yǎng)卵黃囊接種、絨毛尿囊膜接種尿囊接種及羊膜腔接種敏感動物合適部位共八十三頁3組織(zzh)細(xì)胞培養(yǎng)： 目前培養(yǎng)病毒應(yīng)用最廣的方法 （1）原代和次代細(xì)胞培養(yǎng) （2）二倍體細(xì)胞培養(yǎng) （3）傳代細(xì)胞培養(yǎng) 共八十三頁 識別病毒在培養(yǎng)細(xì)胞中增殖 病毒在培養(yǎng)細(xì)胞中增殖的指標(biāo) 1）細(xì)胞病變: 細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）、包涵(bo hn)體 2）紅細(xì)胞吸附（hemadsor

9、ption） 細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）： 病毒感染細(xì)胞后引起的細(xì)胞病變，可出現(xiàn)細(xì)胞圓縮、裂解或細(xì)胞 腫大、數(shù)個細(xì)胞融合成多核巨細(xì)胞等。二）病毒(bngd)鑒定共八十三頁Cytopathic effect (CPE) of primary severe acute respiratory syndromeassociated coronavirus strain48h72h36hN共八十三頁共八十三頁病毒學(xué)診斷(zhndun) 常用鑒定試驗： 中和實驗(shyn) 血凝抑制實驗共八十三頁virus共八十三頁 紅細(xì)胞凝集抑制(yzh)（HI）試驗原理： 病毒 病毒（特異性抗體） + + 紅細(xì)胞 紅細(xì)

10、胞 凝集 不凝集 血凝現(xiàn)象 血凝抑制現(xiàn)象 共八十三頁Confocal image showing a macrophage in the lung of a mouse infected with SARS-corona virus. Double immunofluorescence labels the macrophage in red with antibodies against Mac-2 and viral protein in green with antibodies against spike.共八十三頁 （三）真菌的分離(fnl)培養(yǎng) 常用培養(yǎng)基 沙保（Sabourud）

11、培養(yǎng)基 真菌的菌落有兩種：酵母型菌落和絲狀菌落酵母(jiom)型菌落絲狀菌落共八十三頁新生(xnshng)隱球菌假絲酵母菌（白色(bis)念珠菌）共八十三頁（三）鑒定(jindng)1.糖(醇)類發(fā)酵試驗 37孵育，觀察糖發(fā)酵情況。2.同化碳源試驗 含菌生理鹽水與已融化(rnghu)的固體同化碳源培養(yǎng)基(45)混合，然后在培養(yǎng)基上分別加糖，置25孵育觀察結(jié)果。若24h后無變化可重復(fù)加糖。如能同化周圍有生長圈，否則無生長。 3.同化氮源試驗 同化碳源試驗相同，但需用無氮源的培養(yǎng)基，不要加糖類，而加入硝酸鉀。共八十三頁 檢測(jin c)程序共八十三頁（三）病原體抗原與抗體(kngt)的檢測病原體

12、抗原成分的檢測： 早期診斷 現(xiàn)癥感染特異性 IgM： 早期診斷 現(xiàn)癥感染特異性 IgG： 雙份血清的滴度呈4倍或4倍以上升高(shn o)，考慮病原體現(xiàn)癥感染 *排除交叉反應(yīng)的影響共八十三頁夾心ELISA( 檢測(jin c)抗原）共八十三頁間接(jin ji)ELISA ( 檢測抗體）共八十三頁（四）病原體核酸(h sun)檢測 1核酸雜交技術(shù) 通過已知序列(xli)的探針與病原體的核苷酸雜交，用以了解病原體的有無。Southern印跡雜交（Southern blot） Northern印跡雜交（Northern blot） 斑點雜交（dot blot） 原位雜交（in situ hybri

13、dization,ISH） 2PCR擴增病原體微生物特異的DNA或 RNA片段 常用于檢測不能在體外培養(yǎng)或目前的培養(yǎng)技術(shù)不敏感、 費用高昂或耗時長的病原體 共八十三頁核酸分子(fnz)雜交(nucleic acid molecula hybridization)genomeprobe32P 35S 3H 125I 生物素 地高辛 酶genomegenomegenomeprobeprobeprobe檢測方法：放射自顯影(xin yng) 底物顯色 化學(xué)發(fā)光共八十三頁2PCR 共八十三頁3. 生物芯片(shn w xn pin)技術(shù)共八十三頁 核酸檢測結(jié)果評價檢測病原體微生物最靈敏的方法早期(zo

14、q)診斷現(xiàn)癥感染假陽性與假陰性共八十三頁 （五）細(xì)菌毒素的檢測(jin c) 1. 內(nèi)毒素的測定 常用方法：鱟試驗（limulus tests） 內(nèi)毒素與鱟試劑接觸時，可激活凝固酶原，使可溶 性的凝固蛋白原變成凝膠狀態(tài)的凝固蛋白 內(nèi)毒素(鱟試劑 ) 凝固酶原(mi yun) 凝固酶 凝固蛋白原 凝固蛋白(凝膠)共八十三頁2. 外毒素的測定(cdng)（1）體內(nèi)(t ni)毒力試驗 細(xì)菌外毒素對機體的毒性作用，可被相應(yīng)抗毒素中和，若先給動物注射抗毒素，然后再注射外毒素，則動物不產(chǎn)生中毒癥狀。共八十三頁 （2）體外毒力試驗 以細(xì)菌外毒素的特異性免疫血清為抗體與被檢細(xì)菌外毒素(抗原)進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)

15、，來檢測(jin c)外毒素，從而鑒定細(xì)菌是否產(chǎn)生該種毒素。 白喉棒狀桿菌的Elek平板毒力測定 （) 免疫學(xué)方法：如ELISA法 葡萄球菌腸毒素、腸產(chǎn)毒型大腸埃希菌LT及ST等的測定 （4）分子技術(shù) 共八十三頁Elek平板(pngbn)試驗Elek Test沉淀(chndin)線(陽性)含白喉抗毒素濾紙片白喉桿菌菌苔標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)毒株共八十三頁(六）體外抗菌藥物(yow)敏感試驗常用方法紙片擴散(kusn)法（Kirby-Bauer test）稀釋法（dilution test）E試驗法（E test） 殺菌試驗體外聯(lián)合藥物敏感試驗 共八十三頁 第三節(jié) 常見感染性疾病的實驗(shyn)診斷共八十三頁

16、一、血流感染（一）引起血流感染常見微生物與常見疾病常見微生物革蘭陽性球菌：葡萄球菌、 鏈球菌、腸球菌革蘭陰性桿菌：大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、沙門菌真菌：病毒(bngd)：HBV、HCV血流感染常見疾病細(xì)菌：菌血癥、敗血癥、膿毒血癥真菌：真菌血癥病毒：病毒血癥共八十三頁(二)血流感染的病原學(xué)檢查1. 血液標(biāo)本采集與運送采血時間：寒戰(zhàn)或體溫高峰(gofng)到來之前0.51hr 24小時內(nèi)采集23次采血量：成人510ml，嬰兒和兒童為12ml運送：血液置于含抗凝集聚茴香腦磺酸鈉無菌瓶中送檢共八十三頁血液標(biāo)本(biobn)的采集方法共八十三頁2、細(xì)菌學(xué)檢驗(jinyn)（1）檢驗程序b

17、loodaerobic culture anaerobic culture Bacteria growthBacteria growthProcedure for bacterial detection in bloodDirect microscopic examinationCulture(BA) colony characteristicsstain of smear and microscopic examinationBiochemical testSerological indentificationantibiotic susceptibility testDirect micr

18、oscopic examinationCulture(BA) anaerobic culturereportFirst reportEndotoxin detection共八十三頁（2）臨床意義陽性確診血流感染(gnrn)陰性：培養(yǎng)7天，未見細(xì)菌生長注意區(qū)分致病菌和污染菌共八十三頁2、真菌學(xué)檢驗(jinyn)（1）檢驗程序bloodaerobic culture Bacteria growthProcedure for fungal detection in bloodDirect microscopic examinationCulture(Sabouraud agaror CHROM ag

19、ar) colony characteristicsstain of smear and microscopic examinationBiochemical testSerological indentificationantibiotic susceptibility testPNA-FISH PCRreportFirst reportSerological detection共八十三頁（2）臨床意義初報：增菌培養(yǎng)真菌孢子終報：分離(fnl)培養(yǎng)鑒定菌株協(xié)助診斷：-D-1,3葡聚糖（BDG ） 半乳甘露聚糖（GM）共八十三頁二、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染（一）引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染常見微生物與常見疾病

20、常見微生物 腦膜炎奈瑟菌、結(jié)核分枝桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、大腸埃希菌 新生隱球菌、假絲酵母菌 乙型腦炎(no yn)病毒，單純皰疹病毒中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染常見疾病 腦膜炎 、腦炎、腦膿腫共八十三頁（二）中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的病原學(xué)檢查 1. 標(biāo)本(biobn)的采集與運送 腦脊液 臨床醫(yī)生采用腰椎穿刺，抽取2-3ml，置于無菌容器中 腦脊液應(yīng)立即保溫送檢或床邊接種，不能暫時保存于 冰箱中共八十三頁2. 細(xì)菌學(xué)、真菌學(xué)檢驗(jinyn)（1）檢驗程序CSFBacteria culture Procedure for bacterial and fungal detection i

21、n CSFGram stainSabouraud agarcolony characteristicsstain of smear and microscopic examinationBiochemical testantibiotic susceptibility testreportFirst reportMake smears(centrifuge)Acid-fast stainInk stainfungal culture BA, CA, MAC,L-J共八十三頁（2）臨床意義正常腦脊液：無菌直接涂片檢查 ：初報 G染色、抗酸染色、墨汁負(fù)染色分離(fnl)培養(yǎng)鑒定：（+）確診 共八十

22、三頁協(xié)助(xizh)診斷3、病毒學(xué)檢查(jinch)： 抗原抗體 核酸共八十三頁三、呼吸系統(tǒng)感染（一）引起呼吸系統(tǒng)感染常見微生物與常見疾病 上呼吸道感染： 病毒性感染（主）:鼻病毒、冠狀病毒、腺病毒、流感和副流感病毒、 呼吸道合胞病毒、?？刹《?、柯薩奇病毒 細(xì)菌性感染（20）：白喉棒狀桿菌、百日咳鮑特菌 乙型溶血性鏈球菌、流感嗜血(sh xu)桿菌、肺炎鏈球菌、葡萄球菌 肺部感染： 肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、大腸桿菌、 銅綠假單胞菌、結(jié)核分枝桿菌、假絲酵母菌、肺炎衣原體、 流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒共八十三頁（二）呼吸系統(tǒng)感染的病原學(xué)檢查 1. 標(biāo)本的采集與運送呼吸道

23、標(biāo)本類型：鼻咽拭子、痰和經(jīng)氣管采集的標(biāo)本上呼吸道存在正常菌群，在采集標(biāo)本與結(jié)果分析(fnx)時應(yīng)予考慮共八十三頁2. 細(xì)菌學(xué)、真菌學(xué)檢驗(jinyn)（1）檢驗程序Sputum,bronchal lavage,transtracheal aspirateSpecimen processingProcedure for bacterial and fungal detection in sputum,bronchal lavage,transtracheal aspiratecolony characteristicsstain of smear and microscopic examinat

24、ionBiochemical testSerological indentificationantibiotic susceptibility testreportFirst reportEye observationBA, CA, MAC,L-J, Sabouraud agarstain of smear and microscopic examination共八十三頁（2）臨床意義肉眼觀察痰性狀：鐵銹色痰 - 肺炎鏈球菌直接涂片鏡檢：抗酸桿菌- 結(jié)核分離培養(yǎng)(piyng)鑒定：確診共八十三頁3、病毒學(xué)檢驗：分離培養(yǎng)免疫學(xué)檢測分子(fnz)技術(shù)共八十三頁四、胃腸道感染（一）引起胃腸道感染常見

25、微生物與常見疾病 胃腸炎、腸炎、結(jié)腸炎： 霍亂、傷寒、菌痢 侵襲性：沙門菌、志賀菌、彎曲菌、致病大腸埃希菌、 耶爾森菌、副溶血弧菌 毒素性：霍亂弧菌、致病大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、 產(chǎn)氣莢膜梭菌、艱難芽胞梭菌 病毒(bngd)：輪狀病毒(bngd) 真菌：白色假絲酵母菌、曲霉菌共八十三頁二）胃腸道感染的病原學(xué)檢查 1. 標(biāo)本的采集與運送 糞便標(biāo)本自然排便，挑取膿、血或粘液部分于清潔容器中送檢； 液體糞便則取絮狀物，一般(ybn)取13ml 排便困難者，采用直腸拭子采集傳染性腹瀉應(yīng)連續(xù)送檢3次共八十三頁2、細(xì)菌學(xué)檢驗(jinyn)（1）檢驗程序Stool,rectal swab,food an

26、d wateranaerobic culturemicroaerobic culture Enrichment broths,SF broth,GN brothProcedure for bacterial detection in stool,rectal swab,food and waterWet mountsDirect microscopic examinationcolony characteristicsstain of smear and microscopic examinationBiochemical testSerological indentificationanti

27、biotic susceptibility testreportFirst reportIsolation culture Selective medium(MAC,SS,TCBS)共八十三頁（2）臨床意義直接涂片：一般不做 除外：疑為霍亂弧菌、彎曲菌感染以及腸結(jié)核、偽膜性腸炎胃粘膜活檢標(biāo)本： 幽門螺桿菌分離(fnl)培養(yǎng)鑒定：直接涂片革蘭染色菌群調(diào)查 ：抗生素相關(guān)腹瀉細(xì)菌毒素檢測病毒學(xué)檢查：共八十三頁五、泌尿系統(tǒng)感染（一）引起(ynq)泌尿系統(tǒng)感染常見微生物與常見疾病上尿路感染（輸尿管炎、腎盂腎炎）下尿路感染（膀胱炎、尿道炎）大腸埃希菌、變形桿菌、腸球菌、凝固酶陰性葡萄球菌、銅綠假單胞菌、結(jié)

28、核分枝桿菌、假絲酵母菌 共八十三頁二）泌尿系統(tǒng)(m nio x tn)感染的病原學(xué)檢查 1. 標(biāo)本的采集與運送應(yīng)注意無菌操作取清潔中段尿，排尿困難者可導(dǎo)尿厭氧培養(yǎng)采用膀胱穿刺法、無菌厭氧小瓶運送共八十三頁2、細(xì)菌、真菌學(xué)檢驗(jinyn)（1）檢驗程序Clean-catch midstreamurinestain of smear and microscopic examinationIsolation bacterial culture EIAFIAIsolation fungal cultureProcedure for bacterial detection in Clean-catch midstreamurineGram stainAcid-fast stainFontana stainGiemsa staincolony