實驗二細(xì)菌基因組DNA的提取

1、 細(xì)菌基因組DNA的提取一、實驗原理1、核酸的分類DNA 主要存在于細(xì)胞核的染色體中。核外也有少量DNA，如線粒體DNA（mtDNA），DNA（cpDNA），質(zhì)粒DNA。RNA 存在于細(xì)胞質(zhì)中，如mRNA, rRNA, tRNA等。除上述DNA，RNA外，還有非細(xì)胞形式存在的病毒和噬菌體，其或只含DNA，或只含有RNA。1分離純化核酸總的原則： 應(yīng)保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性； 排除其它分子的污染。核酸純化應(yīng)達(dá)到的要求： 核酸樣品中不應(yīng)存在有機溶劑和過高濃度的金屬離子； 其它生物大分子的污染應(yīng)降低到最低程度； 排除其它核酸分子的污染。2、核酸制備的一般原則2核酸制備時應(yīng)注意的事項: 盡量簡化操作步

2、驟，縮短提取時間。 減少化學(xué)因素對核酸的降解。 減少物理因素對核酸的降解：機械剪切力和高溫 防止核酸的生物降解。 3核酸制備的步驟：破碎細(xì)胞提取純化4核酸酶的抑制和抑制劑 降低溫度，改變pH及鹽的濃度，都利于對核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制劑更有利，當(dāng)然，幾個條件并用更好。 對于DNA，抑制DNase活力很容易，但防止機械張力拉斷則更重要。 對于RNA，因分子較小，不易被機械張力拉斷，但抑制RNase活力較難，故在RNA提取中設(shè)法抑制RNase更重要。3、核酸制備的一般方法和原理5DNase抑制 加入少量金屬離子螯合劑，如0.01 mol/L EDTA或檸檬酸鈉，DNase基本可以全

3、部失活。 去垢劑、蛋白變性劑及DNase抑制劑也可使DNase失活。6RNase抑制 操作要帶手套。 所有器皿要嚴(yán)格消毒， 試劑處理 低溫操作 在分離過程中要加入一定的RNase抑制劑。 7核酸制備中常用的去垢劑 核酸本身帶負(fù)電荷，結(jié)合帶正電荷的蛋白質(zhì)。用于核酸提取的去垢劑，一般都是陰離子去垢劑，去垢劑的作用： 1溶解膜蛋白及脂肪，使細(xì)胞膜破裂； 2溶解核小體上的蛋白質(zhì)，使其解聚，將核酸釋放出來； 3對RNase、DNase有一定的抑制作用。如：SDS、脫氧膽酸鈉、4-氨基水楊酸鈉、萘-1.5-二磺酸鈉、三異丙基萘磺酸鈉8核酸制備中常用的蛋白質(zhì)變性劑 1.使蛋白質(zhì)變性、沉淀，從核酸提取液中分離

4、除去，以防造成蛋白污染。 2.使蛋白質(zhì)變性，故可使核糖體解聚釋放出核酸。 3.某些蛋白質(zhì)變性劑也有抑制RNase活性和破裂細(xì)胞的作用。 如：苯酚、氯仿、鹽酸胍、DEPC9核酸制備中常用的酶 DNase RNase 蛋白酶K 溶菌酶 10細(xì)胞破碎 抽提去蛋白質(zhì) 沉淀核酸核酸提取的一般過程11細(xì)胞破碎 機械方法： 超聲波處理法、研磨法、勻漿法； 化學(xué)試劑法：用SDS處理細(xì)胞； 酶解法： 加入溶菌酶或蝸牛酶，破壞細(xì)胞壁。DNA提取 SDS（十二烷基硫酸鈉 ）法 ：SDS是有效的陰離子去垢劑, 細(xì)胞中DNA與蛋白質(zhì)之間 常借靜電引力或配位鍵結(jié)合, SDS能夠破壞這種價鍵。 CTAB（十六烷基三甲基溴化

5、銨 ）法 ：CTAB是一種陽離子去垢劑，它可以溶解膜與脂膜，使細(xì)胞中的DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物釋放出來，并使蛋白質(zhì)變性，使DNA與蛋白質(zhì)分離。DNA純化（去雜質(zhì)） 蛋白質(zhì)： 常用苯酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）或氯仿：異戊醇（24：1）抽提。 RNA ：常選用RNase消化 ，或是用LiCl來消除大分子的RNA。 酚類物質(zhì)： 提取液中加少量巰基乙醇，選取幼嫩的材料。 多糖： 提取液中加1PVP。 核酸提取的一般過程12核酸樣品的保存溫度： 4（5）最佳和最簡單 -70是長期保存的良好溫度，為一次性保存 -20保存保存介質(zhì)： TE緩沖溶液(最常用) 10mmol/L Tris-Cl pH8.0

6、1mmol/L EDTA pH8.013二、材料、設(shè)備及試劑 菌種 ：大腸桿菌設(shè)備 ：eppendorf管、微量取液器(20l,200l,1000l)， 臺式高速離心機， 渦旋振蕩器，水浴鍋（ 37 、60 ）試劑：LB液體培養(yǎng)基 、RNA酶A 、無水乙醇無菌水（或TE）緩沖液、 10%的SDS、 20mg/ml的蛋白酶K，、5mol/L NaCl、酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）、異丙醇、 75%乙醇、CTAB/NaCl溶液(CTAB:5gCTAB溶于100ml0.5molNaCl中，加熱到65度溶解。）141、培養(yǎng)5ml的細(xì)菌培養(yǎng)物至飽和狀態(tài)，取1.2ml的培養(yǎng)物離心12000rpm,1

7、min。2、沉淀物加入570ul的無菌水（或TE）緩沖液，用吸管反復(fù)吹打使之重懸。加入30ul 10%的SDS和10ul 20mg/ml的蛋白酶K，混勻，于37溫育1h，（加入3ul的溶菌酶50mg/ml效果更好）。3、加入100ul 5mol/L NaCl,充分混勻，再加入80ul CTAB/NaCl溶液，混勻，于60 溫育10min。(上下顛倒混勻)，離心，12000rpm,5min。4、取上清，加入等體積（約800ul）的酚：氯仿：異戊醇（25：24：1），混勻，離心12000rpm,5min，將上清液轉(zhuǎn)至新管中。（抽提兩次）5、加入0.6體積異丙醇，輕輕混合直到DNA沉淀下來，靜止10

8、分鐘，離心,12000rpm,10min 。6、沉淀用1ml的75%乙醇中洗滌，離心5min，棄上清液，重懸于30ul的無菌水（或TE）緩沖液。三、操作步驟15四、注意事項材料準(zhǔn)備最好使用新鮮材料，低溫保存的樣品材料不要反復(fù)凍融16四、注意事項細(xì)胞裂解材料應(yīng)適量，過多會影響裂解，導(dǎo)致DNA量少，純度低針對不同材料，選擇適當(dāng)?shù)牧呀忸A(yù)處理方式：植物材料液氮研磨動物組織勻漿或液氮研磨組培細(xì)胞蛋白酶K細(xì)菌溶菌酶破壁酵母破壁酶或玻璃珠高溫溫浴時，定時輕柔振蕩17四、注意事項核酸分離、純化采用吸附材料吸附的方式分離DNA時，應(yīng)提供相應(yīng)的緩沖體系采用有機（酚/氯仿）抽提時應(yīng)充分混勻，但動作要輕柔離心分離兩相時，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時間針對不同材料的特點，在提取過程中輔以相應(yīng)的去雜質(zhì)的方法18四、注意事項核酸沉淀、溶解當(dāng)沉淀時間有限時，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會更充分沉淀時加入1/10體積