霍亂弧菌的分離與鑒定(共18頁(yè))

1、霍亂弧菌的分離(fnl)與鑒定濮陽(yáng)市疾病(jbng)預(yù)防控制中心一、標(biāo)本的采集(cij)和送檢:1.標(biāo)本的采集：糞便標(biāo)本：應(yīng)爭(zhēng)取在發(fā)病早期、服用抗菌藥物之前采集；采便方法：可用棉拭采取自然排出的新鮮大便，亦可用直腸棉拭采便管由肛門插入直腸內(nèi)35厘米處采取。采樣要求：水樣便采取12毫升，成形便采取指甲大小的糞量。病人嘔吐物、沾染糞便的衣物、尸體的腸腔和口腔內(nèi)容物亦可作為檢材。外環(huán)境樣本可采取病人的污染衣物、剩飯菜、可疑食品、抹布、污水、坑塘水、井水、公廁糞便、蒼蠅等。按1:10比例置入堿性蛋白胨水增菌液中，迅速送往實(shí)驗(yàn)室。4）肛拭采集的注意事項(xiàng)：1.棉拭子要用竹簽，圓形、光滑以免采樣時(shí)易斷；2.

2、棉拭子做的要稍大而緊固(避免采集時(shí)脫落)；3.采集者應(yīng)穿戴一次性手套；4.采集前將棉拭子用堿性蛋白胨水(APW)蘸濕，多余的液體緊靠管壁擠出；5.采集時(shí)要求被采集者雙腿分立、微屈、手扶墻或凳子趴下，勸其用單手或雙手協(xié)助分開(kāi)(fn ki)股溝(或采集者用左手分開(kāi)股溝)，右手持棉拭子輕輕旋轉(zhuǎn)插入肛門內(nèi)約45cm(幼兒(yu r)約23cm)處，轉(zhuǎn)動(dòng)數(shù)秒鐘從緊靠(jn ko)肛環(huán)邊的隱窩旋轉(zhuǎn)擦取直腸表面黏液后退出； 6.棉拭子在推進(jìn)時(shí)如感覺(jué)遇到阻力，應(yīng)調(diào)整角度后緩緩旋轉(zhuǎn)推進(jìn)，避免用力過(guò)大或推進(jìn)太快造成肛壁出血而影響病原菌的檢出；棉拭子進(jìn)入的深度一定要夠，否則采集的有效標(biāo)本量會(huì)很少；7.采集的標(biāo)本拭子

3、應(yīng)立即置入APW內(nèi)，手接觸的部分在管口折斷棄去。填寫(xiě)采樣登記表(單)，并在采樣管上填寫(xiě)被采集者的樣品編號(hào)、姓名、性別、年齡，盡快送檢。二、快速診斷：1.直接鏡檢： 為爭(zhēng)取最快速度作出診斷，采取病人“米泔水樣”大便或嘔吐物，懸滴法鏡檢(最好用暗視野)，可見(jiàn)具有流星狀動(dòng)力的細(xì)菌。2.特異性制動(dòng)試驗(yàn)：取檢材或新鮮堿性蛋白胨水培養(yǎng)物一滴，置于載玻片上，再加霍亂弧菌O1多價(jià)或O139診斷血清，加蓋玻片，用暗視野顯微鏡觀察，3分鐘內(nèi)流行狀運(yùn)動(dòng)細(xì)菌被抑制的即為陽(yáng)性，此法優(yōu)點(diǎn)是快速而特異，操作簡(jiǎn)便，可 在幾分鐘之內(nèi)做出初步診斷。但要求標(biāo)本必須有較多數(shù)量的弧菌，免疫血清最好是不加防腐劑的。 3.早期玻片凝集(n

4、ngj)試驗(yàn)：埃爾托弧菌(h jn)在TCBS、4號(hào)瓊脂及慶大霉素平皿上生長(zhǎng)較快，37培養(yǎng)810小時(shí)，在其他雜菌尚未生長(zhǎng)或長(zhǎng)出很小菌落的情況下，埃爾托型菌落直徑可達(dá)12mm。將已長(zhǎng)出較大半透明菌落或濕潤(rùn)菌苔的平皿取出，直接用霍亂多價(jià)血清做玻片凝集，陽(yáng)性者可做初步報(bào)告。瓊脂平皿繼續(xù)培養(yǎng)，接常規(guī)(chnggu)培養(yǎng)時(shí)間再作一次復(fù)查。4.霍亂弧菌膠體金免疫層析快速檢測(cè)： (1)原理：采用膠體金免疫層析雙抗體夾心法，檢測(cè)標(biāo)本中霍亂弧菌。以膠體金作為標(biāo)記物，交聯(lián)抗霍亂弧菌(O1群/O139群或O1群E1Tor型小川血清型、稻葉血清型)單克隆抗體，與樣品中的霍亂弧菌(O1群/O139群)結(jié)合。形成雙抗體夾

5、心一步法，呈現(xiàn)出目測(cè)可見(jiàn)的紅色條帶，顯色程度與抗原含量成正比。 (2)特點(diǎn)：靈敏度高、特異性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)便、快速，省力省時(shí)；對(duì)于典型霍亂病人水樣或米泔樣便結(jié)果準(zhǔn)確、易于判讀；但對(duì)于含霍亂弧菌少的糞便標(biāo)本易出現(xiàn)假陰性；對(duì)膿血便標(biāo)本易出現(xiàn)假陽(yáng)性。3)操作步驟：將檢測(cè)卡放置與潔凈、干燥的工作臺(tái)上；實(shí)驗(yàn)前，請(qǐng)將試劑恢復(fù)至室溫；用吸管取病人水樣便樣品(yngpn)23滴，加入檢測(cè) 卡一端的加樣孔，計(jì)時(shí)并觀察反應(yīng)(fnyng)結(jié)果；2-15分鐘內(nèi)觀察結(jié)果(ji gu)，20分鐘之后結(jié)果不能 判讀 。(1) 濾樣紙（加樣區(qū)）； (2) 玻璃纖維膜，膜上吸附著干燥的金標(biāo)抗原 ； (3) 硝酸纖維素膜，膜上包被的

6、抗原和抗體呈線狀； (4) 吸水紙。 三、直接分離、培養(yǎng)：急性期病人水樣大便標(biāo)本在增菌培養(yǎng)的同時(shí)可用選擇性培養(yǎng)基直接劃線(hu xin)分離。目前常用的強(qiáng)選擇性培養(yǎng)基有TCBS瓊脂、4號(hào)瓊脂和慶大霉素瓊脂等。置371014h孵育(f y)培養(yǎng)。 四、APW增菌、分離(fnl)：所有糞便標(biāo)本都應(yīng)經(jīng)過(guò)增菌，尤其是恢復(fù)期病人，帶菌者或用過(guò)抗菌藥物的病人標(biāo)本含菌量少，單靠直接分離不易檢出，需經(jīng)堿胨水37增菌68小時(shí)后分離(夏日可將運(yùn)送時(shí)間計(jì)算在內(nèi))；標(biāo)本含菌量少時(shí)，為提高檢出率可實(shí)行2次增菌，取第一次堿胨水增菌后的培養(yǎng)物表層液0.10.2毫升，接種于810毫升的堿胨水中，37培養(yǎng)68小時(shí)后再做分離；霍

7、亂弧菌好氧，易形成的菌膜，故在取出增菌管時(shí)動(dòng)作要輕，接種環(huán)于菌膜下取一滿環(huán)，劃線接種于TCBS或4號(hào)瓊脂平板371014h孵育培養(yǎng)。五、血清學(xué)凝集試驗(yàn)：1.玻片凝集試驗(yàn)：自分離培養(yǎng)基上挑取可疑菌落與O1群霍亂多價(jià)診斷血清、O139群霍亂診斷血清以及稻葉、小川型診斷血清做玻片凝集試驗(yàn)；同時(shí)注意做鹽水凝集對(duì)照試驗(yàn)。2.要求(yoqi)及注意事項(xiàng):有的標(biāo)本可能同時(shí)存在非O1群霍亂弧菌，可疑菌落較多時(shí)，應(yīng)挑選5個(gè)以上的菌落逐個(gè)進(jìn)行玻片凝集(nngj)檢查;必要(byo)時(shí)，取原劃線菌苔邊緣透明部分再做玻片凝集(對(duì)一次流行的首批病人進(jìn)行檢驗(yàn)時(shí)尤應(yīng)注意)。 平皿分離未獲分散的單個(gè)菌落，而在密集部位仍有可疑

8、菌落時(shí)，應(yīng)將該部分再做分離或經(jīng)增菌后再做分離;從恢復(fù)期病人分離出菌落典型但不凝集的弧菌，這時(shí)應(yīng)以霍亂粗糙型血清做玻片凝集，以確定是否為粗糙型或NAG弧菌；注意當(dāng)霍亂弧菌在4號(hào)及慶大霉素培養(yǎng)基上生長(zhǎng)過(guò)久(超過(guò)36小時(shí))時(shí)，會(huì)出現(xiàn)菌落粘稠、血清凝集假陰性現(xiàn)象； 故應(yīng)取新鮮培養(yǎng)物(1014h)作凝集試驗(yàn)，凝集的菌落立即轉(zhuǎn)種營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板。小川型菌株有時(shí)在稻葉型單價(jià)血清中可出現(xiàn)弱凝集，這并非彥島型，而是小川型含有少量C抗原成分的緣故；首例病人應(yīng)以兩個(gè)單價(jià)血清的試管凝集試驗(yàn)確定。六、初步鑒定試驗(yàn)：1.氧化酶試驗(yàn)：在非選擇性或非鑒別性培養(yǎng)基如營(yíng)養(yǎng)瓊脂的新鮮培養(yǎng)物上滴加氧化酶試劑1滴，并使其流開(kāi)。或?qū)⒕溆弥?/p>

9、簽或牙簽挑至滴有試劑的濾紙上，在1分鐘內(nèi)出現(xiàn)粉紅紫紅紫藍(lán)色（有的最后呈黑紫色）為氧化酶陽(yáng)性。（腸桿菌科細(xì)菌多不變色或變成粉紅色后很快退色(tu shi)為氧化酶陰性）。氧化酶試驗(yàn)(shyn)注意事項(xiàng)： 試驗(yàn)時(shí)避開(kāi)(b ki)含鐵物質(zhì)（如接種環(huán)）。不能直接取產(chǎn)酸培養(yǎng)基上的菌落，不能取含還原劑的培基及含亞碲酸鹽培基上的菌落(亞碲酸鹽培養(yǎng)基可抑制氧化酶)，以免出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性。2.拉絲試驗(yàn)：在玻片上加一滴試劑，取一接種環(huán)被檢菌的新鮮瓊脂培養(yǎng)物在試劑旁邊研磨均勻，再與試劑混合制成濃厚懸液。陽(yáng)性者很快(30S內(nèi))由混變清并變得很粘稠，用接種環(huán)挑取時(shí)，可以拉出細(xì)絲來(lái)。 陰性者呈均勻懸液狀態(tài)，與蒸餾水對(duì)照

10、相同。（古典型、埃爾托型和O139群霍亂弧菌均陽(yáng)性。）弧菌科菌屬氧化酶試驗(yàn)、拉絲試驗(yàn)鑒別表弧菌科氧化酶試驗(yàn)拉絲試驗(yàn)弧 菌 屬(目前發(fā)現(xiàn)具 致病性弧菌)O1群霍亂弧菌O139霍亂弧菌NAG弧菌河弧菌霍利斯弧菌少女魚(yú)弧菌 (80%)弗尼斯弧菌副溶血弧菌 (64%)溶藻弧菌 (91%)擬態(tài)弧菌麥?zhǔn)匣【鷦?chuàng)傷弧菌辛辛那提弧菌氣單胞菌屬氣單胞菌 (90%)鄰單胞菌屬類志賀鄰單胞菌3.O/129(二氨基(nj)二異丙基喋啶)敏感試驗(yàn)：用接種環(huán)或滅菌棉拭子在含0.5氯化鈉的普通(ptng)平皿上均勻涂抹待檢菌，放上10g、150gO/129磷酸鹽藥敏紙片各一片(y pin)，37培養(yǎng)過(guò)夜。凡藥敏紙片周圍出現(xiàn)抑

11、菌圈者為敏感。古典型、埃爾托型霍亂弧菌二者均敏感；O139群霍亂弧菌10g、150g均不敏感。七、初步結(jié)果報(bào)告：霍亂弧菌以血清學(xué)鑒定為主，結(jié)合菌落形態(tài)、特征和初步生化反應(yīng)可做出判定。凡具備弧菌菌落特征、與O1群或O139群多價(jià)血清凝集，O1群并可用單價(jià)血清分型即可判定。首例病人應(yīng)輔以氧化酶、拉絲試驗(yàn)、O/129敏感試驗(yàn)?；鶎覥DC至此即可上報(bào)。上報(bào)國(guó)家需做生化、噬菌體-生物分型試驗(yàn)。報(bào)告名稱“稻葉/小川型O1群埃爾托型霍亂弧菌”或“O139群埃爾托型霍亂弧菌”。八、 生化鑒定(jindng)試驗(yàn)：試驗(yàn)項(xiàng)目O1群O139群NAG試驗(yàn)項(xiàng)目O1群O139群NAG氧化酶+甘露糖+/-粘絲+阿拉伯糖-O

12、/129敏感(10g)+-肌醇 -O/129敏感(150g)+-賴氨酸脫羧酶+動(dòng)力+鳥(niǎo)氨酸脫羧酶+靛基質(zhì)+精氨酸雙解酶-V-P+/-+/-0鹽胨水+甲基紅+-/+3鹽胨水+硝酸鹽還原+6鹽胨水+/-+/-+/-葡萄糖產(chǎn)酸+8鹽胨水-葡萄糖產(chǎn)氣-10鹽胨水-蔗糖+/-山梨醇-+九、噬菌體-生物(shngw)分型：1. 古典型和Eltor分型：目前仍依靠第IV組霍亂噬菌體常規(guī)稀釋液(106/毫升)裂解試驗(yàn)、多粘菌素B敏感試驗(yàn)、雞血球凝集、V-P和溶血試驗(yàn)進(jìn)行兩種生物(shngw)型的鑒別僅作參考。埃爾托型已出現(xiàn)大量非溶血菌株，因此溶血試驗(yàn)已不能作為區(qū)別兩個(gè)生物型的主要方法。O1群霍亂弧菌古典型和E

13、l-Tor生物型的鑒別鑒 別 試 驗(yàn)O1群霍亂弧菌生物型古典型埃爾托型1.第IV組VC噬菌體(106/ml)()2.多粘菌素B敏感()3.雞血球凝集()()4.V-P()5.溶血/注：括弧內(nèi)為少數(shù)菌株結(jié)果。鑒 別 試 驗(yàn)O1群霍亂弧菌生物型古典型埃爾托型1.第IV組VC噬菌體(106/ml)()2.多粘菌素B敏感()3.雞血球凝集()()4.V-P()5.溶血/注：括弧內(nèi)為少數(shù)菌株結(jié)果。(1)噬菌體分型：根據(jù)五株國(guó)內(nèi)分離(fnl)的5種弧菌噬菌體 (VP1VP5)將埃爾托型霍亂弧菌分成32個(gè)噬菌體型 (見(jiàn)下表)。方法：利用雙層瓊脂(qingzh)平皿法進(jìn)行噬菌體滴皿裂解試驗(yàn)。噬菌體型對(duì)分型噬菌

14、體的敏感性噬菌體型對(duì)分型噬菌體的敏感性VP1VP2VP3VP4VP5VP1VP2VP3VP4VP51172183194205216227238249251026112712281329143015311632(2)生物(shngw)分型： 根據(jù)菌株的溶原性、對(duì)溶原噬菌體的敏感性、山梨醇發(fā)酵試驗(yàn)和溶血試驗(yàn)等四個(gè)生物學(xué)性狀，將埃爾托弧菌分成(fn chn)12個(gè)生物型 。埃爾托霍亂(hulun)生物分型表生物型生 物 學(xué) 性 狀溶原性對(duì)溶源噬菌體敏感性山梨醇快速發(fā)酵溶血試驗(yàn)abcdefghijkl埃爾托霍亂弧菌噬菌體-生物(shngw)分型表噬 菌體 型生 物 型abcdefghijkl12345

15、67十、O1群與O139群霍亂弧菌的鑒別(jinbi)：鑒 別 試 驗(yàn)O1群霍亂弧菌O139群霍亂弧菌1.血清凝集O1群多價(jià)O139群2.O/129敏感10g150g3.第IV組VC噬菌體原液4.甲基紅5.菌體莢膜十一、霍亂菌種的登記(dngj)、保存、上送和管理: 1.霍亂菌株的登記(dngj)： 基層實(shí)驗(yàn)室所檢獲的陽(yáng)性菌種及可疑菌種，均應(yīng)作好菌株來(lái)源詳細(xì)情況的登記工作,包括編號(hào)、被檢人或物名稱(mngchng)、菌株來(lái)源(病人、帶菌者或外環(huán)境)、分離地點(diǎn)(地址)及初步鑒定結(jié)果(見(jiàn)省CDC “河南省霍亂監(jiān)測(cè)方案”附表),一式兩份,一份自己保存,一份隨菌種上送。2.霍亂種株的保存： 對(duì)初步鑒定

16、的霍亂弧菌及可疑菌株(包括不凝集弧菌)，均應(yīng)接種半固體菌種管培養(yǎng)基，經(jīng)37過(guò)夜培養(yǎng)，用膠塞或石蠟封口，室溫保存，切勿放入冰箱，因霍亂菌種半固體的最佳保存環(huán)境是1825(一般可存活45年)。 霍亂弧菌在4 8以下(yxi)極易死亡。 3.霍亂(hulun)種株的上送：菌、毒種的上送工作(gngzu)是程序，也是制度。按照中華人民共和國(guó)傳染病防治法、衛(wèi)生部規(guī)定：各疫點(diǎn)市(縣)在本年度疫情結(jié)束后必須立即收集整理當(dāng)?shù)胤蛛x到的所有霍亂菌株和可疑菌株，認(rèn)真登記、造冊(cè)，連同菌種一并派專人(2人)護(hù)送上級(jí)市(地)CDC；市(地)防疫站收集、整理所轄市、縣上送菌種后，再屆時(shí)按毒菌種管理規(guī)定上送省CDC，最后由省

17、CDC統(tǒng)一進(jìn)行編號(hào)、登記、整理備案，并進(jìn)行血清學(xué)、生化學(xué)及噬菌體-生物分型鑒定、藥物敏感性測(cè)定后上報(bào)國(guó)家CDC和衛(wèi)生部。 4.霍亂種株的管理：相關(guān)法規(guī)：中華人民共和國(guó)傳染病防治法實(shí)施辦法和衛(wèi)生部菌種管理委員會(huì)制定的中國(guó)醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理辦法。菌（毒）種的保藏由國(guó)務(wù)院衛(wèi)生行政部門指定的單位負(fù)責(zé)。一、二類菌(毒)種的供應(yīng)由國(guó)務(wù)院衛(wèi)生行政部門指定的保藏管理單位供應(yīng)。三類菌(毒)種由設(shè)有專業(yè)實(shí)驗(yàn)室的單位或者國(guó)務(wù)院衛(wèi)生行政部門指定的保藏管理單位供應(yīng)。認(rèn)真做好登記(dngj)，統(tǒng)一編號(hào)，凍干保存，按期傳代、鑒定，并作好有關(guān)檢驗(yàn)記錄。在保存過(guò)程中發(fā)生菌、毒種變異或死亡，應(yīng)及時(shí)上報(bào)科主任及主管部門。當(dāng)?shù)厮?/p>

18、檢出的地方菌、毒株應(yīng)及時(shí)(jsh)上報(bào)，因工作需要暫時(shí)保留的菌、毒株也應(yīng)按上級(jí)規(guī)定的時(shí)間進(jìn)行銷毀處理。新發(fā)現(xiàn)的菌、毒種，要做好原始記錄，一并上報(bào)主管部門復(fù)核(fh)確認(rèn)。使用一類菌(毒)種的單位，必須經(jīng)國(guó)務(wù)院衛(wèi)生行政部門批準(zhǔn)；使用二類菌(毒)種的單位必須經(jīng)省級(jí)政府衛(wèi)生行政部門批準(zhǔn)；使用三類菌(毒)種的單位，應(yīng)當(dāng)經(jīng)縣級(jí)政府衛(wèi)生行政部門批準(zhǔn)。一、二類菌(毒)種，應(yīng)派專人向供應(yīng)單位領(lǐng)取，不得郵寄；三類菌(毒)種的郵寄必須持有郵寄單位的證明，并按照菌(毒)種郵寄與包裝的有關(guān)規(guī)定辦理。 未經(jīng)上級(jí)主管部門批準(zhǔn)，任何單位及個(gè)人不得以工作之便，進(jìn)行國(guó)際間各類菌、毒種交流。做好菌、毒種生物安全防范工作。傳染病的

19、菌(毒)種分為下列3類一類：鼠疫耶爾森氏菌、霍亂弧菌；天花病毒、艾滋病病毒(4種)；二類(r li)：布氏菌、炭疽菌、麻風(fēng)桿菌；肝炎病毒、狂犬病毒、出血熱病毒、登革熱病毒；斑疹傷寒立克次體SARS病毒(9種)；三類：腦膜炎雙球菌、鏈球菌、淋病雙球菌、結(jié)核桿菌、百日咳嗜血桿菌、白喉(bihu)棒狀桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌、破傷風(fēng)梭狀桿菌；鉤端螺旋體、梅毒螺旋體；乙型腦炎病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、流感病毒、流行性腮腺炎病毒、麻疹病毒、風(fēng)疹病毒(17種)。 國(guó)務(wù)院衛(wèi)生行政部門可以根據(jù)情況增加(zngji)或者減少菌(毒)種的種類。十二、確診報(bào)告: 至此霍亂弧菌整個(gè)的鑒定程序(血清學(xué)、生化學(xué)、噬菌體-生物

20、分型、藥敏)全部完成，該由省疾病預(yù)防控制中心向國(guó)家衛(wèi)生部、CDC報(bào)告鑒定結(jié)果。國(guó)家規(guī)定首例霍亂病人的病原菌必須立即做到確診報(bào)告。以后續(xù)發(fā)病例則可以先做到初步診斷，至疫情結(jié)束后再進(jìn)行噬菌體-生物分型、藥敏等試驗(yàn)。最終確定報(bào)告霍亂名稱應(yīng)為： 例1：O1群埃爾托型霍亂弧菌小川型1b。 例2：O139群埃爾托型霍亂弧菌。分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用：(一)PCR/MPCR毒力基因(jyn)檢測(cè)； (二)染色體DNA提取(tq)；染色體DNA限制性內(nèi)切酶酶切圖 譜制備；(三)核酸(h sun)分子CT、16srRNA分子雜交；(四)脈沖場(chǎng)電泳(PFGE)分子分型；(五)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA片段(RAPD)、重復(fù)基因組回復(fù)序列(Rep-PCR)、腸桿菌基因間重復(fù)一致序列(ERIC)、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP) PCR分子指紋分析技術(shù)及擴(kuò)增DNA測(cè)序等。(一) PCR/MPCR診斷技術(shù)： 根據(jù)霍亂毒素亞單位毒力基因(ctxA)、古典生物型霍亂毒素協(xié)同調(diào)節(jié)菌毛A基因(C-TCPA)和El-Tor生物型霍亂弧菌不同的TCPA基因編碼序列(E-TCPA)，采用PCR/MPCR(多重P