水蛭素提取工藝

1、原創(chuàng)水蛭素提取工藝2014分離工程方向課程設(shè)計題目水蛭素水蛭素(hirudin)是水蛭(Leech)及其唾液腺中已提取出多種活性成分中活性最 顯著并且研究得最多的一種成分，它是由65-66個氨基酸組成的小分子蛋白質(zhì)(多 肽)。水蛭素對凝血酶有極強的抑制作用，是迄今為止所發(fā)現(xiàn)最強的凝血酶天然特 異抑制劑。概述水蛭素(hirudin)是水蛭(Leech)及其唾液腺中已提取出多種活性成分中活性最 顯著并且研究得最多的一種成分，它是由65-66個氨基酸組成的小分子蛋白質(zhì)(多 肽)。水蛭素對凝血酶有極強的抑制作用，是迄今為止所發(fā)現(xiàn)最強的凝血酶天然特 異抑制劑。作用動物試驗與臨床研究表明，水蛭素能高效抗凝

2、血、抗血栓形成，以及阻止凝血 酶催化的凝血因子活化和血小板反應(yīng)等進一步血瘀現(xiàn)象。此外，它還能抑制凝血酶 誘導(dǎo)的成纖維細胞的增殖和凝血酶對內(nèi)皮細胞的刺激。與肝素相比，它不僅用量 少，不會引起出血，也不依賴于內(nèi)源性輔助因子;而肝素則有引起出血的危險，在 彌漫性血管內(nèi)凝血的發(fā)病過程中抗凝血酶III往往減少，這將限制肝素的療效，采 用水蛭會有較好的效果。應(yīng)用水蛭素是一類很有前途的抗凝化瘀藥物，它可用于治療各種血栓疾病，尤其是 靜脈血栓和彌漫性血管凝血的治療;也可用于外科手術(shù)后預(yù)防動脈血栓的形成，預(yù) 防溶解血栓后或血管再造后血栓的形成;改善體外血液循環(huán)和血液透析過程。在顯 微外科手術(shù)中常因為吻合處血管栓

3、塞而導(dǎo)致失敗，采用水蛭素可促進傷口愈合。研 究還表明，水蛭素在腫瘤治療中也能發(fā)揮作用。它能阻止腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移，已證明 有療效的腫瘤如纖維肉瘤，骨肉瘤，血管肉瘤，黑素瘤和白血病等。水蛭素還可配合化學(xué)治療和放射治療，由于促進腫瘤中的 血流而增強療效。動物試驗和臨床研究表明，靜脈或皮下注射水蛭素均無明顯毒副作用，無論急 性、亞急性的毒性試驗，對血壓、心率、血相、出血時間和血液化學(xué)成分均不受影 響，呼吸系統(tǒng)也沒有影響，無過敏反應(yīng)，一般無特異抗體發(fā)現(xiàn)。半致死劑量 LD5050mgAg，遠大于治療所用的劑量（1mgAg）。尤其值得指出的是，水蛭素可以口 服，這給用藥帶來很大方便。水蛭素比較穩(wěn)定，胰蛋白酶和

4、糜蛋白酶并不破壞其活 性，而且水蛭素的某些水解片段仍有抑制凝血酶的作用，這就可以解釋為何口服中藥水蛭提取液仍然有療效的原理。近年來在我國以水蛭素為主要成分的中成藥已有許多種，如抗血栓片、活血通 膠囊等，其年產(chǎn)值達數(shù)千萬元。含水蛭的新藥也在不斷研究和推出。利用基因工程 生產(chǎn)重組水蛭類多肽藥物，以取代水蛭素或作為抗凝化瘀藥的添加成分，這在近期 內(nèi)就可實現(xiàn)。作為注射劑用于心血管系統(tǒng)疾病和腫瘤治療藥物，則還需要進一步的 臨床研究。毋庸置疑，重組水蛭素類多肽藥物的開發(fā)將會帶來巨大的社會效益和經(jīng) 濟效益。重組由于水蛭素具有重要開發(fā)價值，而水蛭的來源有限，故國內(nèi)外醫(yī)藥界均著重研 究通過基因工程獲得重組水蛭素

5、。1986年后，重組水蛭素已在大腸桿菌和酶母中 分別表達成功，與天然水蛭素相比，重組水蛭素在第63位氨基酸（酪氨酸）上未硫 酸酪化，活性略低，其余性質(zhì)基本相同。在治療的劑量下靜脈注射無毒副反應(yīng)?，F(xiàn) 國外一些大的生物技術(shù)公司對水蛭素己進入多方面的臨床研究。有關(guān)水蛭素類多肽 的專利，每年公布的數(shù)量至少在十多項以上，包括水蛭素類似的多肽，研究論文每年總在數(shù)十篇以上。1998年底重組水蛭素藥物在德國正式上市，1999年英國批準 上市，己注冊的國家有美國、歐洲、澳大利亞、新西蘭、南非等I0多個國家。水蛭素在使用過程中血清半衰期太短，難以發(fā)揮抗栓效果。美國一研究機構(gòu)將 水蛭素與PEG 一起加工成為耦合體制

6、劑后可大大延長水蛭素的血清半衰期從而提高 其在體內(nèi)的抗血栓生成效果。研究我們對重組水蛭素基因工程作了大量系統(tǒng)的研究，具有堅實的技術(shù)基礎(chǔ)。我們 從國內(nèi)養(yǎng)殖的醫(yī)用水蛭中克隆出水蛭素的cDNA進行測序，并合成了大腸桿菌偏愛 密碼子的水蛭素基因，構(gòu)建了分泌型大腸桿菌表達載體，優(yōu)化表達條件，獲得高效 表達，產(chǎn)物直接分泌至跑外，大大簡化了下游工程。我們根據(jù)水蛭素的特性，設(shè)計 了適合大規(guī)模生產(chǎn)的低成本的分離純化新工藝，無需高效液相層析或反相層析，只 經(jīng)三步純化，即獲得電泳純的產(chǎn)品。目前我們得到水蛭素的表達量、純度和得率均 達到國際先進水平。前景心血管系統(tǒng)疾病和腫瘤是主要危害人類健康的兩大類病害，防治這兩大類

7、疾病 的藥物是新藥研制的重點。水蛭在破血、逐瘀、通經(jīng)、消癥等方面的療效已為我國 數(shù)千年中醫(yī)實踐所證明，重組水蛭素在抗凝消栓以及配合腫瘤化療和放療上的作用 也為國外臨床所證明。注射針劑的要求較高，目前在臨床主要用于抗深靜脈血栓。 而作為口服藥劑在短期內(nèi)即可取得經(jīng)濟和社會效益。將重組水蛭素類多肽藥物取代 水蛭或作為中成藥的添加成分，估計至少可獲得上億元的經(jīng)濟效益。隨著臨床試驗 的擴大，它將可以用于更多的疾病的防治，發(fā)展前景十分廣闊。比較表達水平，純化工藝，產(chǎn)品質(zhì)量與國外水平相當(dāng)，某些技術(shù)指標超過國外，成 本比國外低。在美國，藥用重組水蛭素每毫克6美元。我國生產(chǎn)的成本低，如果每毫克降至 人民幣6元，

8、廣大患者就有可能承受得起。國外重組水蛭素都采用針劑，我們正在 研制口服劑型，口服無疑更易被病人接受，成本也可更多降低。尤其是它可以拓寬 使用的范圍，用于各種血栓病的防治，或作為有關(guān)藥物的主要成分或添加成分，可 開發(fā)更大的市場。分析在醫(yī)藥市場上，抗栓藥物的需求與日俱增，但由于天然水蛭來源有限，各國醫(yī) 藥界都將注意力集中在重組水蛭素的開發(fā)上。美國、法國、瑞士、德國、英國、日 本十多家生物技術(shù)公司和醫(yī)院都在臨床應(yīng)用或研究重組水蛭素類多肽抗栓藥物治療血栓疾病的范圍和 療效。1998年底，德國首先上市重組水蛭素藥物。1999年英國也獲批準上市。目 前己注冊的國家有歐洲、美國、澳大利亞、新西蘭、南非等十多

9、個國家。中國具 有心血管疾病藥物和腫瘤藥物的巨大市場，水蛭素又是傳統(tǒng)中藥，因此重組水蛭素 開發(fā)前景十分看好。據(jù)估計，我國目前血栓病人約有2000萬人，如果其中l(wèi)00萬人采用水蛭素治 療，每年共需300500公斤。國際上常用肝素作為抗凝藥物，這類抗凝藥物的使用已有60多年歷史，需用 量逐年增加。美國70年代每年就有1000萬病人使用肝素，大部分是手術(shù)后預(yù)防血 栓的形成。僅美國肝素的年用量就超過9000億單位，約相當(dāng)于6噸。研究表明， 水蛭素在許多性能上都優(yōu)于肝素，它用藥量小，不引起出血，也不依賴于內(nèi)源性輔 助因子。隨著臨床研究的廣泛開展，重組水蛭素的應(yīng)用范圍不斷拓寬，它的需求 也會日益增大。優(yōu)點

10、第一，水蛭素與水蛭肽抑制凝血酶的反應(yīng)不需要抗凝血酶？(AT?)作為輔助因子，使其抗凝作用與量效關(guān)系更吻合，而且可在缺乏抗凝血酶?的病人(如彌漫性血 管內(nèi)凝血)中使用。第二，肝素不能滅活結(jié)和于血栓上的凝血酶。而水蛭素與水蛭肽則對循環(huán)中的 和結(jié)合于血栓上的凝血酶都可以抑制。第三，肝素會被激活的血小板釋放的血小板因子4(PTF4)或富含組氨基酸的糖 蛋白等結(jié)合，水蛭素與水蛭肽則不受這些因素的影響。第四，水蛭素與水蛭肽用于抗血栓治療，出血副作用較小，且無過敏反應(yīng)和免 疫原性無毒反應(yīng)。原理天然水蛭素是由65或66個氨基酸殘基組成的單鏈多肽，分子量約為7 000,能 在極端的pH和熱條件下穩(wěn)定存在。水蛭素

11、的形狀類似蝌蚪，蝌蚪頭部是多肽的N端, 富含半胱氨酸(cys),半胱氨酸間相互作用形成3個二硫鍵(Cys6-Cys14,Cys16-Cys28,Cys22-Cys39)。使N末端結(jié)構(gòu)緊密;蝌蚪尾部是含有多個酸性氨基酸和一個被磺酸化的酪 氨酸(Tyr63)的多肽C末端。凝血酶(thrombin)是血液凝固和止血過程中的中心酶， 它不但能剪切纖維蛋白原，將纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白；還能激活其它的凝固血液 的酶類，如凝血因子？、？、？?和抗凝血酶蛋白C(Fenton,1981)等。凝血酶與大分子 底物的相互作用取決于三個不同的區(qū)域:催化反應(yīng)位點的初級結(jié)合位 C(Magnusen,1971),鄰近催化

12、位點的非極性結(jié)合位點AB(Brlinr and Shen,1977;Sonder and Fenton,1984)和負責(zé)凝血酶與纖維蛋白原專一性作用的陰 離子結(jié)合位點(識別位點)R(Fenton et al.1989;Henriksen and Mann,1988)。水蛭 素的N端能封阻凝血酶的活性位點，其疏水結(jié)構(gòu)域與凝血酶的非極性結(jié)合位點(AB) 互補，該非極性結(jié)合位點靠近凝血酶的催化中心。水蛭素C末端有6個酸性氨酸，能 與帶正電的凝血酶識別位點形成許多離子鍵。N端、C端兩個功能域以協(xié)同的方式 結(jié)合到凝血酶上,在凝血酶的活性部位形成一個帽子，阻止底物的結(jié)合。為了更好地了解水蛭素結(jié)構(gòu)對性能的影響，人們對于水蛭素的N端、C端和各位 點做了大量研究，得出許多結(jié)論，為水蛭肽的設(shè)計打了堅實的理論基礎(chǔ)。各種研究表 明水蛭素C末端的10個氨基酸是必需的最小結(jié)構(gòu),C末端的最佳大小至少是12個 氨基酸(Hir54-65)，在這一序列中每個氨基酸都非常重要。幾個疏水殘基和酸性殘 基對于維持水蛭素C末端的功能非常重要。區(qū)別1.水蛭素，主要是從吸血水蛭的唾液中分離提純出來，具有抗凝，抗血栓功效 的多肽物質(zhì)，臨床常用于多重血栓性疾病的治療，可以消除血管阻塞，使血細胞解聚, 血栓消散，促進微血管復(fù)通，改善微循環(huán)