細(xì)胞融合方法應(yīng)用課件

1、 細(xì)胞融合 1 第一節(jié) 細(xì)胞融合概述2一、細(xì)胞融合的定義細(xì)胞融合(cell fusion)就是指在外力（誘導(dǎo)劑或促融劑）作用下，兩個或兩個以上的異源（種、屬間）細(xì)胞或原生質(zhì)體相互接觸，從而發(fā)生膜融合、胞質(zhì)融合和核融合，并形成雜種細(xì)胞的現(xiàn)象，也稱細(xì)胞雜交（cell hybridization）。3細(xì)胞融合技術(shù)作為細(xì)胞工程的核心基礎(chǔ)技術(shù)之一，已在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、環(huán)保等領(lǐng)域取得了開創(chuàng)性的研究成果，而且應(yīng)用領(lǐng)域不斷擴(kuò)大。細(xì)胞融合技術(shù)不僅為核質(zhì)關(guān)系、基因調(diào)控、遺傳互補(bǔ)、細(xì)胞免疫學(xué)、腫瘤發(fā)生、基因定位、衰老控制等理論領(lǐng)域的研究提供了有力的手段，而且被廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)、遺傳學(xué)、發(fā)生生物學(xué)，特別是在單克隆抗體及動

2、植物遠(yuǎn)緣雜交育種等方面具有十分重要的意義。4二、細(xì)胞融合的研究進(jìn)展Muller于1838年觀察到脊椎動的腫瘤細(xì)胞能在體內(nèi)自發(fā)地融合產(chǎn)生多核的腫瘤細(xì)胞。Virchow于1858年描述了正常組織、發(fā)炎組織以及腫瘤組織中的多核細(xì)胞現(xiàn)象。Luginbuhl于1873年觀察到天花病人的血液中也有多核的血細(xì)胞存在。Lange于1875年第一個觀察到脊椎動物（蛙類）的血液細(xì)胞發(fā)生融合的過程。Cienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在無脊椎動物中發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞合并現(xiàn)象。1958年日本學(xué)者岡田善雄（Okada）發(fā)現(xiàn)仙臺病毒具有觸發(fā)動物細(xì)胞融合的效應(yīng)。1974年華裔加拿大學(xué)者高

3、國楠創(chuàng)立了聚乙二醇（PEG）化學(xué)融合法。1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞而產(chǎn)生能分泌預(yù)定單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。20世紀(jì)80年代出現(xiàn)了電融合技術(shù)。5三、細(xì)胞融合的意義理論上說，任何細(xì)胞都有可能通過體細(xì)胞雜交而成為新的生物資源，這對于種質(zhì)資源的開發(fā)和利用具有深遠(yuǎn)的意義。細(xì)胞能不受種屬的局限可實(shí)現(xiàn)種間生物體細(xì)胞的融合，使遠(yuǎn)源雜交成為可能，因而是改造細(xì)胞遺傳物質(zhì)的有力手段。這種手段打破了僅僅依賴有性雜交重組基因創(chuàng)造新種的界限，擴(kuò)大了遺傳物質(zhì)重組的范圍。體細(xì)胞雜交產(chǎn)生的雜種細(xì)胞含有來自雙親的核外遺傳系統(tǒng)，在雜種的分裂和增殖過程中雙親的葉綠體、線粒體DNA

4、亦可發(fā)生重組，從而產(chǎn)生新的核外遺傳系統(tǒng)。6 第二節(jié) 細(xì)胞融合常用的方法7按促融劑的不同分為生物法化學(xué)法物理法8一、生物法1958年日本學(xué)者岡田善雄首先觀察到血凝性病毒（HVJ）可引起小白鼠腹腔中的艾氏腹水瘤細(xì)胞（ETC）的融合。岡田善雄的研究為人工誘導(dǎo)體細(xì)胞雜交奠定了方法學(xué)基礎(chǔ)，這使得病毒類成為研究最早的促融劑。9一些致癌病毒雖然能夠誘導(dǎo)細(xì)胞融合，但由于具有毒性大等潛在的危險(xiǎn)性而在應(yīng)用上收到很大的限制，由此科研人員試圖嘗試使用滅活的病毒來作為促融劑。1965年，英國Harris等成功的運(yùn)用滅活的病毒作為促融劑誘導(dǎo)細(xì)胞融合，并且產(chǎn)生的雜交細(xì)胞可以存活。10仙臺病毒（HVJ）誘導(dǎo)法仙臺病毒誘導(dǎo)細(xì)胞

5、融合經(jīng)四個階段：兩種細(xì)胞在一起培養(yǎng)，加入病毒，在4條件下病毒附著在細(xì)胞膜上，并使兩細(xì)胞相互凝聚；在37中，病毒與細(xì)胞膜發(fā)生反應(yīng)，細(xì)胞膜受到破環(huán)，此時需要Ca2+和Mg2+，最適PH為8.0-8.2；細(xì)胞膜連接部穿通，周邊連接部修復(fù)，此時需Ca2+和ATP；融合成巨大細(xì)胞，仍需ATP 。11病毒促使細(xì)胞融合的主要步驟如下兩個原生質(zhì)體或細(xì)胞在病毒黏結(jié)作用下彼此靠近；通過病毒與原生質(zhì)體或細(xì)胞膜的作用使兩個細(xì)胞膜間互相滲透，胞質(zhì)互相滲透；兩個原生質(zhì)體或細(xì)胞的細(xì)胞核互相融合，兩個細(xì)胞融為一體；進(jìn)入正常的細(xì)胞分裂途徑，分裂成含有兩種染色體的雜種細(xì)胞。1213用滅活的病毒誘導(dǎo)的動物細(xì)胞融合過程示意圖 病毒法

6、的一些缺點(diǎn)利用滅活的病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合，存在著許多問題，如病毒制備困難、操作復(fù)雜、滅活病毒的效價差異大、實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性差、融合率很低等。目前，這種方法主要適用于動物細(xì)胞融合，用于實(shí)驗(yàn)室研究。14二、化學(xué)法鹽類融合法：此法是應(yīng)用最早的誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合的方法，對原生質(zhì)體的破壞小。高鈣和高PH值融合法：Keller首先發(fā)現(xiàn)高Ca2+和高pH值可以誘發(fā)融合。Melchers用此法將煙草種內(nèi)2個光敏感突變體誘導(dǎo)融合成功并獲得l00余株體細(xì)胞雜種。提高該方法的使用范圍是亟待解決的問題。15聚乙二醇（PEG）融合法：1974年華裔加拿大籍科學(xué)家高國楠(Kao)發(fā)現(xiàn)PEG可促進(jìn)不同科屬的植物原生質(zhì)體之間的融合當(dāng)加

7、入一定分子量的PEG時，融合效率較病毒誘導(dǎo)法提高1000倍以上。16聚乙二醇誘導(dǎo)法（PEG）聚乙二醇(PEG)結(jié)構(gòu)為：HOH2C（CH20CH2）nCH2OH，分子量大于200小于6000者均可用作細(xì)胞融合劑。通常用分子量低于1000的PEG作融合劑最好，50%PEG溶液能產(chǎn)生最多雜交細(xì)胞。PEG誘導(dǎo)細(xì)胞融合的有效范圍50%55%。PEG溶液在pH 6.0時細(xì)胞融合率最高。17聚乙二醇誘導(dǎo)法（PEG）原理：高國楠（Kao）等認(rèn)為，由于PEG分子具有輕微的負(fù)極性，故可以與具有正極性的基團(tuán)水、蛋白質(zhì)和碳水化合物等形成氫鍵，從而在在質(zhì)膜之間形成分子橋，其結(jié)果是使細(xì)胞質(zhì)膜發(fā)生粘連進(jìn)而促使質(zhì)膜的融合；另

8、外，PEG能增加類脂膜的流動性，也使細(xì)胞的核、細(xì)胞器發(fā)生融合成為可能。 18聚乙二醇（PEG）誘導(dǎo)法的步驟將兩種不同親本細(xì)胞各取5l06個混勻；離心沉淀，吸去上清液；加1ml 50%PEG溶液，用吸管吹打，使之與細(xì)胞接觸1分鐘；加9ml 培養(yǎng)液，離心沉淀，吸去上清液；加5ml 培養(yǎng)液，分別接種5個直徑60mm平皿，每個平皿加培養(yǎng)液至 5ml，37的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；624小時后，換成選擇培養(yǎng)液篩選雜交細(xì)胞。1920聚乙二醇（PEG）誘導(dǎo)法的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：此法比病毒更易制備，活性穩(wěn)定，融合成本低，無需特殊設(shè)備，融合率較高；融合過程沒有種間、屬間、科間的特異性或?qū)Ｒ恍?。缺點(diǎn)：聚乙二醇誘導(dǎo)細(xì)胞融合的

9、有效濃度（50%55%）對細(xì)胞毒性很大，融合率較低及經(jīng)驗(yàn)性大等缺陷。21三、物理法電脈沖誘導(dǎo)細(xì)胞融合技術(shù)激光融合技術(shù)空間細(xì)胞融合技術(shù)離子束細(xì)胞融合技術(shù)非對稱細(xì)胞融合技術(shù)221、電脈沖誘導(dǎo)細(xì)胞融合技術(shù)電融合的原理：電融合法是在短時間強(qiáng)電場的作用下，細(xì)胞膜發(fā)生可逆性電擊穿，瞬時失去其高電阻和低通透特性，然后在數(shù)分鐘后恢復(fù)原狀，當(dāng)可逆電擊穿發(fā)生在2個相鄰細(xì)胞的接觸區(qū)時，即可誘導(dǎo)它們的膜相互融合，從而導(dǎo)致細(xì)胞融合。電融合法的優(yōu)點(diǎn)：融合率高、是PEG的100倍，重復(fù)性強(qiáng)、對細(xì)胞傷害??；裝置精巧，方法簡單、快速，可在顯微鏡下觀察觀察融合過程；免去PEG誘導(dǎo)后的洗滌過程、誘導(dǎo)過程可控性強(qiáng)。23電融合的基本步

10、驟細(xì)胞膜的接觸：當(dāng)原生質(zhì)體置于電導(dǎo)率很低的溶液中時，電場通電后，電流即通過原生質(zhì)體而不是通過溶液，其結(jié)果是原生質(zhì)體在電場作用下極化而產(chǎn)生偶極子，從而使原生質(zhì)體緊密接觸排列成串。膜的擊穿：原生質(zhì)體成串排列后，立即給予高頻直流脈沖就可以使原生質(zhì)膜擊穿，從而導(dǎo)致兩個緊密接觸的細(xì)胞融合在一起。24 電融合法示意圖252、激光誘導(dǎo)法利用激光的光鑷建立細(xì)胞間接觸激光微束可以對相鄰細(xì)胞的接觸區(qū)細(xì)胞進(jìn)行破壞，從而誘導(dǎo)許多細(xì)胞中所需的2個相鄰細(xì)胞融合。優(yōu)點(diǎn)：與前面幾種方法相比，最突出的優(yōu)點(diǎn)在于它的高度選擇性，可選擇任意2個細(xì)胞進(jìn)行融合，易于實(shí)現(xiàn)特異性細(xì)胞融合，作用于細(xì)胞的應(yīng)力小，定時、定位性強(qiáng)，損傷小，參數(shù)易于

11、控制，操作方便，可利用監(jiān)控器清晰地觀察整個融合過程，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好，無菌，無毒。缺點(diǎn)：此法只能逐一處理細(xì)胞，不能像其他方法一樣同時處理大量細(xì)胞。263、空間細(xì)胞融合技術(shù)背景：由于地球引力的存在，有液泡的原生質(zhì)體與無液泡的原生質(zhì)體的密度差加大，異源細(xì)胞間的融合得率十分有限。在利用動物細(xì)胞融合生產(chǎn)單克隆抗體過程中，由于無法排除地球引力的影響，要提高淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的融合得率相當(dāng)困難。在空間的微重力環(huán)境下，細(xì)胞融合得率明顯增加，主要是降低了重力沉淀影響。274、離子束細(xì)胞融合技術(shù)原理：在離子束與生物體相互作用中，粒子的植入、動量的傳遞和電荷交換可導(dǎo)致細(xì)胞表面被刻蝕，引起細(xì)胞膜透性和跨膜電場的改變。

12、據(jù)此原理，發(fā)展了離子束誘導(dǎo)細(xì)胞融合技術(shù)。由于用于輻照的離子束的參數(shù)除了能量可調(diào)外，離子種類、電荷、質(zhì)量皆可調(diào)，因此，離子束的可操縱性強(qiáng)，可以用微束對細(xì)胞進(jìn)行超微加工，有目的地切割染色體用于基因工程和細(xì)胞工程，通過消除部分染色體或染色體的某些片段達(dá)到細(xì)胞非對稱融合的目的。285、非對稱細(xì)胞融合技術(shù)非對稱細(xì)胞融合技術(shù)，是利用某種外界因素(常為射線，即融合)輻照某一細(xì)胞原生質(zhì)體，選擇性地破壞其細(xì)胞核，并用碘乙酰胺堿性蕊香紅6G處理在細(xì)胞核中含有優(yōu)良基因的第2種原生質(zhì)體，選擇性地使其細(xì)胞質(zhì)失活。然后融合來自這2個原生質(zhì)體品系的細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)所需胞質(zhì)和細(xì)胞核基因的優(yōu)化組合?；蛘呤骨罢弑淮蛩榈募?xì)胞核染色體

13、片段中的個別基因滲入到后者原生質(zhì)體的染色體內(nèi)，實(shí)現(xiàn)有限基因的轉(zhuǎn)移，從而在保留親本之一全部優(yōu)良性狀的同時改良其某個不良性狀。29 第三節(jié) 細(xì)胞融合技術(shù)的應(yīng)用30一、微生物細(xì)胞融合技術(shù)的應(yīng)用微生物細(xì)胞融合技術(shù)一方面用于生物藥品的生產(chǎn)，包括抗生素、生物活性物質(zhì)、疫苗等；另一方面為發(fā)酵工業(yè)提供優(yōu)良菌種，如釀酒酵母和糖化酵母的種間雜交，分離子后代中個別菌株具有糖化和發(fā)酵的雙重能力。31二、植物細(xì)胞融合技術(shù)的應(yīng)用基礎(chǔ)理論研究培育抗性植株培育新型植株應(yīng)用于種質(zhì)保存和有用物質(zhì)生產(chǎn)321、培育抗性植株Shelley用馬鈴薯二倍體作親本經(jīng)過體細(xì)胞雜交得到抗科羅拉多馬鈴薯甲蟲的四倍體體細(xì)胞雜種；Bastia等對耐霜

14、凍的野生種和栽培種進(jìn)行體細(xì)胞雜交，獲得的所有體細(xì)胞雜種都比栽培種親本耐霜凍，其中有3株比野生種親本的耐性還高。332、培育新型植株343、應(yīng)用于種質(zhì)保存和有用物質(zhì)生產(chǎn)目前可將各種細(xì)胞器、DNA、質(zhì)粒、病毒、細(xì)菌等外源遺傳物質(zhì)引入原生質(zhì)體，從而有可能引起細(xì)胞遺傳性的改變，為某些珍稀植物的快速繁殖、植物的復(fù)壯提供可行的方法，還可應(yīng)用于種質(zhì)保存、無性系的快速繁殖和有用物質(zhì)生產(chǎn)。35三、動物細(xì)胞融合的應(yīng)用用于研究細(xì)胞的核質(zhì)關(guān)系用于解釋疾病的發(fā)生機(jī)制用于基因定位研究用于衰老機(jī)制的研究用于生產(chǎn)單克隆抗體動物細(xì)胞融合用于動物育種361、用于研究細(xì)胞的核質(zhì)關(guān)系Prescott等1972年首先應(yīng)用離心術(shù)結(jié)合細(xì)胞

15、松弛素B分離哺乳類動物細(xì)胞的胞質(zhì)體獲得成功，為研究哺乳類細(xì)胞的核質(zhì)關(guān)系、細(xì)胞質(zhì)基因的轉(zhuǎn)移開創(chuàng)了新途徑。372、用于解釋疾病的發(fā)生機(jī)制細(xì)胞融合是一種揭示疾病機(jī)理的有效方法細(xì)胞融合技術(shù)與顯微技術(shù)相結(jié)合可以研究膜蛋白動力學(xué)以及這些膜蛋白之間的關(guān)系。Lattanzi等將細(xì)胞融合技術(shù)與免疫熒光、生化分析、電鏡技術(shù)相結(jié)合，對肌肉萎縮癥發(fā)生的機(jī)理進(jìn)行了研究并取得較大的進(jìn)展。383、用于基因定位研究雜種細(xì)胞中某一染色體或其片段的存在與細(xì)胞的某一性狀表達(dá)與否相聯(lián)系，從而可以實(shí)現(xiàn)把基因定位于某一染色體或某一區(qū)段上。1967年Weise等發(fā)現(xiàn)在人和鼠的融合細(xì)胞中，人的染色體優(yōu)先丟失，利用這一特點(diǎn)可以對人染色體上的基

16、因進(jìn)行定位。394、用于衰老機(jī)制的研究Tam等采用細(xì)胞融合的方法在干細(xì)胞研究中揭示了衰老的分子機(jī)制：衰老是一個可逆的過程，它決定于直接或間接控制端粒長度及端粒酶活性的生物分子之間的平衡作用，通過改變?nèi)旧|(zhì)的狀態(tài)進(jìn)而進(jìn)行表觀遺傳修飾調(diào)節(jié)基因表達(dá)。405、動物細(xì)胞融合用于動物育種動物體細(xì)胞融合后，雜種細(xì)胞一般難以發(fā)育再生為一個個體，但借助于細(xì)胞核移植的方法將融合后雜種細(xì)胞的細(xì)胞核移入去核成熟卵內(nèi)，可培育出新的雜種。416、用于生產(chǎn)單克隆抗體42什么叫單克隆抗體單克隆抗體(monoclonal antibody，簡稱McAb)：將能夠產(chǎn)生抗體的B淋巴細(xì)胞和具有無限增殖力的骨髓瘤細(xì)胞融合在一起，形成雜

17、交瘤細(xì)胞。雜交瘤細(xì)胞既能在體外快速生長，又能持續(xù)分泌成分單一的特異性抗體。這種單一類型的只針對某一特定抗原決定簇的抗體分子，就是單克隆抗體。4344單克隆抗體制備過程 注射抗原B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞細(xì)胞融合、篩選雜交瘤細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)篩選，繼續(xù)培養(yǎng)足夠數(shù)量的、能產(chǎn)生特定抗體的細(xì)胞群體外培養(yǎng)注射到小鼠腹腔單克隆抗體單克隆抗體45親本細(xì)胞的選擇骨髓瘤細(xì)胞：一般不分泌抗體，能在體外無限繁殖和連續(xù)繼代培養(yǎng)，且為HPRT-或TK-。多用BALB/C小鼠的骨髓瘤細(xì)胞。選擇次黃嘌呤鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶缺陷型（HPRT-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）46淋巴細(xì)胞：經(jīng)過免疫處理的淋巴細(xì)胞，多用大鼠或小鼠。免疫方法

18、：體內(nèi)法或體外法。體內(nèi)法：對細(xì)胞或微生物抗原可直接注射如小鼠體內(nèi)，可溶性蛋白抗原可與等量的福氏完全佐劑混合乳化后，注入到動物體內(nèi)。3-4天后，在無菌條件下可以取出脾或淋巴結(jié)制成懸液，存活率在95以上的可以用于融合。體外法：直接提取大、小鼠淋巴細(xì)胞，調(diào)整為107個/ml，加適當(dāng)濃度抗原，3-4天后，收集被刺激的淋巴細(xì)胞。47細(xì)胞融合將免疫脾細(xì)胞和小鼠骨髓細(xì)胞以2：1或10：1的比例混勻于50ml錐形離心管內(nèi)，1200rpm離心7-10分鐘，盡量吸凈上清液，用手指輕擊管壁，使管底沉淀的細(xì)胞鋪展成薄層。在室溫條件下邊輕輕振搖離心管邊在60秒鐘內(nèi)逐滴加入50%的PEG 0.5ml，隨后靜置90秒，再于5分鐘內(nèi)邊振搖邊逐滴加入5-10ml不含血清的培液或鹽水緩沖液，以終止PEG的作用，再靜置10分鐘。48HAT培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞細(xì)胞團(tuán)塊分散后，加HAT溶液，稀釋至骨髓瘤細(xì)胞不超過2105 個/ml，即可加入飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔塑料培養(yǎng)板內(nèi)每孔0.1ml，如是24孔板，每孔0.5ml；總量分別為0.2ml和1ml。用HAT選擇性培養(yǎng)時每隔2-3天半量換液，7天后可以選擇出雜交瘤細(xì)胞。49HAT選擇系統(tǒng)HAT是含一定濃度次黃嘌呤（H）、氨基喋呤（A）及胸腺嘧啶核苷（T）的一種選擇性培養(yǎng)基，其中三種成分與細(xì)胞DNA合成有關(guān)。DNA合成途徑有兩種。5