生物制藥抗體藥物課件

1、第四章 抗體制藥張忠山第一節(jié) 概述第二節(jié) 單克隆抗體及制備第三節(jié) 基因工程抗體及制備第四節(jié) 多功能抗體及制備第五節(jié) 抗體工程第六節(jié) 抗體診斷試劑第七節(jié) 抗體治療藥物第一節(jié) 概述1、免疫學(xué)發(fā)展經(jīng)歷 免疫學(xué)是一門既古老而又新興的科學(xué)。免疫學(xué)的發(fā)展是人們在實踐中不斷探索、不斷總結(jié)和不斷創(chuàng)新的結(jié)果。 一般認為免疫學(xué)的發(fā)展經(jīng)歷了四個時期即經(jīng)驗免疫學(xué)時期、經(jīng)典免疫學(xué)時期、近代免疫學(xué)時期和現(xiàn)代免疫學(xué)時期。 經(jīng)驗免疫學(xué)時期：早在公元 11 世紀，我國醫(yī)學(xué)家在實踐中創(chuàng)造性地發(fā)明了人痘苗，即用人工輕度感染的方法預(yù)防天花。在明代隆慶年間（朱載垕，15671572），人痘苗已在我國廣泛應(yīng)用。至17世紀，人痘苗接種預(yù)防

2、天花的方法引起鄰國的注意，先后傳入俄國、朝鮮、日本、土耳其、英國等地，進而使人痘苗預(yù)防天花的方法得以推廣和驗證。此即經(jīng)驗免疫學(xué)時期。它是人類認識機體免疫性的開端，為以后英國醫(yī)生Jenner（琴納）發(fā)明牛痘苗奠定了基礎(chǔ)。該時期發(fā)現(xiàn)了免疫現(xiàn)象，對醫(yī)學(xué)實為一項偉大貢獻。經(jīng)典免疫學(xué)時期：18世紀至20世紀中葉為經(jīng)典免疫學(xué)時期。這一時期，人們對免疫功能的認識由人體現(xiàn)象的觀察進入了科學(xué)實驗時期。在此期間取得的重要成果包括： （1）牛痘苗的發(fā)明：患過牛痘的擠奶工不再患?。?）減毒活疫苗的發(fā)明：19世紀末，法國免疫學(xué)家巴斯德（Pasteur）和德國細菌學(xué)家柯赫（Koch）在創(chuàng)立了細菌分離培養(yǎng)技術(shù)的基礎(chǔ)上，通過

3、系統(tǒng)地科學(xué)研究，利用物理、化學(xué)，以及生物學(xué)方法獲得了減毒菌苗，并用于疾病的預(yù)防和治療。Pasteur以高溫培養(yǎng)法制備了炭疽疫苗，用狂犬病毒在兔體內(nèi)經(jīng)連續(xù)傳代制備了狂犬病疫苗。這些減毒疫苗的發(fā)明不但為實驗免疫學(xué)打下了基礎(chǔ)，也為疫苗的發(fā)展開辟了新局面。 （3）抗體的發(fā)現(xiàn)：1890年德國學(xué)者Behring（貝苓）和日本學(xué)者北里用白喉外毒素免疫動物時發(fā)現(xiàn)，在被免疫的動物血清中有一種能中和外毒素的物質(zhì)，稱為抗毒素。將此免疫血清被動轉(zhuǎn)移給正常動物，使后者獲得了中和外毒素的能力。同年Behring又與北里將白喉抗毒素正式用于白喉的治療，開創(chuàng)了人工被動免疫療法之先河。為此，Behring于1901年獲得諾貝爾

4、醫(yī)學(xué)和生理學(xué)獎。后來，人們相繼發(fā)現(xiàn)了凝集素、沉淀素等能與細菌或細胞特異性反應(yīng)的物質(zhì)，統(tǒng)稱為抗體；而將能引起抗體產(chǎn)生的物質(zhì)稱為抗原，從而確立了抗原和抗體的概念。 免疫抗原；反應(yīng)抗原近代免疫學(xué)時期：生物體的免疫反應(yīng)性有了比較全面的認識，出現(xiàn)了全新的免疫學(xué)理論。包括遲發(fā)性超敏反應(yīng)、免疫耐受的發(fā)現(xiàn)、細胞系選擇學(xué)說的提出、免疫學(xué)技術(shù)的發(fā)展?，F(xiàn)代免疫學(xué)時期：在這一時期，確認了淋巴細胞系在免疫反應(yīng)中的地位，闡明了免疫球蛋白的分子結(jié)構(gòu)與功能。 免疫球蛋白相關(guān)概念抗體是指能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合具有免疫功能的球蛋白。 抗體的產(chǎn)生：機體免疫系統(tǒng)受抗原刺激后，B淋巴細胞被活化增殖和分化為漿細胞，由漿細胞合成和分泌的球

5、蛋白。 T淋巴細胞 B淋巴細胞2、抗體藥物的發(fā)展1890年：Behring和北里柴三郎等發(fā)現(xiàn)了白喉抗毒素，并建立了血清療法，開抗體制藥之先河。白喉桿菌1937年：Tiselius等人用電泳法將血清蛋白分為白蛋白、甲種（）球蛋白、乙種（ ）球蛋白和丙種（ ）球蛋白，并證明抗體活性主要存在于丙種球蛋白組分。20世紀60年代初期：抗原決定簇，精制單價血清。1975年：Khler和Milstein等，單克隆抗體，其具有高度特異性、均一性，以及來源穩(wěn)定可大量生產(chǎn)等特點。1984年：人-鼠嵌合抗體（30:70)1984年至今：單克隆抗體的鼠源性及分子過大的問題得以解決，可僅作為與抗原特異性結(jié)合試劑。特殊化

6、學(xué)基團喉類毒素：8個，流感病毒：40多個 抗原決定簇單克隆抗體和多克隆抗體的制備抗原脾B淋巴細胞融合融合淋巴細胞骨髓瘤細胞克隆1克隆2克隆3克隆4 3、單克隆抗體的應(yīng)用用于疾病的診斷和治療：如利用單克隆抗體檢測與某些疾病相關(guān)的抗原，輔助臨床診斷，或用放射性核素標記單克隆抗體進行腫瘤顯像，進行免疫鑒定。用于臨床治療，如針對T淋巴細胞共有的分化抗原CD3的單克隆抗體，用作免疫抑制劑。單克隆抗體還可作為載體制備導(dǎo)向藥物。但是要解決以下兩個問題：（1）鼠源性單克隆抗體的免疫原性；（2）完整的抗體分子分子量過大（10萬以上），難以穿透實體腫瘤組織，達不到有效的治療濃度。解決辦法： (1) 降低單克隆抗體

7、的免疫原性； (2) 降低單克隆抗體的相對分子質(zhì)量。 第二節(jié) 單克隆抗體及其制備1、抗原與動物免疫2、細胞融合與雜交瘤細胞的選擇性培養(yǎng)3、篩選陽性克隆與克隆化4、雜交瘤細胞與抗體性狀的鑒定5、單克隆抗體的大量制備6、單克隆抗體的純化1、抗原與動物免疫（1）制備用于動物免疫的適當抗原。 a、 化學(xué)合成抗原，如精制的地高辛。 b、 多數(shù)情況下抗原物質(zhì)只能得到部分純化，甚至是極不純的混合物，如部分純化的干擾素。 c、通過克隆化選出最適當?shù)膯慰寺】贵w。在制備惡性腫瘤細胞表面抗原的單克隆抗體時，情況較復(fù)雜，需用整個腫瘤細胞做為免疫原，經(jīng)過篩選、克隆化，制備出僅存在于腫瘤細胞而不存在于正常細胞上的表面標志

8、分子上的單克隆抗體。（2）穩(wěn)定的雜交瘤的獲得 因免疫動物品系和骨髓瘤細胞在種系發(fā)生上距離越遠，產(chǎn)生的雜交瘤越不穩(wěn)定，故一般采用與骨髓瘤供體同一品系的動物進行免疫。目前常用的骨髓瘤細胞系多來自BALB/c小鼠和Lou大鼠，因此免疫動物也多采用相應(yīng)的品系，最常用的也是BALB/c小鼠。 BALB/c小鼠：1923年美國培育，1985年引進我國。 Lou大鼠：1972年美國培育，1985年引進我國。（3）免疫方法：體內(nèi)免疫法和體外免疫法 體內(nèi)免疫法：適用于免疫原性強、抗原量較多時應(yīng)用，一般用8-12周齡的雌性鼠。顆粒性抗原（如細菌、細胞抗原）的免疫原性強，可不加佐劑，直接注入腹腔107個細胞進行初次

9、免疫，間隔1-3周，再追加免疫1-2次，可溶性抗原則按每只小鼠10-100g抗原與福氏完全佐劑等量混合后注入腹腔內(nèi)，進行初次免疫，間隔2-4周，再用不加佐劑的原抗原追加免疫1-2次。體外免疫法：所需要的抗原量少，一般只需幾個g，免疫期短，僅4-5天，干擾因素少，已成功制備出針對多種抗原的單克隆抗體，但融合后產(chǎn)生的雜交瘤細胞株不夠穩(wěn)定。其基本方法是用4-8周齡BALB/c小鼠的脾臟制成單個細胞懸液，再加入適當抗原使其濃度達0.5-5 g/mL，在5%CO2、37下培養(yǎng)4-5天，再分離脾臟細胞，進行細胞融合。2、細胞融合與雜交瘤細胞的選擇性培養(yǎng)（1）細胞融合基本方法：取適量脾細胞（1108）與骨髓

10、瘤細胞（2107 -3107）進行混合，在聚乙二醇（PEG）作用下誘導(dǎo)它們?nèi)诤希瑫r間控制在2min以內(nèi)，然后用培養(yǎng)液將PEG融合液緩慢稀釋。（2）用于融合的骨髓瘤細胞應(yīng)具備條件：融合率高，自身不分泌抗體，所產(chǎn)生的雜交瘤細胞分泌抗體的能力強且長期穩(wěn)定等特點。（3）誘導(dǎo)劑PEG的影響：分子量及濃度越大，促融率越高，但其粘度和對細胞的毒性也隨之增大。目前常用的PEG的濃度為40%-50%，相對分子質(zhì)量以4000為佳。 為了提高融合率，在PEG溶液中加入二甲基亞砜（DMSO）。但必須嚴格限制它們和細胞的接觸時間，可通過低速離心5min使細胞接觸更為緊密，然后用新配制的培養(yǎng)液來稀釋藥物并洗滌細胞。細胞融

11、合后可產(chǎn)生多種融合，脾脾、脾瘤、瘤瘤融合細胞，以及未融合的細胞。 （4）培養(yǎng)基的正確選擇：常用的選擇培養(yǎng)基為HAT培養(yǎng)基，它是次黃嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶（T）配制的。（5）選擇性培養(yǎng)方法： 細胞懸浮 96孔板 換液（HAT培養(yǎng)液） 改用HT培養(yǎng)液 普通的RPMI1640完全培養(yǎng)液。從融合后8-9天就可對所有克隆生長孔的培養(yǎng)上清進行抗體檢測，篩選出產(chǎn)生抗體的陽性克隆。（6）飼養(yǎng)細胞： 由于在最適的條件下大約有105個脾細胞才能形成一個雜交瘤細胞，大量瘤細胞在HAT培養(yǎng)液中相繼死亡，單個或少數(shù)的雜交瘤細胞多半不能存活，所以通常要加入飼養(yǎng)細胞才能使其繁殖。 常用的飼養(yǎng)細胞有小鼠腹腔巨噬

12、細胞、脾細胞和胸腺細胞等。 3、篩選陽性克隆與克隆化（1）篩選陽性克?。?因為產(chǎn)生特定抗原的抗體產(chǎn)生細胞只占所有脾細胞的5%左右，所以要進行每孔培養(yǎng)上清的抗體活性的篩選工作，以選擇出陽性克隆，然后進行克隆化培養(yǎng)。 常用的檢測方法有免疫酶技術(shù)、免疫熒光技術(shù)和放射免疫技術(shù)等。1、精制破傷風毒素抗原（ ）吸附（約10g/ml，4，3h）洗滌2、加雜交瘤培養(yǎng)上清液（ ）（4，1h）3、加辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗體（ ） （4，1h）洗滌洗滌4、加酶作用底物，呈色孔為陽性克隆孔ELISA用于破傷風抗體的篩選（2）克隆化有限稀釋法和軟瓊脂法 篩選出來的陽性克隆中，可能含有不分泌抗體的細胞或有多株分泌抗

13、體的細胞，而且剛剛?cè)诤汐@得的雜交瘤細胞不穩(wěn)定，染色體容易丟失，因此應(yīng)盡早克隆化。一般融合后獲得的 雜交瘤細胞要經(jīng)過大約3次的克隆化，才能達到100%孔內(nèi)均為抗體陽性細胞克隆。常用的克隆化方法有有限稀釋法和軟瓊脂法。有限稀釋法是把雜交瘤細胞懸液稀釋后，加入到96孔細胞培養(yǎng)板中，使每個孔中在理論上只含有一個細胞。第一次克隆化時也要應(yīng)用HT培養(yǎng)液，以后的克隆化可用不含HT的RPMI1640培養(yǎng)液。由于單個細胞難以存活，克隆化時也需加入飼養(yǎng)細胞輔助其生長。軟瓊脂法是在培養(yǎng)液中加入0.5%左右的瓊脂糖凝膠，細胞分裂后形成小球樣團塊，由于培養(yǎng)基是半固體狀態(tài)，可用毛細吸管將小球吸出，團塊打碎后，移入96孔板

14、中繼續(xù)培養(yǎng)。用這種方法可以吸出大量克隆細胞進行培養(yǎng)，因初代細胞很不易增殖，所以用軟瓊脂法進行克隆化容易成功。四、雜交瘤細胞與抗體性狀的鑒定（1）雜交瘤細胞的鑒定正常鼠的脾細胞染色體數(shù)為40，全部是端著絲粒染色體。雜交瘤細胞的染色體在數(shù)目上接近兩種親本細胞染色體數(shù)目的總和，在結(jié)構(gòu)上除多數(shù)為端著絲粒染色體外，還應(yīng)出現(xiàn)少數(shù)標志染色體。染色體數(shù)目較多又比較集中的雜交瘤細胞能穩(wěn)定分泌高效價的抗體，而染色體數(shù)目少且比較分散的雜交瘤細胞分泌抗體的能力較低。（2）抗體性狀的鑒定可用羊或兔抗Ig不同類和亞類的抗體，進行免疫擴散或ELISA法來鑒定。在單克隆抗體鑒定中還必須進行親和力測定，它可為正確選擇不同用途的

15、單克隆抗體提供依據(jù)。另外根據(jù)需要不同，還應(yīng)對單克隆抗體的特異性、純度和識別抗原的相對分子量等進行測定。五、單克隆抗體的大量制備（1）體外培養(yǎng)法可獲得10g/ml的抗體。（2）動物體內(nèi)誘生法，可獲得5-20mg/ml的抗體。 目前多采用后者生產(chǎn)制備單克隆抗體。因為雜交瘤細胞的兩種親本細胞均來自BALB/c小鼠，所以應(yīng)選用BALB/c小鼠來制備單克隆抗體。動物體內(nèi)誘生法操作簡便，也比較經(jīng)濟，所得單克隆抗體量較多且效價亦高，還可有效地保存雜交瘤細胞株和分離已污染雜菌的雜交瘤細胞株，缺點是小鼠腹水中混有來自小鼠的多種雜蛋白，給純化帶來難度。六、單克隆抗體的純化1、澄清和沉淀處理 小鼠腹水中含有紅細胞、

16、細胞碎塊、纖維蛋白凝塊及脂質(zhì)等，應(yīng)首先用離心力1000g離心5min，去除殘留的小顆粒物質(zhì)；再用0.2m的微孔濾膜過濾，除掉污染的細菌、支原體和脂質(zhì)；用飽和硫酸銨沉淀抗體，50%飽和硫酸銨能回收90%以上的單克隆抗體。2、分離 根據(jù)用途可選用不同的方法，主要分離方法有凝膠過濾、陰離子交換層析、親和層析等。（1）凝膠過濾 用于IgG和IgM類單克隆抗體的分離純化。常用Sephadex G200作分離介質(zhì)，可收集到三個峰，最高峰為IgM，另兩個峰為IgG，抗體回收率達50%-80%，能去除污染的微量雜蛋白，抗體純度可達95%以上。（2）陰離子交換層析：用于IgG類單克隆抗體的分離純化。在pH7.4

17、條件下，IgG1和IgG2能結(jié)合在DEAE填料上，其中IgG2a可在較低離子強度條件下洗脫下來，其純度較高。IgG2b、IgG3在低離子強度下易發(fā)生沉淀，可增加離子強度以提高產(chǎn)量，但其純度相對較低。在pH5.5條件下，把雜交瘤細胞培養(yǎng)的上清液加到瓊脂糖柱上時，所有的抗體都能結(jié)合到柱上，而55%的雜蛋白可被洗脫掉，再用不同離子強度的洗脫劑洗下。 （3）離子交換法 在最適離子強度及pH條件下，以離子交換層析分離單克隆抗體可以純化25-100倍。高容量、高流速、化學(xué)穩(wěn)定的新型離子交換劑適宜單克隆抗體的大規(guī)模純化。（4）親和層析 多用蛋白A親和層析，適用于IgG類單克隆抗體的純化。IgG與蛋白A的結(jié)合

18、與pH有密切關(guān)系，鼠源性單克隆抗體在pH8.0時，IgG2b、IgG3幾乎全部結(jié)合于蛋白A柱上，IgG1稍差，用pH3.5緩沖液可洗脫IgG2b，pH4.0緩沖液可洗脫下IgG3，pH4.5緩沖液可洗脫下IgG2a，pH6.0可洗脫下IgG1。用蛋白A親和層析收獲的抗體純度很高，但也有極微量的雜蛋白。第三節(jié) 鼠源性單克隆抗體的改進改造鼠源性單克隆抗體的目的： 一是降低免疫原性； 二是降低相對分子量，增加組織通透性。如將鼠源性單克隆抗體的C區(qū)用人的Ig分子的C區(qū)置換，則對人的免疫原性消失。對鼠源性抗體的改造已有很多成果報道，見書中表4-4，給出了改造后的單抗的類型和特性。一、人-鼠嵌合抗體制備方

19、法：提取雜交瘤細胞系的mRNA，經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并以其為模板，采用特異引物，用PCR方法分別擴增VL和VH基因，再分別連接真核表達所需的上游啟動子、前導(dǎo)肽序列和下游剪切供體信號、增強子真核調(diào)控序列后，將VL基因克隆到人Ig的CL基因表達載體上，將VH基因克隆到人IgG1的C基因真核表達載體上，再將人-鼠嵌合的V-C區(qū)基因質(zhì)粒DNA等量混合，在脂質(zhì)體介導(dǎo)下共轉(zhuǎn)染骨髓瘤細胞SP2/0，轉(zhuǎn)染后用含霉酚酸進行篩選，形成集落的細胞即為共轉(zhuǎn)染細胞，所分泌的抗體為嵌合抗體。它保持鼠源性單克隆抗體的抗原結(jié)合的特異性，但對人的免疫原性大幅下降了。如若用人IgG1或IgG3的C基因替換鼠IgG1或IgG2b

20、，則可有效地加強多肽的ADCC效應(yīng)與免疫調(diào)理作用。二、改形抗體如果用鼠源性單克隆抗體的CDR序列替換人Ig分子中CDR序列，則可使人的Ig分子具有鼠源性單克隆抗體的抗原結(jié)合特異性?？贵w分子中鼠源性部分只占很小比例，可基本消除免疫原性。這種改形抗體（reshaping antibody）又稱CDR移植抗體（CDR grafting antibody）。書中表4-5給出幾種改形抗體及其潛在的臨床應(yīng)用。三、小分子抗體基因工程小分子抗體僅表達鼠源性單克隆抗體的V區(qū)片段，其相對分子量僅為原抗體的1/80-1/3。也就是說，保留了CDR區(qū)，而Ig分子的C區(qū)不表達。現(xiàn)在研制的小分子抗體有以下幾種類型：（1）

21、Fab抗體，由完整的輕鏈和重鏈（VH和CH1） 所組成。（2）FV抗體，由VH和VL組成，天然FV片段中VH和VL為非共價性結(jié)合。（3）單鏈抗體（single chain antibody SCA 或single chain FV,SCFV），由VH和VL通過一段連接肽（linker）連接而成的重組蛋白。有分子量小、穿透力強、免疫原性小特點，可與效應(yīng)分子相連接構(gòu)建新功能抗體分子，是構(gòu)建免疫毒素和雙特異抗體的理想元件。（4）單域抗體，由VH(VL)單個可變區(qū)組成的，只有抗體分子的1/12，而且表面疏水性強，與抗原非特異結(jié)合能力也強。（5）最小識別單位（MRU）是由單個CDR區(qū)構(gòu)成的小分子抗體，親和力較低。四、雙功能抗體雙功能抗體就是雙特異性抗體（biospecific antibody, BsAb）。它是一種非天然性的抗體，其結(jié)合抗原的兩個臂具有不同的特異性。1、化學(xué)交聯(lián)法2、生物學(xué)方法（雜種-雜交瘤）雜交瘤細胞與脾細胞融合得到可分泌兩種親代抗體和雜種抗體的 雜種-雜交瘤細胞。3、基因工程方法 采用適當?shù)慕宇^連接不同抗體的VH和VL區(qū)，使它們不能形成鏈內(nèi)的分子內(nèi)配對，讓其形成原抗體的分子內(nèi)配對，構(gòu)建雙特異性（ SCFV)2。五、抗體融合蛋白類型有： （1）配基-配基型融合蛋白，如CD4-Fc。 （2）配基-Ig嵌合型蛋白，如IL-2-Ig。 （3）配基-FV型嵌合蛋白