纖維素酶活力的測(cè)定

1、生物產(chǎn)品檢驗(yàn)技術(shù)課程羊元教學(xué)設(shè)計(jì)卡一、教案頭課程單元纖維素酶活力的測(cè)定授課對(duì)象生物技術(shù)專業(yè)單元學(xué)時(shí)2授課教師授課地點(diǎn).授課時(shí)間.教 學(xué) 目 標(biāo)能力（技能）目標(biāo)知識(shí)目標(biāo)素質(zhì)目標(biāo)掌握紫外分光光 度法測(cè)定的纖維素酶 活力的操作流程；掌握酶液、底物母 液、緩沖液的配制方 法；熟練分光光度計(jì)的 使用方法；能夠精確完成葡萄 糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制；酶活力的計(jì)算。掌握CMC法測(cè)定纖維 素酶活力的原理；掌握CMC法測(cè)定纖維 素酶活力的方法；養(yǎng)成認(rèn)真主動(dòng)學(xué)習(xí)的 習(xí)慣；能掌握常用儀器的使 用和保養(yǎng)方法；養(yǎng)成完成實(shí)訓(xùn)后及時(shí) 整理實(shí)訓(xùn)場(chǎng)所的良好職 業(yè)素養(yǎng)；養(yǎng)成良好的團(tuán)隊(duì)合作 精神。能力訓(xùn) 練任務(wù)CMC法測(cè)定纖維素酶活力實(shí)訓(xùn)教

2、 學(xué) 重 點(diǎn) 與 難 點(diǎn)重點(diǎn)難點(diǎn)CMC法測(cè)定纖維素酶活力的操作 流程；酶活力的計(jì)算方法。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。各種試液配制；教 學(xué) 內(nèi)任務(wù)一纖維素酶的性質(zhì)纖維素酶的生產(chǎn)流程任務(wù)二CMC法測(cè)定纖維素酶活力的實(shí)驗(yàn)原理CMC法測(cè)定纖維素酶活力的操作流程CMC法測(cè)定纖維素酶活力的操作要點(diǎn)酶活力的計(jì)算教 學(xué) 設(shè) 計(jì) 與 組 織過(guò)程設(shè)計(jì)導(dǎo)入新課通過(guò)闡述纖維素酶是一種重要復(fù)合酶，主要由外切B-葡聚糖 盟、內(nèi)切葡聚糖酶和(3-葡萄糖昔酶等組成，還有很高活力的木 聚糖酶活力。纖維素酶反應(yīng)和一般酶反應(yīng)不一樣,其最主要的區(qū)別在于纖 維素酶是多組分酶系，且底物結(jié)構(gòu)極其復(fù)雜。由于底物的水不溶性，纖維素酶的吸附作用代替了酶

3、與底物 形成的ES復(fù)合物過(guò)程。纖維素酶先特異性地吸附在底物纖維素 上，然后在幾種組分的協(xié)同作用下將纖維素分解成葡萄糖。酶作用的最適溫度為4050C,最適pH在4.06.0.常見(jiàn)的激活劑有：氟化鈉、Mg2+、氯化鉆、Ca2+、磷酸鈣等,纖維素酶在飼料、酒精、紡織和食品等領(lǐng)域具有巨大的市場(chǎng) 潛力。提出其活力測(cè)定的重要性。生產(chǎn)纖維素酶的微生物菌種較多的是有細(xì)菌、放線菌、真菌 等，其中酶活力較強(qiáng)的菌種為木霉屬(Trichoderma)、曲霉屬CAs pergillus)和青霉屬(Penic/inm),特別是綠色木霉(Trichoder mavirde)及其近緣菌株等較為典型，是目前公認(rèn)的較好的纖維 素

4、酶生產(chǎn)菌。現(xiàn)已制成制劑的有綠色木霉、黑曲霉、鐮刀霉等纖 維素酶。同時(shí)，反芻動(dòng)物依靠瘤胃微生物可消化纖維素，因此可 以利用瘤胃液獲得纖維酶的粗酶制劑。另外，也可利用組織培養(yǎng) 法獲得所需要的微生物。纖維素酶的生產(chǎn)流程？時(shí)間5min.lOmin5minlOmin種子培羔纖維素酶液體發(fā)酵法工藝流程CMC酶活力法測(cè)定纖維素酶活力的實(shí)驗(yàn)原理纖維素酶水解梭甲基纖維素鈉產(chǎn)生還原糖，還原糖能將3, 5- 二硝基水楊酸(DNS)還原，生成橙黃色的氨基化合物，在540nm 波長(zhǎng)處有最大光吸收，在一定范圍內(nèi)還原糖的量與反應(yīng)液的顏色 強(qiáng)度呈比例關(guān)系，利用比色法測(cè)定其還原糖生成的量就可測(cè)定纖 維素酶的活力。材料與用具材料

5、商品纖維素酶。試劑3, 5-二硝基水楊酸顯色劑(又稱DNS試劑):稱取10 g 3, 5- 二硝基水楊酸，溶于蒸餡水中，加入20 g分析純NaOH, 200 g酒 石酸鉀鈉，加水500 ml,升溫溶解后，加入重蒸酚2 g,無(wú)水亞 硫酸鈉0.5g,加熱攪拌，待全部溶解后，冷卻，定容至1 000 ml。 貯存于棕色瓶中，室溫保存，放置一周后使用。0. 1 mol/LpH4. 6醋酸-醋酸鈉緩沖液：稱取結(jié)晶醋酸鈉 (CH3C00Na. 3H20)13. 61 g,醋酸(CH3C00H)6. 00 g,用蒸餡水溶 解，并定容至1 000 ml,配好后用pH計(jì)校正。lOmin1 mg/ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液

6、:準(zhǔn)確稱取100 mg分析純葡萄糖(預(yù) 先在70C、600 mm汞柱下干燥5 h至恒重)，用少量蒸餡水溶解 并定容至100 ml,冰箱中保存?zhèn)溆?。底物?.5%舞甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液，配制方為稱取 0. 500 0 g手及甲基纖維素鈉(Sigma公司生產(chǎn))，準(zhǔn)確至0. 001 g, 用上述緩沖溶液溶解并定容至100 ml,冰箱中保存，有效期3d。待測(cè)酶液：稱取酶粉1.0 g(或吸取液體酶1.00 ml),先用 少量的0. 05 mol/L pH 4. 5醋酸-醋酸鈉緩沖液溶解，并用玻璃棒 搗研，然后將上清液小心傾入適當(dāng)?shù)娜萘科恐?，沉渣部分再加?量上述緩沖液溶解，如此反復(fù)搗研34次

7、，最后全部移入容量瓶 中，用緩沖液定容至刻度，40C水浴鍋中浸提1 h,用四層紗布或脫脂棉過(guò)濾，濾液供測(cè)定用。3）器具分析天平、變溫電爐、恒溫水浴鍋、分光光度計(jì)、秒表等。（五）CMC酶活力法測(cè)定纖維素酶活力的操作流程（六）操作要點(diǎn)（1）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線取 Img / ml 葡萄糖液 0. 2, 0. 4, 0. 6, 0. 8, 1. 0, 1. 2,1.4 ml于7支試管中，再分別加蒸偏水至2.0 ml。向各管加3, 5-30minlOmin5min二硝基水楊酸1.5ml,置沸水浴煮沸5 min,冷卻后用蒸餡水定容 至20ml,搖勻。以2ml蒸餡水加DNS溶液1.5ml,按上述同樣操 作作為空白

8、調(diào)零，在波長(zhǎng)540 mm處比色。以吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo), 葡萄糖毫克數(shù)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。各管葡萄糖含量見(jiàn)下表。標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制各試管所含物質(zhì)的體積（2）酶樣測(cè)定管號(hào)空白1234567葡萄糖溶00. 20.40.60. 81.1.1.蒸餡水2.01. 81.61.41.21.0.0.DNS/ml1.51.51.51.51.51.1.1.葡萄糖量00.20.40.60.81.1.1.于比色管中加入1. 5 ml 5%竣甲基纖維素鈉溶液，在40C水浴 鍋中預(yù)熱5 min,加入0. 5 ml稀釋后的酶液，置40C水浴鍋中， 立即計(jì)時(shí)，保溫30min（糖化）后取出，即刻加入3 ml DNS顯色液, 于沸水

9、浴中煮沸5 min,使酶失活，終止反應(yīng)，流水冷卻，加蒸 餡水5 ml,搖勻，定容至10 ml；同時(shí)以0.5 ml緩沖液代替酶 液，同上操作，作為空白，在540nm處比色，測(cè)定吸光度值A(chǔ), 查曲線得相應(yīng)的葡萄糖含量W。（七）酶活力的計(jì)算酶的比活力定義：在pH 4.6, 40C條件下，每分鐘水解底物 產(chǎn)生還原糖1網(wǎng)，為1酶活力單位。X= （WXIOOOXn） /（0. 5X180X30）式中，X酶的比活力，U/g；180葡萄糖分子量；0.5酶液的體積，ml；W查標(biāo)準(zhǔn)曲線得出相應(yīng)的葡萄糖含量，mg；30反應(yīng)時(shí)間，min；n一一酶稀釋倍數(shù)；1 000由mg換算為ug的換算系數(shù)。（A）單元課小結(jié)由纖維素酶的性質(zhì)應(yīng)用引入，使同學(xué)了解學(xué)習(xí)測(cè)定糖化酶 活力的目的、意義。掌握正確的學(xué)習(xí)方法。安排下節(jié)課的學(xué)習(xí)任務(wù)。建立班級(jí)學(xué)習(xí)小組，每4人組成一個(gè)學(xué)習(xí)小組，由班長(zhǎng)、 學(xué)習(xí)委員和小組長(zhǎng)組織學(xué)習(xí)興趣小組，協(xié)助代課老師組 織教學(xué)。思考討論布置思考題。5min.教1.恒溫水浴鍋。學(xué)2.分析天平。儀3.變溫電爐。器4.分光光度計(jì)。設(shè)5.秒表等備教 學(xué) 資 料教材：生物產(chǎn)品分析與