總RNA提取定量與RTPCR

1、總RNA的提取(tq)、定量與RT-PCR南方醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范(shfn)中心Expertimental Teaching Center of Biochemistry and Molecular Biology共四十三頁(yè)完整RNA的提取和純化,是進(jìn)行RNA 方面的研究工作如Nothern雜交、mRNA分離、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及體外翻譯等的前提。掌握從細(xì)胞中提取總RNA的方法熟悉紫外吸收法檢測(cè)RNA濃度與純度的原理(yunl)及測(cè)定方法掌握RT-PCR基因擴(kuò)增的原理和過(guò)程目 的共四十三頁(yè)實(shí)驗(yàn)(shyn)流程提取(tq)原理操作步驟逆轉(zhuǎn)錄原理操作步驟提

2、 取總RNA定 量合成cDNA第一鏈原理體系引物選擇PCR電泳原理電泳步驟電 泳計(jì)算方法操作步驟共四十三頁(yè)第一(dy)部分 細(xì)胞總RNA的提取及定量Extraction and Quantitation of Cell Total RNA 共四十三頁(yè)所有RNA的提取過(guò)程中都有五個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)：樣品細(xì)胞或組織的有效破碎；有效地使核蛋白復(fù)合體變性；對(duì)內(nèi)源RNA酶的有效抑制；有效地將RNA從DNA和蛋白混合物中分離；對(duì)于(duy)多糖含量高的樣品還牽涉到多糖雜質(zhì)的有效除去。 關(guān) 鍵 點(diǎn)共四十三頁(yè)原 理10-5g RNA/細(xì)胞 RNA分離的方法：異硫氰酸胍氯化銫超速離心法；鹽酸胍-有機(jī)溶劑法；氯化鋰-尿素法

3、；蛋白酶K-細(xì)胞質(zhì)RNA提取法；異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法(Trizol法)等。目前(mqin)常用的是Trizol法。rRNA 80-85%：28S 18S 5StRNA, snRNA 10-15%mRNA 1-5%共四十三頁(yè)原 理Trizol 是一種新型總 RNA 抽提試劑其主要成分是異硫氰酸胍和酚。異硫氰酸胍屬于解偶劑，是一類(lèi)(y li)強(qiáng)力的蛋白質(zhì)變性劑，可溶解蛋白質(zhì)，其主要作用是裂解細(xì)胞，使細(xì)胞中的蛋白/核酸物質(zhì)解聚得到釋放。酚雖可有效的變性蛋白質(zhì)，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中還加入了8-羥基喹啉、-巰基乙醇等來(lái)抑制內(nèi)源和外源RNase。共四十三頁(yè)在加入氯仿離心

4、后，氯仿比重大，使溶液分為水相、中間層和有機(jī)相。RNA在上層水相中，DNA和蛋白質(zhì)位于(wiy)中間層，有顏色的下層為有機(jī)相。取出水相用異丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中間層可回收DNA。原 理共四十三頁(yè)RNA酶污染(wrn)來(lái)源RNA酶可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌等。嚴(yán)格控制外源性RNA酶的污染：外源性的RNA酶存在于操作人員的手汗、唾液等，也可存在于灰塵中，造成器械、玻璃制品、塑料制品、電泳槽、研究人員的手及各種( zhn)試劑的污染。 最大限度地抑制內(nèi)源性的RNA酶：而各種組織和細(xì)胞中則含有大量?jī)?nèi)源性的RNA酶。共四十三頁(yè)常用(chn yn)的RNA酶抑制劑焦碳酸二乙酯（

5、DEPC) 是一種強(qiáng)烈但不徹底的RNA酶抑制劑。它通過(guò)(tnggu)和RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性，從而抑制酶的活性。 異硫氰酸胍 目前被認(rèn)為是最有效的RNA酶抑制劑，它在裂解組織的同時(shí)也使RNA酶失活。它既可破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)使核酸從核蛋白體中解離出來(lái)，又對(duì)RNA酶有強(qiáng)烈的變性作用。 RNA酶的蛋白抑制劑(RNasin) 從大鼠肝或人胎盤(pán)中提取得來(lái)的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，可以和多種RNA酶結(jié)合，使其失活。 其他 SDS、尿素、硅藻土等對(duì)RNA酶也有一定抑制作用。 共四十三頁(yè)防止RNA酶污染(wrn)的措施 所有的玻璃器皿均應(yīng)在使用前于180的高

6、溫下干烤6h或更長(zhǎng)時(shí)間。 塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡12h以上，高壓滅菌。有機(jī)玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2室溫(sh wn)10min，然后用0.1%DEPC水沖洗，晾干。 配制的溶液應(yīng)盡可能用0.1% DEPC在37處理12h以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應(yīng)當(dāng)用DEPC處理過(guò)的無(wú)菌雙蒸水配制，然后經(jīng)濾膜過(guò)濾除菌。 操作人員戴一次性口罩、帽子、手套，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中手套要勤換。 設(shè)置RNA操作專(zhuān)用實(shí)驗(yàn)室，所有器械等應(yīng)為專(zhuān)用。 共四十三頁(yè)共四十三頁(yè)操作步驟 樣品處理提取組織RNA時(shí)，每50100mg組織用1ml T

7、rizol試劑對(duì)組織進(jìn)行裂解；懸浮細(xì)胞先離心沉淀，每5-10 106個(gè)細(xì)胞加1ml Trizol后，反復(fù)用槍吹打或劇烈振蕩以裂解細(xì)胞。培養(yǎng)貼壁細(xì)胞不須消化，可直接用Trizol進(jìn)行消化、裂解，Trizol體積按10cm2/ml比例加入。 (注意：勻漿一定要徹底，是提取高質(zhì)量RNA的前提(qint)；細(xì)胞數(shù)量與Trizol的比例，細(xì)胞的數(shù)量不能過(guò)多。)實(shí)驗(yàn)材料：人胚胎腎細(xì)胞293 共四十三頁(yè)操作步驟細(xì)胞或組織加Trizol（RNAisoPlus）后劇烈振蕩15s，室溫放置5min，使其充分裂解。 （注意：此時(shí)可放入-70長(zhǎng)期保持）按0.2ml 氯仿/1ml Trizol加入氯仿(本實(shí)驗(yàn)加100l

8、)，劇烈振蕩混勻后室溫放置5min。 (注意：此步振蕩非常重要，建議在旋渦振蕩器上進(jìn)行。)4 12,000g離心15min。樣品分為三層：底層為黃色（紅或綠）有機(jī)相，上層為無(wú)色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用Trizol試劑的60。吸取上層水相，至另一離心管中。一般400-450l 就足夠了，寧少勿多！ （注：千萬(wàn)不要(byo)吸取中間界面） 共四十三頁(yè)操作步驟加入等體積異丙醇混勻，4放置5-10min。 4 12,000g離心10min，棄上清，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。按1ml 75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇洗滌RNA沉淀，（切勿(qi w)觸及沉

9、淀?。睾驼袷庪x心管，懸浮沉淀。 4 12,000g離心5min，盡量棄上清。 室溫晾干或真空干燥RNA沉淀5-10min。（注：RNA樣品不要過(guò)于干燥，否則很難溶解。）加入10l無(wú)RNase的水，充分震蕩混勻。共四十三頁(yè)操作步驟 收集適量(shling)細(xì)胞，加500l Trizol用移液槍反復(fù)(fnf)吹吸，直至裂解液中無(wú)明顯沉淀向裂解液中加100 l氯仿4, 12000g 離心15min吸取上清液200250 l 至另一新離心管中(切忌吸出白色中間層)向上清中加入等體積異丙醇混勻4, 12000g 離心10min緩慢沿離心管壁加入500l 75%乙醇4, 12000g 離心5min小心盡

10、量棄去乙醇加入10l RNase-free水溶解沉淀備用室溫靜置5min蓋緊離心管蓋，用手振蕩15s室溫靜置5min上下顛倒離心管充分混勻室溫靜置10min小心棄去上清室溫干燥沉淀2-5min（1）（2）（3）（4）（5）（6）（7）（8）（9）洗滌離心管壁輕輕上下顛倒共四十三頁(yè)原 理：物質(zhì)在光的照射(zhosh)下會(huì)產(chǎn)生對(duì)光的吸收效應(yīng) 而且物質(zhì)對(duì)光的吸收是具有選擇性的各種不同的物質(zhì)都具有其各自的吸收光譜 因此不同(b tn)波長(zhǎng)的單色光通過(guò)溶液時(shí)其光的能量就會(huì)被不同(b tn)程度的吸收，光能量被吸收的程度和物質(zhì)的濃度有一定的比例關(guān)系.紫外光吸收法共四十三頁(yè)紫外吸收(xshu)檢測(cè)RNA的濃

11、度RNA在260nm波長(zhǎng)處有最大的吸收峰。因此，可以用260nm波長(zhǎng)分光測(cè)定RNA濃度，OD值為1相當(dāng)于大約 40g/ml 的單鏈RNA。用雙蒸水稀釋RNA樣品（1lRNA+49l水）倍并以雙蒸水為空白對(duì)照，根據(jù)此時(shí)讀出的OD260 值即可計(jì)算(j sun)出樣品稀釋前的濃度: RNA (mg/ml) = 40OD260 讀數(shù)稀釋倍數(shù)(n)/1000dsDNA(雙鏈DNA)1OD260 = 50ug/mlssDNA(單鏈DNA)1OD260 = 33ug/mlRNA1OD260 = 40ug/ml共四十三頁(yè)RNA純品:OD260 /OD280 2.0(1.82.0)，OD260 /OD230

12、2.0 若OD260/OD280小于1.8，說(shuō)明樣品(yngpn)中還可能含有蛋白質(zhì)或酚，應(yīng)再用酚/氯仿抽提，以乙醇沉淀純化RNA。若OD260/OD280大于2.0，則提示可能有異硫氰酸殘存或RNA降解。OD260/OD230比值小于2.0時(shí)表明有小分子及鹽存在。紫外吸收(xshu)檢測(cè)RNA的純度共四十三頁(yè)共四十三頁(yè)RNA完整性檢測(cè)(jin c)完整的RNA的甲醛電泳可明顯地觀(guān)察到28S和18S兩條帶，并且28S大約是18S的兩倍寬。若兩條帶不明顯, 則說(shuō)明(shumng)RNA部分降解,可能的原因是污染了RNase。 共四十三頁(yè)常見(jiàn)問(wèn)題分析(fnx)RNA得率低： A.樣品裂解或勻漿處理

13、(chl)不徹底。 B.RNA沉淀未完全溶解。A260/A2801.65 ： A.RNA應(yīng)使用TE Buffer稀釋后再進(jìn)行吸光度值的測(cè)定。 低離子濃度和低pH值條件下A280值偏高。 B.樣品勻漿時(shí)加的試劑量太少。 C.勻漿樣品時(shí)未在室溫放置5分鐘。 D.吸取水相時(shí)混入了有機(jī)相。 E.RNA沉淀未完全溶解。共四十三頁(yè)RNA降解 A.組織取出后沒(méi)有馬上處理(chl)或冷凍。 B.待提取RNA的樣品沒(méi)有保存于-60至-70，而保存在了-5至-20。 C.細(xì)胞在用胰酶處理時(shí)過(guò)度。 D.溶液或離心管未經(jīng)RNase去除處理。 E.電泳時(shí)使用的甲醛pH值低于了3.5 。DNA污染 A.樣品勻漿時(shí)加的試劑

14、量太少 B.樣品中含有有機(jī)溶劑(如乙醇，DMSO等)，強(qiáng)緩沖液或堿性溶液常見(jiàn)問(wèn)題分析(fnx)共四十三頁(yè)第二(d r)部分 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction 共四十三頁(yè)提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而獲得目的基因或檢測(cè)基因表達(dá)(biod)。RT-PCR使RNA檢測(cè)的靈敏性提高了幾個(gè)數(shù)量級(jí)，使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。該技術(shù)主要用于：分析基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、獲取目的基因、合成cDNA探針、構(gòu)

15、建RNA高效轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。原 理共四十三頁(yè)鼠白血病病毒（MMLV）反轉(zhuǎn)錄酶：有強(qiáng)的聚合酶活性，RNA酶H活性相對(duì)較弱。最適作用溫度為37。在長(zhǎng)時(shí)間的逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，不會(huì)(b hu)造成模板的降解，獲得cDNA的幾率大，適用于較長(zhǎng)的cDNA鏈的合成。 禽成髓細(xì)胞瘤病毒（AMV）反轉(zhuǎn)錄酶：有強(qiáng)的聚合酶活性和RNA酶H活性。最適作用溫度為42。Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜熱微生物的熱穩(wěn)定性反轉(zhuǎn)錄酶：在Mn2+存在下，允許高溫反轉(zhuǎn)錄RNA，以消除RNA模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)。MMLV反轉(zhuǎn)錄酶的RNase H-突變體：商品名為Superscript 和SuperScrip

16、t。此種酶較其它酶能多將更大部分的RNA轉(zhuǎn)換成cDNA，這一特性允許從含二級(jí)結(jié)構(gòu)的、低溫反轉(zhuǎn)錄很困難的mRNA模板合成較長(zhǎng)cDNA。（一）反轉(zhuǎn)錄(zhun l)酶的選擇 共四十三頁(yè)隨機(jī)六聚體引物：用此種方法時(shí)，體系中所有RNA分子全部充當(dāng)了cDNA第一鏈模板，通常用此引物合成的cDNA中96%來(lái)源于rRNA。Oligo(dT)：是一種對(duì)mRNA特異的方法。因絕大多數(shù)真核細(xì)胞mRNA具有3端Poly(A+)尾，此引物與其配對(duì)，僅mRNA可被轉(zhuǎn)錄(zhun l)。由于Poly(A+)RNA僅占總RNA的1-4%，故此種引物合成的cDNA比隨機(jī)六聚體作為引物和得到的cDNA在數(shù)量和復(fù)雜性方面均要小。

17、特異性引物：是用含目標(biāo)RNA的互補(bǔ)序列的寡核苷酸作為引物，用此類(lèi)引物僅產(chǎn)生所需要的cDNA，導(dǎo)致更為特異的PCR擴(kuò)增。 （二）引物的選擇(xunz) 共四十三頁(yè) （三）內(nèi)參(ni cn)的設(shè)定為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠與準(zhǔn)確，可在PCR擴(kuò)增目的基因時(shí)，加入一對(duì)內(nèi)參照基因的特異性引物，同時(shí)擴(kuò)增內(nèi)參DNA，作為對(duì)照。常用(chn yn)的內(nèi)參有GAPDH （3-磷酸甘油醛脫氫酶）、-Actin（-肌動(dòng)蛋白）等。其目的在于避免RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應(yīng)體系中擴(kuò)增效率不均一、各孔間的溫度差等所造成的誤差。共四十三頁(yè)儀器(yq)和主要試劑基因擴(kuò)增儀、微量加樣槍、滅菌超薄PCR反應(yīng)(fnyng)

18、管總RNA第一鏈cDNA合成試劑盒 （含有逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、緩沖液）dNTP mix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2 mmol/L共四十三頁(yè)操作步驟采用TaKaRa PrimeScript RT reagent kit進(jìn)行cDNA第一(dy)鏈合成：按下列組分配制RT反應(yīng)液5X PrimeScrip Buffer 2 l PrimeScript RT Enzyme Mix 0.5 l Oligo dT Primer (50 M) 0.5 l Random 6mers (100 M) 0.5 l RNase free H2O 1.5ulTotal RNA 5 l 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

19、條件如下37 15min （反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)）85 5sec （反轉(zhuǎn)錄酶失活反應(yīng)）注：反轉(zhuǎn)錄步驟在PCR儀中進(jìn)行共四十三頁(yè)操作步驟采用TaKaRa PrimeScript RT reagent kit進(jìn)行cDNA第一鏈合成：按下列組分配制RT反應(yīng)(fnyng)液5X PrimeScrip Buffer 2.0l PrimeScript RT Enzyme Mix 0.5 l Oligo dT Primer (50 M) 0.5 l Random 6mers (100 M) 0.5 l Total RNA 6.5 l 總體積 10l反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下37 15min （反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)）85 5sec （反

20、轉(zhuǎn)錄酶失活反應(yīng)）注：反轉(zhuǎn)錄步驟在PCR儀中進(jìn)行共四十三頁(yè)第一鏈cDNA2lPerfectShot Taq 10l上游引物 (10M)1l下游引物 (10M)1lRNase Free H2O總體積6l20l取0.2 ml PCR反應(yīng)管一只，用微量加樣槍按下述順序分別加入(jir)各試劑(注意每換一種試劑換一個(gè)新吸頭)： 如配好的反應(yīng)液較多沾到管壁上，可將PCR反應(yīng)管置臺(tái)式離心機(jī)中瞬時(shí)離心，使反應(yīng)液集中(jzhng)于管底，然后將反應(yīng)管放到基因擴(kuò)增儀(PCR儀)上 .PCR反應(yīng)體系共四十三頁(yè) 94預(yù)變性5分鐘后開(kāi)始以下循環(huán)(xnhun) 94 30 秒 55 30 秒 30 循環(huán) 72 30 秒

21、72 5 分鐘 4 保溫實(shí)驗(yàn)過(guò)程約1小時(shí)30分鐘PCR參數(shù)設(shè)置共四十三頁(yè)P(yáng)CR 反應(yīng)的每一個(gè)溫度循環(huán)周期都是由DNA變性、引物退火和反應(yīng)延伸三個(gè)步驟完成的。圖中設(shè)定的反應(yīng)參數(shù)是94變性30s， 60退火30s， 72 延伸45s。如此周而復(fù)始，重復(fù)進(jìn)行，直至擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量(shling)滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)需求為止。 溫度（） 時(shí)間（min）94726094變性（30s）55 退火（30s）72 延伸（30s）循環(huán)1 循環(huán)2 循環(huán)3PCR反應(yīng)(fnyng)的溫度循環(huán)周期共四十三頁(yè) 本實(shí)驗(yàn)所擴(kuò)增的產(chǎn)物DNA片段長(zhǎng)度400bp500bp, 可取(kq)5l PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。利用標(biāo)準(zhǔn)DN

22、A marker評(píng)估擴(kuò)增的特異性。 瓊脂糖凝膠電泳共四十三頁(yè)瓊脂糖是一種天然聚合長(zhǎng)鏈狀分子，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度DNA分子在堿性環(huán)境中帶負(fù)電荷，在外加(wiji)電場(chǎng)作用下向正極泳動(dòng).DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。不同的DNA，分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時(shí)的泳動(dòng)率就不同，從而分出不同的區(qū)帶(遷移速度與分子量的對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系).瓊脂糖凝膠電泳原理(yunl)共四十三頁(yè)影響(yngxing)遷移速率因素 1、 DNA的分子大小 2、 瓊脂糖濃度 3、 DNA分子的構(gòu)象 4、 電源電壓 5、 嵌入染料的存在 6、 離子強(qiáng)度(qingd)影響 瓊脂糖凝膠電泳原理有效分離范圍共四十三頁(yè)實(shí)驗(yàn)(shyn)材料電泳指示劑：核酸電泳常用(chn yn)的指示劑有兩種，溴酚藍(lán)呈藍(lán)紫色；二甲苯晴呈藍(lán)色，它攜帶的電荷量比溴酚藍(lán)少，在凝膠中的的遷移率比溴酚藍(lán)慢。 染料：Gelview、EB電泳緩沖液：TBE瓊脂糖DNA Marker 5000共四十三頁(yè)溴化乙錠(EB) :3,8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴鹽)，可與DNA結(jié)合,在紫外光照射下呈現(xiàn)紅橙熒光,有致癌性.Gelview: 是一種新型