高分子科學與基因容載課件

1、高分子科學與基因工程基因工程的兩個重要領域：1）基因分離（DNA Separation）;2）基因重組（Gene Recombination）;容多莎蔭耿脫纏鞠位衛(wèi)愉宿查智鑒馴馱駕珊蔭刑捐詛夷鋸側欽契中銳肥趴高分子科學與基因容載高分子科學與基因容載2005/07/051*第1頁，共21頁。基因重組和高分子科學 基因重組是“雙刃劍”： 優(yōu)良的基因重組：物種改良、疾病防治； 不良的基因重組：惡果難以預料； 基因重組的策略： 1）補充策略：轉移所需基因； 2）糾正策略：定點修復變異基因； 基因轉移（DNA Delivery）的實施： 1）活體直接轉移（in vivo）； 2）離體間接轉移（ex vi

2、vo）； 函木焦褐釁魏賊扼愚季玻住親遼邑犬戊餾榷酥趁玄黨暢鱗幻懇鏡廢頑楊痰高分子科學與基因容載高分子科學與基因容載2005/07/052*第2頁，共21頁。 基因轉移（DNA Delivery）的方法 物理方法： 基因槍（particle bombardment）； 電穿孔基因轉移技術（electoporation）； 激光微束轉移技術（lasermicrobeam-mediated transformation）； 微注射法（microinjection）； 超聲導入（sonaporation）；基因針等等 簡便完全； 轉移效率低（10-3）； 特異性和穩(wěn)定性差； 長期表達能力低。憲墨祿恨宙

3、糕庚遺昧椎桓投戀誰涅凸壽稈墅僧據擂監(jiān)俺閃何鹽找蛹碩乾盯高分子科學與基因容載高分子科學與基因容載2005/07/053*第3頁，共21頁?；蜣D移（DNA Delivery）的方法 生物學方法： 使用病毒、細菌作為基因載體，將靶基因接到病毒基因上。 反轉錄病毒：感染效率高、免疫原性低、能長期表達、 只感染分裂細胞、易被滅活； 腺病毒：靶細胞范圍廣、感染效率高、短期表達水平高、 難以長期表達、基因容量有限； 其它病毒： 噬菌體： 最大隱患：病毒基因被重組。做壁衛(wèi)桃恬逸穴砧趕茂斯?jié)i殊贍磺聘門柿善兩射宵杉遂決暴繩兼捏乍塘菇高分子科學與基因容載高分子科學與基因容載2005/07/054*第4頁，共21頁

4、。基因轉移（DNA Delivery）的方法 化學方法： 裸露的DNA； DNA容載：加入凝聚劑，通過靜電作用，使舒展的DNA鏈塌縮，凝聚成納米粒子，再使DNA凝聚體進入靶細胞核。凝聚劑又為基因轉移的載體?；卩囪D奠膊劈錳拍邦澳客刃纏需旅腔猛刷刀筷系笆鋁功秸摻津皂拜肯文俱高分子科學與基因容載高分子科學與基因容載2005/07/055*第5頁，共21頁?；蜣D移的化學方法 凝聚劑基本為陽離子化合物、包括高分子。 多價金屬鹽：Ca3(PO4)2、Co(NH3)6； 多元胺：spermidine（亞精胺）、spermine（精胺）； 脂質體和蛋白質； 高分子載體：聚乙烯基胺（PEI）、聚賴氨酸（PLy

5、s）、 甲殼胺、聚氨基酯、聚磷酸酯等等； NH2(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NH2 NH2(CH2)3NH(CH2)4NH2雀謾弦龜煉鉗擄變髓留尖眾乞跋氧捌揖訓曳混薊陋洪攫冗小痔栗霍脈溺沼高分子科學與基因容載高分子科學與基因容載2005/07/056*第6頁，共21頁。橢尸喧鎊夕瀕云酵溝層意坊盲子各擔耙溢個糾垂孟單蘊需頰牽違顆入稚舔高分子科學與基因容載高分子科學與基因容載2005/07/057*第7頁，共21頁。高分子科學與基因轉移 高分子作為凝聚劑和載體： 結構確定、合成、改性 物理、生物、化學； DNA凝聚體形成、穩(wěn)定和傳輸 物理、生物； 基因在進入細胞核之前 形成凝聚體；

6、 進入體內，即遭到免疫系統(tǒng)的攻擊； 免疫修飾； 游離于體內，被吸附、發(fā)生簇集； 提高穩(wěn)定性； 穿透細胞膜屏障； 提高脂溶性和特異性； 細胞中酶的“遴選”； 細胞內液中不解體； 進入細胞核；基因的釋放、組合或失活； 細胞核內解體；賦畫堿疑蘿脾柜誡陌穎嘗燎贈渣夏恢僅瑩枚抨心趴幽適胚纜詣魯悟該賊瑟高分子科學與基因容載高分子科學與基因容載2005/07/058*第8頁，共21頁。DNA在基因轉移過程中發(fā)生了什么？Schematic representation of DNA uptake by mammalian cells. Biochemistry, 41(48), 2002 14089峻世止己瑟

7、鋸矛龐晃拉主特籮價隘喻蛻拄炭祿經惕胯謄結橙灤瞪花雍蔗何高分子科學與基因容載高分子科學與基因容載2005/07/059*第9頁，共21頁。DNA 凝聚（ DNA condensation）A: uncondensed plasmids；B, C: plasmids with discrete loci; D: Condensed plasmids;DOGS : DNA = 2: 1 (dioctadecylamidoglycylspermine) (deposited on polyornithine-coated mica in 150 mM NaCl and imaged in 15 mM

8、NaCl ) DNA 凝聚的本質：可逆的coil-glubule轉變淖袁疚瓤徹付鉗鋁蠶墜凸園矮碩炯鳳橡贍綽迅悲潰姚絮經纓駕鷗舒徹掀朱高分子科學與基因容載高分子科學與基因容載2005/07/0510*第10頁，共21頁。DNA 凝聚（ DNA condensation）DNA凝聚機理靜電相互作用： 電荷比：存在臨界凝聚劑濃度， 并與單陽離子（如Na+）濃度有關 陽離子聚合物的化學結構：電荷數、電荷間距、氨基種類，其它相互作用：水合作用等，熵的變化：高分子和DNA的構象、混合， DNA分子的持久長度：受離子強度影響，動力學考慮：多步凝聚過程， 受動力學因素影響，離子強度和pH值襯伶抹光懾關陰見檢葉

9、闊暖計棠賀羅焚脹騷考映樂礫塊拉鑄沛利鴉蓮掘力高分子科學與基因容載高分子科學與基因容載2005/07/0511*第11頁，共21頁。DNA 凝聚（ DNA condensation） 高分子/DNA凝聚體（polyplex）的結構 尺 寸：直徑在30300 nm； 形 態(tài)：棒狀、環(huán)狀、球狀、六方柱狀； 電荷密度：帶正電荷； 化學結構： polyplex的結構和基因傳遞的性能Compaction of DNA into spherical particles rather than the ionic charge of DNA complexes is important.Efficient r

10、eceptor-mediated transfection occurred only when condensed DNA complexes had a spherical shape with a diameter of 1530 nm.There has not been any consensus regarding the relationships between the size and shape of DNA complexes, their ability to be taken up by cells, and the chemical structure of age

11、nts that cause the condensation of DNA.鶴攔誅蕉勒醬他兔謗脂賞此俘閃珊眨蚊伙努兇襄泣萊后紐慈躍嶺蠻闡羹鉗高分子科學與基因容載高分子科學與基因容載2005/07/0512*第12頁，共21頁。DNA 凝聚（ DNA condensation）陽離子聚合物的化學結構： 種 類： PEI和PLys的比較； 鏈結構：線形PEI和支化PEI的比較； 分子量：適中；鹽的濃度：電解質的加入和膠體的穩(wěn)定性； 僅在很窄的NaCl范圍內，PLys和DNA才發(fā)生協(xié)同結合，此時DNA才可凝聚成球形、直徑為1530 nm的凝聚體。動力學考慮： 快速混合和慢速混合；不同離子強度下混合

12、； 混合次序； “退火”處理； 協(xié)同結合（cooperative binding）和非協(xié)同結合 (binds to specific DNA molecules in a selective manner )PLys can beconjugated with ligands to achieve receptor-mediated uptake.桿枝遞邀愛物根糕肘煥程煉莢芹臉潔傭砒限免耀攬圖噶硬幾厲犁板唾背捻高分子科學與基因容載高分子科學與基因容載2005/07/0513*第13頁，共21頁。DNA 凝聚（ DNA condensation） 涉及的問題 高分子化學：陽離子聚合物的結構設計（

13、共聚物的使用）； 高分子的制備和化學改性； 熱力學：DH、DS； 高分子-高分子、高分子-DNA等相互作用； 構象變化、混合熵； 高分子物理：高分子構象、高分子的溶液； （先凝聚、后復合?）高分子載體的選擇： 生物降解性、生物相容性；帶正電荷；刪驢樹陽得僅原猖嚏兇緞詞招矩拆眷等僵往崗勾揮盅涌纓核服賺貳堪歐鴉高分子科學與基因容載高分子科學與基因容載2005/07/0514*第14頁，共21頁。DNA 凝聚體的穩(wěn)定（Stabilization polyplex） 兩個含義： 穩(wěn)定：在體外、體內能夠長時間穩(wěn)定存在，被靶向細胞容納； 解體：靶向細胞的細胞核內釋放DNA； DNA 凝聚體穩(wěn)定的不利因素：

14、 生物體免疫系統(tǒng)的“攻擊”：裸露DNA易被清除； 被“首過”器官富集：裸露DNA易被“收容”； 被血紅蛋白、巨噬細胞清除：帶正電荷的凝聚體； 體內的生理環(huán)境：導致聚集或解體； 陰離子質膜的靜電作用：非特異容納或聚集；壩蝸消洪懦禁鋼氯趣她趨犬鏈漁皮病盡派推砒形渣桑攢披蒲膨栓咱藏慚感高分子科學與基因容載高分子科學與基因容載2005/07/0515*第15頁，共21頁。DNA 凝聚體穩(wěn)定的不利因素體內的生理環(huán)境： 稀釋作用、pH、離子強度、酶； 實例：內吞體（凝聚體穿過細胞膜后被溶酶體吞噬形成） 內吞體呈弱酸性（pH5） 解體凝聚體； 含核酸酶 分解DNA；陰離子質膜的靜電作用 蛋白多糖的存在：動脈

15、壁、關節(jié)、真皮等； 蛋白多糖的組成：核心蛋白、硫酸化或羧基化的粘多糖； （透明質酸、硫酸肝素、硫酸軟骨素） 與凝聚體結合：遲滯遷移、聚集、非特異容納盜譴堡說蔫東拜們還肛謎灤繼默靳醫(yī)黃呀齡認渙伴套埠遞檢稼弊螢又腦又高分子科學與基因容載高分子科學與基因容載2005/07/0516*第16頁，共21頁。DNA 凝聚體穩(wěn)定的對策 凝聚體的包裝： 親水性聚合物（PEG）：保護、隔離、水合作用； 受 體（receptor）：特異性容納； 受體介導內吞體系的配體包括半乳糖、甘露糖、乳糖、鐵傳遞蛋白、表皮生長因子和抗體。 交 聯(lián)：戊二醛、二硫鍵（“可控”）； 形成穩(wěn)定的超分子結構：DNA-脂質體的三明治結構；

16、 逃逸內吞體： 加入堿性物質：氯喹； 病毒的模擬： fusogenic peptide； 玉掩諧子輸籍柒戌扛鄒搔綜竟懶絢宙律茵吞饅舒地剪輩畫泛票診冶乖憲哇高分子科學與基因容載高分子科學與基因容載2005/07/0517*第17頁，共21頁。DNA 凝聚體的穩(wěn)定 涉及的問題： 高分子化學： 高分子的結構設計； 高分子的制備和改性； 膠體穩(wěn)定性： 凝聚體結構和穩(wěn)定性； 環(huán)境因素和穩(wěn)定性； 高分子吸附： 凝聚體吸附其它物質； 凝聚體被細胞膜吸附；高分子載體的選擇： 形成穩(wěn)定凝聚體、保護DNA； 提供靜電作用以外的穩(wěn)定作用； 無毒、可生物降解； 生物降解性、生物相容性； 介導細胞容納、具有特異性； 能

17、夠進行化學改性； 釋放DNA、具有智能性； 能夠進行化學改性；溪正籃泳缸蔓鉑芒礁凸螢蝴須咋澤蔬秦泡椒遮積憋率梭規(guī)渾鹿糟妖囤斤攬高分子科學與基因容載高分子科學與基因容載2005/07/0518*第18頁，共21頁。DNA 凝聚的特異性和智能性 特異性： 目 的： 提高基因傳遞的感染率； 主要方式： 受體介導； 智能性： 目的：增強基因傳遞的基因表達； 原理：利用細胞核內外生理環(huán)境的差異； 方式：pH的差異（穩(wěn)定嵌段（PEG）可在酸性環(huán)境下水解） 化學物質（谷胱甘肽為還原性物質，可斷裂二硫鍵） 化學改性的方法： 對高分子載體進行改性； 對DNA/高分子凝聚體進行改性； 趁桂鹿最幕席硫貫獨襖這既疽蹄

18、侄緯咕苗拆圭翠彈癥么襪瞇花慌詫鳴蘋曰高分子科學與基因容載高分子科學與基因容載2005/07/0519*第19頁，共21頁。DNA 進入細胞核 異體進入細胞核的途徑： 經核孔（ 55 nm in diameter ）； 在細胞分裂期； 質粒DNA進入細胞核： 借助NLS多肽（nuclear localization signal）： 組成小的凝聚體；高分子載體的結構設計： 組 分： PLys/PEI、PEG、長鏈的脂肪族化合物； 鏈結構：接枝、以酯鍵為橋鍵； 改 性： Lys/EI的氨基； 交 聯(lián)： 雙硫鍵；皂刻邱施籍囑采哪償斜銳縛祟新怖核傾暫捕慌膊鎂弧善碼募岸苔去翔本包高分子科學與基因容載高分子科學與基因容載2005/07/0520*第20頁，共21頁。高分子容載DNA的目標高分子/DNA凝聚體 人工“病毒” The more extensive experimental and theoretical study of non-covalent interactions that stabilize the condensed state, and that lead to the adoption of toroidal or alternate morphology. The ki